9 BAB II
METODE PENELITIAN
A. Kategori dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk kategori kuantitatif eksperimental dengan desain penelitian posttest only with control.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasionalnya
Variabel bebas : Mencit diberi perlakuan dengan pemberian kontrol negatif (CMC
Na 0,5%), kontrol positif (Sertralin 6,5 mg/ kgBB), ekstrak air
rimpang kunyit 560 mg/ kgBB, ekstrak aseton kulit pisang (200
mg/ kgBB) dan kombinasi ekstrak air rimpang kunyit-aseton kulit
pisang muda (760 mg/ kgBB, rasio 1:1).
Variabel terikat : Durasi immobility time dan durasi climbing serta durasi aktivitas lokomotor (rearing, grooming, dan aktivitas central square). Variabel terkontrol : 1. Sampel : pisang ambon usia ±3 bulan dan rimpang kunyit
usia tua ±10 bulan
2. Hewan uji : mencit putih jantan galur Swiss ± 3 bulan
3. Induksi stres kronis ringan (CMS) selama 5 minggu:
mengguncangkan kadang, mengotorkan kandang,
membasahi serbuk gergaji, mengurangi serbuk gergaji
inversi siklus gelap/terang, mempuasakan mencit 12 jam,
dan memberikan suara predator.
C. Alat dan Bahan
1. Alat
dryer untuk liofilisasi (Alpha 1-2 LO plus) dan alat pemekatan ekstrak (rotary evaporator (Stuart).
2. Bahan
Rimpang kunyit 2 kg (±10 bulan) dan kulit pisang muda berumur ±3 bulansebanyak 600 g (bahan uji ekstrak), mencit jantan galur Swiss (berumur 3 bulan), aquadest, CMC Na 0,5%, obat Sertraline 50 mg, bahan-bahan fase gerak uji KLT (aquadest (teknis), metanol p.a, butanol p.a, asam asetat glasial p.a, etil asetat p.a, ammonia 28% p.a, natrium hipoklorit, metanol p.a), aseton 70% (teknis), serbuk magnesium p.a dan NaCl p.a (seperangkat bahan kimia untuk uji flavonoid), reagen Wagner dan reagen Hager (seperangkat bahan kimia untuk uji alkaloid).
D. Tempat Penelitian
Laboratorium Farmakognosi dan Farmakologi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.
E. Jalannya Penelitian
1. Pembuatan Ekstrak dan Identifikasi
a. Pengambilan Sampel
Rimpang kunyit diperoleh dari kota Solo, Jawa Tengah dan pisang ambon muda diperoleh dari kota Pemalang, Jawa tengah.
b. Determinasi
Determinasi tanaman kunyit dan pisang ambon muda dilakukan di Fakultas Biologi UMS.
c. Ekstraksi
1) Ekstraksi Rimpang Kunyit
dibawah vakum. Sampel yang beku akan menjadi uap melalui proses sublimasi air pada suhu dan tekanan dibawah triple point seperti 4,579 mmHg dan 0,0099oC (Nireesha et al., 2013).
2) Ekstraksi Kulit Pisang
Ekstraksi kulit pisang ambon muda menggunakan metode maserasi. Kulit pisang ambon ditimbang 600 g lalu dirajang, kemudian dipanaskan 2 menit dengan air mendidih yang dijaga pada suhu 80oC. Kulit pisang diambil dan diblender 2x dengan aseton 70% q.s. Hasil kulit pisang yang telah diblender, disentrifugasi 6000 rpm selama 10 menit. Maserat pada lapisan atas diambil lalu dipekatkan dengan rotatory evaporator pada suhu 50oC hingga diperoleh ekstrak pekat (Tee and Hassan, 2011).
d. Uji Kualitatif Golongan Metabolit Sekunder: Flavonoid
(Curcumin-Rimpang Kunyit) dan Asam Amino/ Alkaloid Indol (Triptofan/
Serotonin-Kulit Pisang Muda)
Tabel 1. Uji kualitatif pada sampel ekstrak air rimpang kunyit dan ekstrak aseton kulit pisang Sampel Uji metabolit sekunder Metode
uji Cara kerja
Perubahan warna yang
diamati Ekstrak air rimpang kunyit Flavonoid Shinoda
2 mL larutan sampel
dimasukkan serbuk
magnesium dan diteteskan
HCl secara perlahan.
