Lampiran 3. Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak Pekat Kloroform Tumbuhan Bunga Kupu-kupu Rambat (Bauhinia Kockiana Lour) Sebelum Kromatografi Kolom
E : Ekstrak pekat lapisan kloroform daun tumbuhan bauhinia kockiana
Lampiran 4. Kromatografi Lapis Tipis ekstrak daun tumbuhan Bunga Kupu-kupu Rambat (Bauhinia kockiana Lour) setelah penggabungan fraksi
E
E
E
E
E
V
IV
I
II
III
Keterangan
Fase diam : kieselgel
E : Ekstrak pekat daun tumbuhan bauhinia kockiana setelah kolom kromatografi
No Fraksi Jumlah Noda Rf
I 21-35 3
0,67 0,36 0,09
II 36-51 3
0,69 0,56 0,37
III 52-68 2 0,36
0,18
IV 69-91 2 0,13
Lampiran 5. Kromatografi Lapis TipisSetelah Kromatografi Kolom yang Kedua
I
E
II
E
Keterangan
Fase diam : Kieselgel 60 F254
E : Ekstrak etilasetat kristal hasil kromatografi kolom yang kedua
No Fase Gerak Jumlah Noda Rf
I n-heksana : etilasetat 60:40 v/v 2 0,44
0,22
Lampiran 6. Kromatografi Lapis Tipis senyawa murni hasil isolasi
I
E
II
E
Keterangan
Fase diam : Kieselgel 60 F254
E : Ekstrak etilasetat kristal murni hasil isolasi
No Fase Gerak Jumlah Noda Rf
I n-heksana : etilasetat 60:40 v/v 1 0,29
Lampiran 10. Ekspansi Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi pada δ=3,59-3,91
Lampiran 11. Spektrum 1H-NMR Senyawa Pembanding
DAFTAR PUSTAKA
Andersen, M., Markham, K.R. 2006. Flavonoids. Taylor & Francis Group. New York Cannell, R.J. 1998. Natural Product Isolation. Humana Press Inc. New Jersey
Chew, Y. L., Chan,E.W.L. Tan,P.L. Lim,Y.Y. Stanslas,J. Gog,J.K. 2011. Assessment of Phytochemical Content, Polyphenolic Composition, Antioxidant and Antibacterial Activities of Leguminosae Medicinal Plants in Peninsular Malaysia. Malasya School of Science. Malaysia
Chew,Y.L., Lim,Y.Y. Stanslas,J. Ea,G.C.L. Goh,J.K. 2014. Bioactivity-guided Isolation Of Anticancer Agents From Bauhinia Kockiana Korth.UCSI University Kuala Lumpur. Malaysia
Harbone, J. B. 1996. Metoda Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Terbitan ke-2. Terjemahan Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. ITB. Bandung
Harmita. 2009. Analisis Fisikokimia. Volume 1 dan 2. Penerbit Buku Kedokteran. Depok
Heinrinch, M. 2010. Farmakognosi dan Fitoterapi. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta
Manito, P. 1981. Biosintesis Produk Alami. Terjemahan Koensoemardiyah. IKIP Semarang Press. Semarang
Markham, K. R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoida. Terjemahan Kosasi Padmawinata. ITB. Bandung
Mathias, M.E, 1982. Flowering Plants In The Landscape. university of california Press. London
Muldja, M.H. 1995. Analisis Instrumental. Cetakan Pertama. Universitas Airlangga Press. Surabaya
Nakanishi, K., Goto, T., Ito, S., Natori, S., Nosoe, S. 1974. Natural Product Chemistry. Volume 1. Kodansha Ltd Academic Press. Tokyo
Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Edisi Keenam. Penerbit ITB. Bandung
Satiadarma, K., Mulja, M., Tjahjono, D.H., Kartasasmita, R.E. 1995. Asas Pengembangan Prosedur Analisis. Edisi Pertama. Airlangga University Press. Surabaya
Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta
Sirait, M. 2007. Penuntun Fitokimia Dalam Farmasi. Penerbit ITB. Bandung
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat-alat
1. Spektrofotometer UV-Vis
2. Spektrofotometer 1H-NMR Jeol/Delta2NMR
500MHz
3. Spektrofotometer FT-IR 2Shimadzu
4. Rotarievaporator Bűchi R-114
5. Labu rotarievaporator 1000 mL Schoot/ Duran
6. Ekstraktor 5000 mL Schoot/ Duran
7. Kolom kromatografi Pyrex
8. Alat destilasi
9. Lampu UV 254 nm/356 nm UVGL 58
10. Neraca analitis Mettler AE 200
11. Corong Kaca 21. Batang pengaduk 22. Chamber
1. Daun tumbuhan Bunga Kupu-kupu rambat
2. Metanol Destilasi
3. Etil asetat Teknis
4. Aquadest
5. N-heksana Teknis
6. Silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM E.Merck. KgA 7. FeCl3 5%
8. NaOH 10% 9. Serbuk Mg 10. HCl(p) 11. H2SO4(p)
12. Pereaksi Benedict 13. HCl 6%
14. Kapas
15. Kloroform Teknis
16. Plat KLT silika gel 60 F254 E.Merck.Art 554
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Bunga Kupu-kupu
Rambat
Serbuk daun bunga kupu-kupu rambat diidentifikasi dengan menggunakan cara Skrining Fitokimia. Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut:
1. Dimasukkan 10 gram serbuk daun bunga kupu-kupu rambat yang telah dikeringkan ke dalam dua gelas Erlenmeyer
2. Ditambahkan 100 mL metanol ke dalam gelas Erlenmeyer 3. Didiamkan selama 1 malam
4. Disaring
5. Dibagi masing-masing ekstrak sampel ke dalam 3 tabung reaksi 6. Ditambahkan masing-masing pereaksi
7. Dilakukan perlakuan yang sama dengan menggunakan pelarut etil asetat dan diperoleh hasil yang sama sebagai berikut:
a. Tabung I : dengan FeCl3 5% menghasilkan larutan berwarna hitam
3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Bunga Kupu-kupu Rambat
Serbuk daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat ditimbang sebanyak 1200 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 5 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam. Maserasi ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan tanin dengan cara melarutkan fraksi pekat metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian di rotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan di ekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-heksana sampai lapisan n-heksana hampir bening. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ektrak pekat lapisan metanol. Fraksi metanol di uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict, lalu di hidrolisis dengan menggunakan HCl 6% sambil di panaskan diatas penangas air selama ± 1 jam. Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh di ektraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali. Ekstrak kloroform dipekatkan dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1.02 g.
