C. Metode Penelitian
2. Proses Ekstraksi Untuk Memperoleh Hasil Ekstrak Heksana dan Etanol
Optimasi proses ekstraksi biji kamandrah merupakan bagian tahapan penelitian dasar yang nantinya digunakan dalam melakukan ekstraksi dan perancangan proses. Ekstraksi dilakukan menggunakan metode Maserasi. Ekstraksi bertujuan memisahkan komponen-komponen terlarut dari campuran komponen tidak terlarut dengan menggunakan pelarut yang sesuai Ekstraksi dengan pelarut dilakukan dengan melarutkan bahan ke dalam suatu pelarut organik, sehingga komponen pembentuk bahan akan terlarut ke dalam pelarut. Menurut Harborne (1987) senyawa polar diekstraksi menggunakan pelarut polar dan senyawa non polar dapat diektraksi menggunakan senyawa non polar. Pada penelitian ini pelarut polar menggunakan etanol dan pelarut non polar menggunakan heksana.
Penentuan faktor yang berpengaruh dengan tujuan menentukan apakah faktor yang dicoba berpengaruh secara kualitatif terhadap rendemen ekstrak yang diperoleh. Pelaksanaan penelitian serbuk biji kamandrah direndam dalam labu erlemeyer menggunakan pelarut heksana dan etanol pada waktu pengamatan yang dilakukan sesuai dengan perlakuan empat sampai delapan hari, sedangkan nisbah bahan/pelarut 1/3 sampai 1/7. Ekstrak kasar serbuk biji kamandrah disaring menggunakan kertas saring, filtrat yang diperoleh selanjutnya dipekatkan dengan penguapan rotavapor sehingga diperoleh ekstrak yang bebas pelarut. Hasil ekstrak yang diperoleh digunakan untuk uji selanjutnya.
Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan dua faktor yang diulang sebanyak dua kali. Masing-masing faktor tersebut terdiri dari beberapa taraf sebagai berikut : Faktor I terdiri atas waktu perendamen : A1 = 4 hari, A2 = 6 hari, dan A3 = 8 hari. Faktor II terdiri atas nisbah bahan/pelarut : B1 = 1/3, B2 = 1/5 dan B3 = 1/7.
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan model matematika (Sudjana, 1994) sebagai berikut :
Yijk = µ + Ai + Bj + (AB)ij + ε(ijk) dengan :
Yijk = peubah yang diukur
µ = rata-rata umum
Ai = pengaruh faktor A (waktu perendaman) ke-i, (i = 1, 2) Bj = pengaruh faktor B (nisbah bahan/pelarut) ke-j (j=1,2)
(AB)ij = pengaruh interaksi faktor A pada taraf ke-i dan faktor B pada taraf ke-j.
ε(ijkl) = galat percobaan
Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan Analisis Sidik Ragam (ANOVA) untuk melihat pengaruh antar perlakuan.
a. Optimasi Proses Ekstrak Heksana
Optimasi proses ekstraksi dilakukan terhadap peubah optimum yang meliputi waktu Maserasi dan nisbah bahan/pelarut yang dapat memaksimalkan hasil ekstrak biji kamandrah (Croton tiglium L). Pencarian peubah optimum ini menggunakan Response Surface Method (RSM) (Box et al., 1978). Tujuan metode ini adalah untuk melihat pola kecenderungan respon (rendemen) sebagai hasil interaksi dari peubah bebas.
Optimasi proses ekstraksi menggunakan pelarut heksana dilakukan terhadap waktu maserasi dan nisbah bahan/pelarut untuk memperoleh hasil ekstrak yang optimal. Peubah yang diamati adalah hasil ekstrak (g) yang diperoleh dari hasil proses ekstraksi yang dimulai dari maserasi 5 g serbuk biji kamandrah pada waktu dan rasio bahan/pelarut sesuai dengan perlakuan, kemudian disaring dengan kertas saring. Ekstrak kasar yang diperoleh dari hasil penyaringan di pisahkan menggunakan rotavapor, sehingga diperoleh ekstrak kental.
Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan dan analisis hasil optimasi menggunakan metode Central Composite Design (Rancangan Komposit Pusat) dan Response Surface Methode (RSM). Menurut Box dan Draper (1987) ada beberapa langkah-langkah yang
digunakan dalam penggunaan metode Response Surface Methode (RSM) adalah (a)
menentukan peubah respon dan peubah bebas yang berpengaruh terhadap peubah respon dan menentukan range dari masing-masing peubah bebas, (b) membuat model persamaan pada orde pertama dan uji kesahihan model dengan mengetahui ada tidaknya lack of fit dengan menggunakan analisis keragaman dan dilanjutkan dengan membuat rancangan pada percobaan orde kedua, (c) membuat dan menguji model orde kedua, (d) pemeriksaan dan pengujian asumsi terhadap model, (e) menentukan kondisi
optimum dari model yang sesuai, (f) menganalisa kanonik untuk mempermudah penggambaran kontur dari permukaan respon.
Dua peubah berpengaruh yang dicoba dalam penelitian ini yaitu (1) waktu maserasi (X1), dan (2) nisbah bahan/pelarut (X2). Peubah, kode dan taraf kode yang dicoba pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Peubah, Kode dan Taraf Kode pada Proses Maserasi Menggunakan Pelarut Heksana
Taraf Kode
No. Peubah Kode Rendah
(-1) Sedang (0) Tinggi (+1) 1. Waktu Maserasi (hr) X1 4 6 8 2. Nisbah Bahan/pelarut (g) X2 1:3 1:5 1:7
Pada tahap pemilihan faktor yang berpengaruh dilakukan percobaan dengan
rancangan titik faktorial dua faktor dan titik pusat sebanyak dua Ulangan. Rancangan percobaan untuk pendugaan model linier terdiri dari empat unit percobaan faktorial dan
empat unit percobaan titik pusat (center points). Pembentukan model kuadratik
dilanjutkan percobaan rancangan titik bintang (star point) dengan faktor dapat diputar (α) sebesar ± 2k/4 dimana k adalah jumlah faktor. Adapun matrik rancangan percobaan dengan dua faktor tersebut disajikan pada Tabel 5.
Model persamaan kondisi optimum respon hasil ekstrak heksana terhadap waktu Maserasi dan nisbah bahan/pelarut adalah sebagai berikut :
Y = β0 + β1X1 + β2X2 + β11X12 + β22X22 + β12X1X2 + ε
dengan,
Y = peubah respon
X1 = peubah bebas waktu Maserasi
X2 = peubah bebas nisbah bahan/pelarut heksana
ε = peubah galat
Data yang diperoleh dari hasil percobaan, dianalisis menggunakan perangkat
mendapatkan bentuk permukaan respon dan gambar garis bentuk dari hasil ekstrak yang diperoleh.
Tabel 5. Matrik Rancangan Percobaan 2 Faktor Respon Hasil Ekstrak Heksana Terhadap Waktu Maserasi dan Nisbah Bahan/pelarut
Variabel Kode Variabel Asli
Rancangan Percobaan No. X1 (hr) X2 (g) X1 (hr) X2 (g) Hasil Ekstrak (g) 1 -1 -1 4 1:3 2 1 -1 8 1:3 3 -1 1 4 1:7 Titik Faktorial 4 1 1 8 1:5 5 0 0 6 1:5 6 0 0 6 1:5 7 0 0 6 1:5 Titik Pusat 8 0 0 6 1:5 9 -1.414 0 3.172 1:5 10 1.414 0 8.828 1:5 11 0 -1.414 6 7.828 Titik Bintang 12 0 1.414 6 2.172
b. Optimasi Proses Ekstrak Etanol
Optimasi proses ekstraksi menggunakan pelarut etanol dilakukan terhadap waktu Maserasi dan nisbah bahan/pelarut untuk memperoleh hasil ekstrak yang optimal. Peubah yang diamati adalah hasil ekstrak (g) yang diperoleh dari hasil proses ekstraksi yang dimulai dari Maserasi 5 g serbuk biji kamandrah pada waktu dan nisbah bahan/pelarut sesuai dengan perlakuan, kemudian disaring dengan kertas saring. Ekstrak kasar yang diperoleh dari hasil penyaringan di pisahkan menggunakan rotavapor pada suhu 60oC selama 45 menit, sehingga diperoleh ekstrak kental.
Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan dan analisis hasil optimasi menggunakan metode Central Composite Design (Rancangan Komposit Pusat) dan Response Surface Methode
(RSM). Menurut Box dan Draper (1987) ada beberapa langkah-langkah yang
digunakan dalam penggunaan metode Response Surface Methode (RSM) adalah (a)
menentukan peubah respon dan peubah bebas yang berpengaruh terhadap peubah respon dan menentukan range dari masing-masing variabel bebas, (b) membuat model persamaan pada orde pertama dan uji kesahihan model dengan mengetahui ada tidaknya lack of fit dengan menggunakan analisis keragaman dan dilanjutkan dengan membuat rancangan pada percobaan orde kedua, (c) membuat dan menguji model orde kedua, (d) pemeriksaan dan pengujian asumsi terhadap model, (e) menentukan kondisi optimum dari model yang sesuai, (f) menganalisa kanonik untuk mempermudah penggambaran kontur dari permukaan respon.
Dua peubah berpengaruh yang dicoba dalam penelitian ini yaitu (1) waktu maserasi (X1), dan (2) nisbah bahan/pelarut (X2). Peubah, kode dan taraf kode yang dicoba pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6. Peubah, Kode dan Taraf Kode pada Proses Maserasi Menggunakan Pelarut Etanol
Taraf Kode
No. Peubah Kode
Rendah (-1) Sedang (0) Tinggi (+1) 1. Waktu Maserasi (hr) X1 4 6 8 2. Nisbah Bahan/pelarut (g) X2 1:3 1:5 1:7
Pada tahap pemilihan faktor yang berpengaruh dilakukan percobaan dengan
rancangan titik faktorial dua faktor dan titik pusat sebanyak dua ulangan. Rancangan percobaan untuk pendugaan model linier terdiri dari empat unit percobaan faktorial dan
empat unit percobaan titik pusat (center points). Pembentukan model kuadratik
dilanjutkan percobaan rancangan titik bintang (star point) dengan faktor dapat diputar (α) sebesar ± 2k/4 dengan k adalah jumlah faktor. Adapun matrik rancangan percobaan dengan dua faktor tersebut disajikan pada Tabel 7.
Tabel 7. Rancangan Percobaan 2 Faktor Respon Hasil Ekstrak Etanol Terhadap Waktu Maserasi dan Nisbah Bahan/pelarut
Peubah Kode Peubah Asli
Rancangan Percobaan No. X1 (hr) X2 (g) X1 (hr) X2 (g) Hasil Ekstrak (g) 1 -1 -1 4 1:3 2 1 -1 8 1:3 3 -1 1 4 1:7 Titik Faktorial 4 1 1 8 1:5 5 0 0 6 1:5 6 0 0 6 1:5 7 0 0 6 1:5 Titik Pusat 8 0 0 6 1:5 9 -1.414 0 3.172 1:5 10 1.414 0 8.828 1:5 11 0 -1.414 6 7.828 Titik Bintang 12 0 1.414 6 2.172
Model persamaan kondisi optimum respon hasil ekstrak etanol terhadap waktu Maserasi dan nisbah bahan/pelarut adalah sebagai berikut :
Y = β0 + β1X1 + β2X2 + β11X12 + β22X22 + β12X1X2 + ε
dengan,
Y = peubah respon
X1 = peubah bebas waktu maserasi
X2 = peubah bebas nisbah bahan/pelarut etanol
ε = komponen galat
Data yang diperoleh dari hasil percobaan, dianalisis menggunakan perangkat
mendapatkan bentuk permukaan respon dan gambar garis bentuk dari hasil ekstrak yang diperoleh.
3. Identifikasi dan Karakterisasi Senyawa Aktif Ekstrak Biji Kamandrah Sebagai