Merah tua
(Mukherjee, 2002)
Alkali 2 mL larutan sampel ditambah NaCl Kuning (Mukherjee, 2002) Ekstrak aseton kulit pisang Asam amino/ alkaloid indol
Hager 1 mL ekstrak diteteskan reagen Hager
Endapan kuning
(Sawant and Godghate,
2013)
Wagner 1 mL ekstrak diteteskan reagen Wagner
Endapan merah
kecoklatan
(Sawant and Godghate,
e. Uji KLT Flavonoid dan Alkaloid/ Asam Amino
1) Uji KLT Flavonoid
Fase gerak yang digunakan yaitu campuran kloroform : etanol : asam asetat glacial (94 : 5: 1). Totolan ekstrak yang telah terelusi fase gerak, dilihat fluorosensi spot berwarna hijau kekuningan pada UV 366 nm (Yusuf, 2015). 2) Uji KLT Alkaloid/ Asam Amino
Fase gerak menggunakan campuran pelarut metanol : 28% ammonia (100 : 1,5). Spot sampel di KLT yang telah dielusi, disemprot dengan pereaksi semprot campuran 1,5 g Sodium Hipoklorit dalam 0,1 M NaOH lalu keringkan dan dilihat dibawah spektrofotometer 366 nm. Apabila warna spot fluoresensi vivid blue
maka sampel mengandung asam amino triptofan, jika berwarna coklat kemerahan atau jingga maka sampel mengandung serotonin (Kato et al., 2007).
2. Uji Pendahuluan
3. Induksi Stres Kronis Ringan (CMS)
Masing-masing kelompok hewan uji dipapar stres selama 5 minggu. Hewan uji diberikan 2-3 jenis stresor yang berbeda setiap harinya dalam 1 minggu yang disajikan pada tabel 1 (Sun et al., 2013).
Tabel 2. Jadwal paparan stres
Jenis Stressor Hari ke-
1 2 3 4 5 6 7
Puasa 12 jam
Suara predator
Guncangan kandang 15
menit
Mengotorkan kandang
Menggunakan serbuk
gergaji basah
Pergantian siklus
gelap-terang secara mendadak
Mengurangi serbuk
Pemberian stressor dilakukan dengan cara berikut:
1. Mencit dipuasakan 12 jam dengan cara: Selama 12 jam 2x seminggu (dari jam 6 pagi-jam 6 sore) mencit tidak diberi makan saja.
2. Suara predator: Level suara/ kebisingan yang digunakan sebesar 85 dB selama 4 jam (jam 10.00-14.00) (Jung et al., 2014). Pengukuran level suara predator (anjing dan kucing) menggunakan aplikasi Sound Meter (Google Play-Android).
3. Guncangan pada kandang: Setiap kelompok mencit dimasukkan dalam kandang kosong secara bergantian. Kandang ditutup dengan ram kawat. Kandang digoyangkan secara memutar dari kanan ke kiri (15 kali/ menit). 4. Mengotorkan kandang: Kandang yang berisi serbuk gergaji, diberi pengotor
seperti sampah potongan plastik, taburan tanah/ pasir, lumpur (100 mL) dan taburan kerikil. Masing-masing lima kelompok mencit ditempatkan pada tiap kandang yang kotor selama 3 jam.
5. Menggunakan serbuk gergaji basah: Sebanyak 5 kandang mencit diberi serbuk gergaji yang dibasahi seluruhnya dengan 400 mL air. Setiap kelompok mencit dimasukkan kedalam masing-masing kandang yang berisi serbuk gergaji basah dan dibiarkan selama 3 jam.