3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Dimasukkan 10 ml campuran larutan fase gerak n-heksana: etil asetat 90:10 (v/v) ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Di totolkan ekstrak pekat kloroform pada plat KLT kemudian dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu di tutup dan di elusi. Plat yang telah di elusi, di keluarkan dari bejana, lalu di keringkan.
Diamati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana:etil asetat (80:20, 70:30, 60:40,50:50 (v/v).
3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida dilakukan dengan kolom kromatografi terhadap ekstrak pekat kloroform. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dan fasa gerak yaitu sistem pelarut n-heksana:etil asetat (90:10, 80:20, 70:30, 60:40,50:50) (v/v).
Dirangkai alat kromatografi kolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dibuburkan 1,02 g ekstrak pekat kloroform dengan silika gel dengan pelarut etil asetat, kemudian diuapkan hingga pelarut etil asetat habis menguap dan dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat 90:10 (v/v) secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20 (v/v), 70:30 (v/v), 60:40 dan 50:50 (v/v). Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial sebanyak ± 10 mL, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama, lalu diuji dengan FeCl3 5%. Kemudian dibiarkan sampai semua pelarut habis menguap dan diperoleh kristal.
Kristal yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan etil asetat lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum. Kemudian dilakukan kembali kromatografi kolom dengan fase gerak yang seragam yaitu n-heksana : eti asetat 60:40 (v/v). Kristal hasil kromatografi kolom direkristalisasi dengan menggunakan etil asetat dan n-heksana hingga diperoleh senyawa murni yang dibuktikan dengan noda yang tunggal pada uji KLT dan juga peleburan yang serentak pada uji titik lebur.
3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak n-heksana:etil asetat 60:40 (v/v), dan kloroform:metanol 80:20 (v/v).
Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak ke dalam bejana lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5% dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Laboratorium Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut dan diperoleh data seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.1.
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah (FT-IR)
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan KBr sebagai pelarut dan diperoleh data seperti dilihat pada Gambar 4.2.
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1
NMR)
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
3.4.1 Maserasi dengan menggunakan pelarut metanol
10 gram serbuk kering halus daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat
(Bauhinia kockiana .Lour)
Diekstraksi maserasi dengan metanol Disaring
Dipekatkan
Dibagi kedalam 3 tabung reaksi
3.4.2 Maserasi dengan menggunakan pelarut etil asetat
10 gram serbuk kering halus daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat
(Bauhinia kockiana .Lour)
Diekstraksi maserasi dengan etilasetat Disaring
Dipekatkan
Dibagi kedalam 3 tabung reaksi
3.5 Bagan Penelitian
1200 g serbuk daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat (Bauhinia kockiana Lour)
Ampas
diekstraksi partisi dengan n-heksana secara berulang-ulang sampai bening
Lapisan Klorofom Lapisan ekstrak
metanol asam dimaserasi dengan metanol didiamkan selama ± 24 jam diulangi sebanyak 5 kali disaring
diuji dengan FeCl3 5%
dipekatkan dengan rotarievaporator
diuapkan sampai semua pelarut metanol habis
dilarutkan dengan etil asetat secara berulang ulang sampai negatif
disaring
dipekatkan dengan rotarievaporator
diuapkan sampai semua pelarut etil asetat menguap
diuji dengan FeCl3 5%
dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan hingga pekat
diuji dengan larutan Bennedict
dihidrolisa dengan HCl 6% sambil dipanaskan selama ±1 jam
didinginkan disaring
diekstraksi partisi dengan kloroform hingga
lapisan kloroform negatif saat diuji dengan FeCl3 5%
Lanjutan
Ekstrak pekat kloroform
diuji dengan FeCl3 5%
diuji Kromatografi Lapis Tipis untuk mengetahui eluen n-heksana:etil asetat (90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50) (v/v) dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak (eluen) n-heksana:etil asetat (90:10; 80:20; 70:30; 60:40, 50:50)(v/v) ditampung tiap fraksi sebanyak ± 10 mL dalam botol vial
digabung fraksi dengan Rf yang sama diuji Kromatografi Lapis Tipis
hasil negatif hasil positif hasil positif hasil positif hasil positif
dianalisis Kromatografi Lapis Tipis dengan eluen n-heksana:etil asetat (60:40)(v/v)
dikolom kromatografi dengan fase diam silika gel dan fase gerak (eluen) n-heksana : etil asetat (60:40)(v/v)
Senyawa murni (FT-IR), spektrometer 1H-NMR hasil analisis
diuji Kromatografi Lapis Tipis digabung fraksi dengan Rf yang sama
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Hasil skrining fotokimia terhadap ekstrak metanol dan etil asetat daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat (Bauhinia kockiana Lour) menunjukkan bahwa ekstrak metanol dan ekstrak etil asetat sampel positif terhadap pereaksi-pereaksi flavonoida.
Hasil elusi dari perbandingan pelarut n-heksana:etil asetat 60:40 v/v pada fraksi 52-68, dipisahkan kembali pada alat kolom dan direkristalisasi dengan n-heksana dan etil asetat untuk mendapatkan senyawa murni. Sehingga diperoleh senyawa hasil isolasi berupa kristal jarum berwarna kuning seberat 33,8 mg, dan nilai harga Rf = 0,29 (n-heksana : etilasetat 60:40 v/v) dan Rf=0,88 (kloroform : metanol 90:10 v/v) serta titik lebur 1550C.
Gambar 4.1. Spektrum Ultraviolet-Visible (UV-Vis) senyawa hasil isolasi memberikan serapan panjang gelombang yaitu dengan panjang gelombang 369,0 nm dan 269,0 nm.
C=C
Tabel 4.1 Serapan panjang gelombang Ultraviolet-Visible (UV-Vis) senyawa hasil isolasi
NO Wavelength (nm) Absorbansi
1. 269,00 2,622
2. 369,00 0,678
Hasil analisis spektrometer FT-IR dari senyawa hasil isolasi dapat dilihat pada Gambar 4.2. sebagai berikut:
O
Gambar 4.2. Spektrum Inframerah (FT-IR) senyawa hasil isolasi
Tabel 4.2 Interpretasi Spektrum FT-IR Senyawa Hasil Isolasi Bilangan Gelombang
(cm-1)
Intensitas Gugus Fungsi
3323,35-3296,35 Sedang Vibrasi Ulur –OH
3062,25 Sedang Vibrasi Ulur C-H Aromatis
3012,81-2954,95 Sedang Vibrasi Ulur C-H Alifatis
1697,36 Tajam Vibrasi Ulur C=O
1608,63 Sedang Vibrasi Ulur C=C Aromatis
1319,31 Sedang Vibrasi Tekuk C-H
1035,77-1001,06 Tajam Vibrasi Ulur C-O-C Simetris
921,97 Sedang Vibrasi Ulur C-O-C Tak Simetris
Berikut adalah hasil analisis Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton (1 H-NMR) senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut aseton-d6 dan TMS sebagai standar pada senyawa hasil isolasi:
H-Hasil analisis Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (H1-NMR) senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut Aseton-d6 dan TMS sebagai standar yang memberikan signal-signal pergeseran kimia dengan penjelasan sebagai berikut:
Tabel 4.3 Pergeseran Kimia 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
Atom H δ H Senyawa Hasil Isolasi
H-2’ & H-6’ 7,3833-7,3755 (d)
H-5’ 6,7127-6,6959 (d)
H-8 6,5233 (s)
4.2 Pembahasan
gelombang senyawa flavonoida golongan flavonol dengan OH tersubstitusi (pita I berkisar 330-360 nm dan pita II berkisar 250-280 nm) (Lampiran 7).
Hasil interpretasi Spektrum Inframerah (FT-IR) dan Spektrum Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) dalam standar TMS diperoleh:
Pergeseran kimia pada daerah δ = 3,8915 ppm dengan puncak singlet menunjukkan adanya proton dari gugus metoksi H-5 pada cincin B senyawa flavonoid. Hal ini didukung oleh peak spektrum standar pembanding pada lampiran 11, dimana gugus metoksi terdapat pada daerah δ = 3,5-4,0 ppm dengan puncak singlet dan juga spektrum inframerah pada bilangan gelombang 3012,81-2954,95 cm-1 dengan puncak sedang menunjukkan vibrasi tekuk C-H alifatis dari CH3, pada bilangan gelombang 921,97 cm -1 dengan puncak sedang menunjukkan vibrasi ulur C-O-C tak simetris dan pada bilangan gelombang 1319,31 cm-1 dengan puncak sedang menunjukkan vibrasi tekuk C-H alifatis dari CH3.
Berdasarkan analisis data dan interpretasi yang dilakukan pada spektrum UV-Visible, Spektrum Inframerah (FT-IR), Spektrum 1H-NMR disimpulkan bahwa besar kemungkinan kristal yang diisolasi dari daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat (Bauhinia kockiana Lour) adalah senyawa flavonoida golongan flavonol.
Meskipun demikian, penulis mengakui bahwa data hasil 1H-NMR masih kurang murni karena adanya campuran dari senyawa hasil isolasi. Berikut ini merupakan struktur flavonol yang diperoleh dari senyawa hasil isolasi:
O
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Hasil isolasi yang diperoleh dari 1200 g daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat (Bauhinia kockiana Lour) merupakan kristal kuning sebanyak 33,8 mg dengan harga Rf=0,29 (n-heksana : etilasetat 60:40 v/v) dan Rf=0,88 (kloroform : metanol 90:10 v/v), dan diperoleh titik lebur 155oC adalah positif terhadap pereaksi flavonoida
2. Hasil analisis dengan Spektrofotometri UV-Visible, Spektrofotometri Inframerah (FT-IR) dan Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi dari daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat (Bauhinia kockiana Lour) diduga adalah senyawa flavonoida golongan flavonol.