6. Pergantian siklus gelap terang: Setiap kelompok mencit berada pada kandang berisi serbuk gergaji bersih. Pagi harinya seluruh kelompok mencit ditempatkan di bawah sinar matahari selama 5 menit. Kandang ditutup kain satin hitam yang diberi lubang udara selama 11 jam dari jam 6 pagi-jam 5 sore. Menjelang malam, ditempatkan seluruh kelompok mencit pada ruangan gelap selama 5 menit, kemudian dari jam 6 petang- jam 6 pagi seluruh kandang ditempatkan di ruangan terang (sinar lampu kekuatan 18 watt). 7. Mengurangi serbuk gergaji: Setiap kelompok mencit ditempatkan pada 5
kandang yang berisi serbuk gergaji 200 g (berat serbuk gergaji standar untuk mencit yaitu 236,3 g (Babu et al. 2013)), lalu dibiarkan selama 3 jam.
3. Pengujian Ekstrak Kombinasi dan Ekstrak Tunggal Kunyit dan Kulit
Uji metode stressor (CMS) digunakan 5 ekor mencit. Uji perlakuan ekstrak, menggunakan 25 ekor mencit yang sudah stres dibagi kedalam 5 kelompok, yaitu:
1. Kontrol negatif : CMC Na 0,5%.
2. Kontrol positif : obat Sertraline dengan dosis 6,5 mg/ kgBB mencit p.o.
3. Ekstrak air rimpang
kunyit :
ekstrak air rimpang kunyit dengan dosis 560 mg/kgBB
p.o.
4. Ekstrak aseton kulit
pisang :
ekstrak aseton kulit pisang dengan dosis 200 mg/kgBB
p.o.
5. Ekstrak kombinasi air
rimpang kunyit-aseton
kulit pisang :
ekstrak kombinasi ekstrak air rimpang kunyit-aseton
kulit pisang.
4. Metode Uji Antidepresan
a. Tail Suspension Test (TST)
Batang panjang (50 cm) diletakkan secara horizontal diatas meja. Kemudian, ekor mencit digantung menggunakan alat perekat antar ekor dan ujung kayu (jarak 1 cm). Uji ini dilakukan selama 60 menit setelah dosis terakhir diberikan dan dipantau pergerakan mencit atau immobility time (gambar 2) menggunakan handycam (Buccafusco, 2009).
b. Open Field Test (OFT)
Mencit dimasukan ke dalam kotak tanpa tutup dan diamati selama 5 menit sebelum diberi perlakuan sebagai data pre-test, kemudian mencit diberi perlakuan selama seminggu dan 45 menit setelah dosis terakhir diberikan. Mencit diuji aktivitas centre square, rearing, dan grooming (Anas et al., 2013). Keadaan mencit normal dan stres saat di kotak OFT ditunjukkan pada gambar 1 dan gambar 2.
c. Forced Swimming Test (FST)
kepalanya agar tetap diatas air (gambar 2). Mobility mencit berupa renang dan memanjat (Buccafusco, 2009).
Gambar 1. Keadaan mencit normal pada uji OFT. (a) mencit grooming, (b) mencit rearing, dan (c) mencit melintasi central square
(a) (b) (c) (d)
Gambar 2. Keadaan mencit ketika stres dan depresi. (a) Immobility time TST. (b) Keadaan mencit yang diinduksi CMS berdiam diri di sudut pojok kotak OFT. (c) Keadaan mencit memanjat jaring pada uji FST-Climbing. (d) Keadaan mencit terapung mempertahankan kepala berada pada atas air yang menunjukkan immobility time.
5. Analisis Data
Uji T pada data pretest-posttest (basal sebelum induksi CMS dan basal setelah induksi CMS) untuk menguji hasil model stressor CMS 5 minggu. Hasil data posttest pengukuran depresi/ antidepresan: durasi immobility time (IT) pada uji TST dan FST, climbing (FST), serta peningkatan rearing, grooming, dan melewati central square (CS) pada uji OFT kombinasi ekstrak kunyit-kulit pisang pada posttest hari ke-7 dibandingkan dengan posttest hari ke-7 ekstrak tunggalnya. Pengambilan kesimpulan untuk melihat perbedaan hasil antar kelompok mencit pada setiap pengukuran antidepresan diolah menggunakan SPSS MANOVA-LSD dengan taraf kepercayaan 95%.
[image:7.595.113.516.312.463.2]