5.2 Saran
TINJAUAN PUSTAKA
2.1Tumbuhan Bunga Kupu-kupu Rambat (Bauhinia kockiana Lour)
2.1.1 Sistematika Tumbuhan Bunga Kupu-kupu Rambat (Herbarium Medanense, 2016)
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta Class : Dicotyledoneae Ordo : Fabales
Famili : Caesalpineaceae Genus : Bauhinia
Spesies : Bauhinia kockiana (Lour). Nama Lokal : Bunga kupu-kupu rambat
2.1.2 Morfologi dan Manfaat Tumbuhan
2.2Senyawa Organik Bahan Alam
Pada hakekatnya kimia bahan alam merupakan pengetahuan yang telah dikenal sejak peradaban manusia tumbuh. Contohnya adalah pembuatan bahan makanan, pewarnaan benda, obat-obatan atau stimulan, dan sebagainya.
Para kimiawan pada akhir abad ke delapan belas mulai mengakhiri kepercayaan dunia mitos ke ilmu pengetahuan modern, dan diantara para ilmuan sangat antusias untuk menguak sifat-sifat yang sebenarnya dari bahan ekstrak yang diperoleh dari alam. Mereka mulai memisahkan, memurnikan, dan akhirnya menganalisis senyawa-senyawa yang dihasilkan dari sel-sel hidup. Seiring dengan kemajuan ilmu pengetahuan maka perkembangan kimia bahan alam tidak lagi diragukan hingga sekarang (Sastrohamidjojo, 1996).
Biogenesis dari produk alami, meskipun pada mulanya berkaitan dengan kimia organik dan biokimia, menjadi berlainan karena mempunyai tujuan yang berlainan. Kimia organik terutama mempelajari struktur, sifat-sifat kimia dan fisika, serta cara sintesisnya, baik secara alami ataupun in vitro dari zat-zat kimia tetapi cenderung untuk mengabaikan sifat-sifat khusus dari bahan alam, misalnya tentang cara pembentukan dan peran biologisnya. Biokimia, berusaha menjawab pertanyaan-pertanyaan yang paling banyak diajukan terutama tentang metabolisme primer, dan mengabaikan proses-proses sekunder misalnya tentang pembentukan alkaloid, terpena dan lain-lain (Manitto, 1981).
1. Klasifikasi Berdasarkan Struktur Kimia
Klasifikasi ini adalah klasifikasi formal berdasarkan kerangka struktur molekul, yaitu: a. Senyawa lemak rantai terbuka atau alifatik, seperti asam-asam lemak, gula-gula, dan
hampir semua asam amino
b. Senyawa sikloalifatik atau alisiklik, seperti terpenoid, steroid, dan beberapa alkaloid c. Senyawa benzenoid atau aromatik, seperti fenol dan kuinon.
d. Senyawa heterosiklik, seperti alkaloid, flavonoid, dan basa-basa nukleat.
2. Klasifikasi Berdasarkan Aktivitas Fisiologi
Pengembangan bahan alam didahului dengan pengamatan dan pengalaman empirik khasiat bahan alam tersebut untuk menyembuhkan penyakit tertentu. Oleh karena itu, salah satu cara penyelidikan bahan obat dari tumbuhan atau bahan alam lainnya adalah melalui ekstraksi dan penetapan khasiat farmakologi ekstrak, diikuti dengan isolasi komponen murni.
3. Klasifikasi Berdasarkan Taksonomi
Pengetahuan tentang kandungan komponen tumbuhan berkembang dengan sangat pesat karena berkembangnya metode ekstraksi, isolasi dan karakterisasinya. Hal ini mendorong berkembangnya suatu bidang baru yang disebut kemotaksonomi (chemotaxonomy) atau sistematik kimia (chemosystematic) yang mengarah ke pembagian kandungan tumbuhan berdasarkan taksa tumbuhan. Dengan kata lain, isi kandungan tumbuhan dianggap sebagai tanda bagi evolusi dan kalsifikasi tumbuhan.
4. Klasifikasi Berdasarkan Biogenesis
Biogenesis dan biosintesis memiliki arti yang sama dan sering kali digunakan tanpa perbedaan. Namun, istilah biogenesis biasanya digunakan untuk reaksi pembentukan yang masih dalam taraf hipotesis, sedangkan jika reaksi tersebut telah dibuktikan secara eksperimen, digunakan istilah biosintesis.
Sebagian besar bahkan hampir semua, senyawa kandungan kimia bahan alam adalah senyawa organik, dan sumber utama senyawa karbon atau senyawa organik ini adalah glukosa yang dibentuk melalui fotosintesis di dalam tumbuhan autotropik atau diperoleh dari organisme heterotrof.
Berbagai teori tentang pembentukan senyawa metabolit primer dan metabolit
Komponen pembangun utama untuk atom-atom karbon dan nitrogen di dalam semua senyawa bahan alam berasal dari 5 kelompok prekursor, yaitu:
Asetil ko-A
Malonil ko-A unit 2C(Me-C O
) poliketida (asetogenin) a.
b. asam sikimat unit 6C-3C (6C-1C atau 6C-2C) senyawa fenolik c. asam mevalonat unit prenil isoprenoid
CH2=C-CH2-CH2
Me
d. unit asam amino seperti fenilanalina, tirosina, ornitina, lisina, dan triptofan alkaloid
e.
5-5'-deoksiadenilmetionina unit 1C (Wiryowidagdo, 2008).2.3 Metabolit Sekunder
Fisik tanaman sebagian besar terdiri atas air. Kandungan air mencapai lebih dari 90% pada daun, bunga, buah (buah yang berair banyak), dan bagian tanaman yang berada di bawah tanah. Pada jaringan yang miskin organ penyimpan, kandungan airnya menurun hingga sekitar 50%, yaitu pada kulit dan kayu. Yang mengandung air paling sedikit adalah biji, umumnya mengandung ±10%.
Banyak senyawa kimia tanaman yang telah diisolasi dan dipublikasikan sebelum diketahui strukturnya. Pengelompokan senyawa kimia tanaman berdasarkan sifat khas yang dimilikinya (antara lain warna, rasa, bau, pH, kelarutan), merupakan hal penting sehingga sampai sekarang masih banyak dipakai. Berikut ini contoh pengelompokan senyawa kimia (Sirait, 2007)
A.Minyak Atsiri. Baunya khas dan dapat dipisahkan dari senyawa kimia tanaman lainnya, karena sukar larut dalam air dan dapat menguap bersama uap air.
B.Alkaloid. Pertemuan dua sifat basa dan kerja farmakologi, pada umumnya dimiliki oleh senyawa kimia yang mengandung N. Setelah empat puluh tahun sejak penemuan Serturner, ditemukan lima puluh zat berkhasiat yang bersifat basa dari simplisia obat penting. Fraksinasi senyawa kimia dari tanaman berdasarkan sifat farmakologi saja sesuai percobaan dengan binatang mengalami banyak kesulitan. Penyebab sifat basa senyawa kimia tanaman yang sangat erat kaitannya dengan kerja farmakologi pada tubuh binatang dan manusia, belum diketahui dengan jelas.
C.Zat Pahit. Berpedoman pada rasa pahit adalah suatu metoda yang mudah untuk memisahkan senyawa kimia tanaman, perlu waktu yang cukup hingga seluruh zat pahit dalam sari menjadi zat yang dapat dikristalkan. Tidak jarang zat pahit yang ditemukan secara bersamaan, kerja farmakologisnya dikenal mencolok. Contoh yang paling terkenal adalah glikosida yang bekerja pada jantung. Cara untuk mengisolasi glikosida jantung ini seperti pada zat pahit, jadi tidak dilakukan pengujian farmakologisnya terhadap jantung.
D. Zat Warna. Jumlah zat warna dari tanaman diperkirakan ±2000 jenis, 130 diantaranya merupakan bahan perdagangan yang penting. Jumlah zat warna yang sekarang benar-benar dipakai (misalnya pewarna makanan) sangat kecil. Contohnya bisein, saran, kuersetin. Pigmen tanaman mempunyai struktur kimia yang berlainan, begitu juga sifat fisika, kelarutan, warna, fluoresens, dan sebagainya.
Semua varian flavonoid saling berikatan karena alur biosintesis yang sama, yang memasukkan prazat dari alur sikimat dan alur asetil-malonat, flavonoid pertama dihasilkan segera setelah kedua alur ini bertemu. Sekarang, flavonoid yang dianggap pertama kali terbentuk pada biosintesis ialah khalkon, dan semua bentuk lain diturunkan darinya melalui berbagai alur.
2.4.1 Jalur Metabolisme Flavonoid
Prazat flavonoid sensiri sudah diketahui tanpa keraguan sebagai hasil dari banyak percobaan penuntun, tetapi masih banyak pertanyaan yang belum terjawab mengenai jalur yang diikuti. Seiring teramati bahwa dalam sesies tumbuhan tertentu semua flavonoid yang berbeda-beda mempunyai pola hidroksilasi cincin yang sama, perbedaan hanya pada metilasi, glikosilasi, dan struktu bagian C-3. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat senyawa antara C-15 yang umum yang diubah menjadi berbagai flavonoid setelah pola hidroksilasi cincin terbentuk. Akan tetapi, tampaknya berbagai jenis hidroksil ini sesungguhnya dimasukkan pada tahap yang berlainan dalam sintesis.
O
2.4.2 Klasifikasi Senyawa Flavonoida
Dalam tumbuhan, flavonoid terdapat dalam berbagai bentuk struktur. Keragaman struktur flavonoid ini disebabkan karena perbedaan tahap modifikasi dari struktur dasar flavonoid, antara lain:
1. Flavonoid O-glikosida
Flavonoid biasanya terdapat sebagai flavonoid-O-glikosida (Gambar 2.2), pada senyawa tersebut satu gugus hidroksil flavonoid (atau lebih) terikat pada satu gula (atau lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tak tahan asam. Pengaruh glikosilasi menyebabkan flavonoid menjadi kurang reaktif dan lebih muda larut dalam air (cairan); sifat terakhir ini memungkinkan penyimpanan flavonoid didalam vakuol sel (disinilah biasanya flavonoid berada. Walaupun gugus hidroksil pada setiap posisi dalam inti flavonoid dapat diglikosilasi, kenyataannya hidroksil pada tempat tertentu mempunyai peluang yang lebih besar untuk terglikosilasi ketimbang tempat-tempat lain, misalnya 7-hidroksil pada flavon, isoflavon dan dihidroflavon, 3-(dan 7-)hidroksil dalam flavonol dan dihidroflavonol; dan 3-(dan 5-)hidroksil dalam antosianidin. Sudah diakui bahwa dalam tumbuhan O-glikosilasi (dan metilasi) terjadi sebagai salah satu tahap akhir pada biosintesis dan katalisasi oleh enzim yang sangat khas. Ada kalanya glikosida mengalami modifikasi lebih lanjut, yaitu asilasi. Glikosida terasilasi mempunyai satu gugus hidroksil gula yang berkaitan dengan asam seperti asam asetat atau asam ferulat.
O
2. Flavonoid C-glikosida
Gula dapat juga terikat pada atom karbon flavonoid dan dalam hal ini gula tersebut terikat terikat langsung pada inti benzena dengan satu ikatan karbon-karbon yang tahan asam (dibanding dengan O-glikosida). Glikosida yang demikian disebut C-glikosida (Gambar 2.3). Sekarang gula yang terikat pada atom C hanya ditemukan pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoid. Jenis gula yang terlibat ternyata jauh lebih sedikit ketimbang jenis gula pada O-glikosida, biasanya dari jenis glukosa yang paling umum, dan juga galaktosa, ramnosa, xilosa dan arabinosa. Jenis aglikon flavonoid yang terlibat pun sangat terbatas. Jadi, walaupun isoflavon, flavanon, dan flavonol kadang-kadang terdapat dalam bentuk C-glikosida, sebegitu jauh hanya flavon C-glikosida yang paling lazim ditemukan.
O
Gambar 2.3 Flavonoid-C-Glikosida (Markam, 1988)
3. Flavonoid Sulfat
4. Biflavonoid
Seperti yang ditunjukkan oleh namanya, biflavonoid (Gambar 2.4) adalah flavonoid dimer, walaupun prosianidin dimer biasanya tidak dimasukkan ke dalam golongan ini. Flavonoid yang sering terlibat adalah flavon dan flavonon yang secara biosintesis mempunyai pola oksigen yang sederhana dan ikatan antar flavonoid berupa ikatan karbon-karbon atau kadang-kadang ikatan eter. Monomer flavonoid yang digabungkan menjadi biflavonoid dapat berjenis sama atau berbeda, dan letak ikatannya berbeda-beda.
O
Gambar 2.4 Biflavonoid (Markam, 1988)
5. Aglikon flavonoid yang aktif-optik
Aglikon flavonoid mempunyai atom karbon asimetrik dan dengan demikian menunjukkan keaktifan optik (yaitu memutar cahaya terpolarisasi-datar). Yang termasuk dalam golongan flavonoid ini adalah flavonon, dihidroflavonol, kafein, pterokarpan, rotenoid, dan beberapa biflavonoid. Putaran aglikon flavonoid alam berkaitan dengan stereokimia mutlak flavonoid.
Menurut Robinson (1995), flavonoida dapat dikelompokkan berdasarkan keragaman pada rantai C3 yaitu :
1. Flavonol
Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida, dan aglikon flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan mirisetin yang berkhasiat sebagai antioksidan dan antiimflamasi. Larutan flavonol dalam suasana basa dioksidasi oleh udara tetapi tidak begitu cepat sehingga penggunaan basa pada pengerjaannya masih dapat dilakukan.
O O
OH
Flavonol
2. Flavon
Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3-hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksi warnanya. Flavon yang paling umum dijumpai adalah apigenin dan luteolin. Jenis yang paling umum adalah 7-glukosida dan terdapat juga flavon yang terikat pada gula melalui ikatan karbon.
Flavon dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa flavonoida
O O
3. Isoflavon
Isoflavon tidak begitu menonjol, tetapi senyawa ini penting sebagai fitoaleksin. Senyawa yang lebih langka lagi ialah homoisoflavon. Senyawa ini biasanya larut dalam air panas dan alkohol meskipun beberapa flavonoid yang sangat termetilasi tidak larut dalam air.
O O
Isoflavon
4. Flavanon
Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga. Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah jeruk ; dua glikosida yang paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan jeruk.
O O
Flavanon
5. Flavanonol
6. Antosianin
Antosianin adalah pigmen daun bunga merah sampai biru yang biasa, banyaknya sampai 30% bobot kering dalam beberapa bunga. Antosianin terdapat juga dalam bagian lain tumbuhan tinggi kecuali fungus. Antosianin selalu terdapat dalam bentuk glikosida kecuali sesepora aglikon antosianidin. Hidrolisis dapat terjadi selama autolysis jaringan tumbuhan atau pada saat isolasi, sehingga antosianidin ditemukan sebagai senyawa jadian . Pada pH lebih rendah dari 2, antosianin
Katekin dan proantosianidin adalah dua golongan senyawa yang mempunyai banyak kesamaan. Semuanya senyawa tanpa warna, terdapat pada seluruh dunia tumbuhan tetapi terutama dalam tumbuhan berkayu. Telah ditemukan satu epikatekin glukosida, dan beberapa katekin yang terdapat sebagai ester asam galat. Satuan katekin terdapat sebagai bagian dari berbagai senyawa oligomer dengan jenis lain fenilpropanoid, misalnya pada proantosianidin.
Merupakan monomer flavan 3,4-diol, leukoantosianidin jarang terdapat sebagai glikosida, namun beberapa bentuk glikosida yang dikenal adalah apiferol, dan peltoginol.
O
OH HO
OH OH
HO OH
Leukoantosianidin
9. Auron
Berupa pigmen kuning emas terdapat dalam bunga tertentu dan bryofita. Dalam larutan senyawa ini menjadi merah ros.
O
CH
O
Auron
10. Kalkon
2.5Skrining Fitokimia
Banyak reagen yang dapat digunakan untuk mengetahui keberadaan dari flavonoid, meskipun beberapa juga akan bereaksi positif dengan senyawa polifenol. Reagen yang biasa digunakan adalah :
1. Shinoda Test, yaitu dengan menambahkan serbuk magnesium pada ekstrak sampel dan beberapa tetes HCl pekat, warna orange, pink, merah sampai ungu akan terjadi pada senyawa flavon, flavonol, turunan 2,3-dihidro dan xanton. Penggunaan zinc sebagai pengganti magnesium dapat dilakukan, dimana hanya flavanonol yang memberikan perubahan warna merah pekat sampai magenta, flavanon dan flavonol akan memberi warna merah muda yang lemah sampai magenta.
2. H2SO4(p), flavon dan flavonol akan memberikan perubahan larutan kuning pekat. Kalkon dan auron menghasilkan larutan berwarna merah atau merah kebiru-biruan. Flavanon memberikan warna orange sampai merah (Cannell, 1998). 3. NaOH 10% , menghasilkan larutan biru violet
4. FeCl3 5% telah digunakan secara luas untuk mengidentifikasi senyawa fenol, tetapi tidak dapat digunakan untuk membedakan macam-macam golongan flavonoid. Pereaksi ini memberi warna kehijauan, warna biru, dan warna hitam-biru (Robinson, 1995).
2.6Teknik Pemisahan
Teknik pemisahan memiliki tujuan untuk memisahkan komponen yang akan ditentukan berada dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponen lainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan:
1. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan dipisahkan.
Biomassa (tanaman, mikroba, laut)
Ekstraksi Skrining
Isolasi zat aktif berdasarkan uji hayati Skrining silang
Elusidasi Struktur
Gambar 2.6 Diagram Teknik Pemisahan Metabolit Sekunder
2.6.1 Ekstraksi
Sampel yang berasal dari tanaman setelah diidentifikasi, kemudian digolongkan menjadi spesies dan famili, sampel kemudian dikumpulkan dari bagian arialnya (daun, batang, kulit kayu pada batang, kulit batang, dan akar). Sampel ini kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan untuk menghindari penguraian komponen oleh udara atau mikroba.
Jika telah dikeringkan, biomassa kemudian digiling menjadi partikel-partikel kecil menggunakan blender atau penggilingan. Proses penggilingan ini penting karena ektraksi efektif pada partikel kecil, dikarenakan memiliki luas permukaan yang lebih besar.
Pemilihan pelarut ekstraksi sangat penting. Jika tanaman diteliti dari sudut pandang etnobotani, ektraksi harus mengikuti pemakaiannya secara tradisional. Kegagalan mengekstraksi biomassa dapat menyebabkan kehilangan akses untuk mendapatkan zat aktif.
mempermudah proses isolasi. Ekstraksi dingin memungkinkan banyak senyawa terekstraksi, meskipun beberapa senyawa memiliki kelarutan terbatas dalam pelarut ekstraksi pada suhu kamar (Heinrich , 2010).
Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif terhadap senyawa yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan ekstrak pekat, biasanya pelarut ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotari evaporator (Harborne, 1996).
2.6.2 Partisi
Metode pemisahan yang mungkin paling sederhana adalah partisi, yang banyak digunakan sebagai tahap awal pemurnian ekstrak. Partisi menggunakan dua pelarut tak bercampur yang ditambahkan kedalam ekstrak tersebut, hal ini dapat dilakukan secara terus menerus dengan menggunakan dua pelarut yang tak bercampur yang kepolarannya meningkat. Partisi biasanya dilakukan melalui dua tahap:
1. Air/petroleum eter ringan (heksana) untuk menghasilkan fraksi nonpolar di lapisan organik
2. Air/diklorometan atau air/kloroform atau air/etil asetat untuk membuat fraksi agak polar di lapisan organik. Ini merupakan metode pemisahan yang mudah dan mengandalkan kelarutan bahan alam dan bukan interaksi fisik dengan medium lain (Heinrich , 2010).
2.6.3 Hidrolisis
Bila flavonoid telah diisolasi dengan cara kromatografi, dan spektrum UV-tampak untuk menentukan struktur telah dinilai sebagaimana mestinya, penentuan struktur glikosida lebih lanjut dilakukan dengan usaha memutuskan gula dari aglikon dengan cara hidrolisis. Dengan cara ini berbagai jenis glikosida dapat saling dibedakan dan bila terjadi pemutusan, gula, aglikon, gugus basil, dan lain-lain dapat dipisahkan dan diidentifikasi.
Waktu yang diperlukan untuk memutuskan suatu gula dari suatu flavonoid O-glikosida dengan hidrolisis asam tidak ditentukan hanya oleh kekuatan asam, tetapi juga oleh sifat gula dan oleh tempat gula itu terikat pada inti flavonoid.
2.6.3.2 Hidrolisis Enzim
Hidrolisis enzim adalah cara yang berguna untuk menentukan sifat ikatan antara gula dan flavonoid. Menurut teori, cara ini pun merupakan cara untuk memutus monosakarida khas dari flavonoid O-glikosida, dan dengan demikian sekaligus merupakan cara untuk mengidentifikasikannya. Tetapi, dalam praktek jarang terdapat sedemikian enzim niaga yang kemurniannya memadai yang dapat menjamin kekhasannya.
2.6.3.3 Hidrolisis Basa
Hidrolisis basa jarang digunakan pada flavonoid glikosida, tetapi cara ini dapat digunakan
untuk memutuskan gula secara selektif dari gugus hidroksil pada posisi 7 atau 4’ bila juga
ada gula yang terikat pada posisi 3-hidroksi. Keselektifan ini adalah kebalikan dari keselektifan yang ditunjukkan oleh hidrolisis asam. Perlakuan basa akan melepaskan disakarida dari 7-hidroksi asal saja ikatan antarglukosida bukan 1-2 (Markam, 1988).
2.6.4 Kromatografi
2.6.4.1 Kromatografi Lapis Tipis
Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) sangat bermanfaat untuk analisis obat dan bahan lain dalam laboratorium karena hanya memerlukan peralatan sederhana, waktu cukup singkat (15-60 menit), dan jumlah zat yang diperiksa cukup kecil (±0,01 g senyawa murni atau 0,1 g simplisia). Selain itu, KLT tidak memerlukan ruang yang besar dan teknik pengerjaannya juga sederhana.
Pelarut
Tabel 2.1 Urutan pelarut sesuai dengan efek elusinya
# Bercampur dengan air
Adsorben
Adsorben yang umum digunakan yang umum digunakan antara lain silika gel, Alumindo, tanah diatom, dan serbuk selulosa. Sephadex (dextran gel) atau resin penukar ion digunakan untuk penggunaan khusus. Silika gel bersifat asam dan dapat digunakan untuk kromatografi pembagian dan penyerapan. Alumindo bersifat basa dan terutama digunakan untuk kromatografi penyerapan. Tanah diatom bersifat netral dan digunakan sebagai penyangga untuk kromatografi pembagian. Bahan-bahan ini dapat langsung digunakan atau dicampur dengan perekat atau pengikat (binder), misalnya kalsium sulfat untuk membuat lapisan yang lebih kohesif.
2.6.4.2 Kromatografi Kolom
Pemisahan yang terjadi bergantung pada jenis fase gerak yang digunakan. Bila fase gerak yang digunakan sekaligus merupakan larutan campuran yang dipisahkan, kecuali eluat yang pertama, eluat berikutnya selalu mengandung komponen dari eluat sebelumnya. Jadi, komponen yang dipisahkan tidak murni. Namun, dengan cara ini, jumlah komponen dalam campuran masih dapat ditentukan.
Adsorben dan Pelarut
Adsorben yang digunakan hendaknya memenuhi persyaratan berikut: 1. Tidak larut dalam pelarut yang digunakan
2. Inert (tidak bereaksi dengan sampel)
3. Cukup aktif sehingga memungkinkan perambatan sampel 4. Tidak berwarna agar pemisahan dapat diamati
5. Memungkinkan fase gerak mengalir dengan baik 6. Dapat diproduksi dengan sifat konstan (Harmita, 2015).
2.7 Teknik Spektroskopi
Teknik analisis modern mencakup berbagai teknik analisis instrumen elektronika yang dikembangkan untuk mengukur parameter fisika dan kimia alami yang khas dan tetap dari atom atau molekul. Parameter khas yang bermakna untuk analisis adalah absorpsi dan emisi energi radiasi elektromagnet oleh atom atau molekul.
Teknik analisis spektroskopi berasaskan antaraksi radiasi elektromagnet dengan komponen atom atau molekul yang menghasilkan fenomena bermakna sebagai parameter analisis. Karena pada setiap teknik spektroskopi antaraksi radiasi elektromagnet dengan komponen atom/ molekul khas dan tidak semuanya sama, uraian teknik analisis didahului dengan mekanisme antaraksi tersebut, serta fenomena yang dipakai sebagai parameter analisisnya (Satiadarma , 1995).
2.7.1 Spektroskopi Ultraviolet (UV-Vis)
Senyawa polifenol memiliki dua karakteristik pita penyerapan Ultraviolet dengan maksimal jarak 240 sampai 285 nm dan 300 sampai 550 nm. Berbagai macam golongan flavonoid dapat dikenali dari spektrum UV mereka masing-masing, karakteristik spektra UV dari masing-masing flavonoid yang mengandung jumlah dari golongan hidroksil aglikon, pola substituen glikosida, dan golongan asil aromatik bahan alam.
Saat ini penggunaan Spektroskopi UV-Visible paling sering digunakan dalam aplikasi untuk analisa kuantitatif, dan nilai dari metode ini dapat mengurangi perbandingan informasi yang banyak dari teknik spektroskopi yang lainnya seperti NMR dan MS (Andersen, 2006).
Ciri spektrum khas jenis flavonoid utama dengan pola oksigenasi yang setara disajikan pada tabel 2.2 (Markam,1988) dibawah :
Tabel 2.2 Rentangan Serapan Spektrum UV-Visible golongan Flavonoida
No Pita II (nm) Pita I (nm) Jenis Flavonoida
1 250-280 310-350 Flavon
2 250-280 330-360 Flavonol (3-OH tersubstitusi)
3 250-280 350-385 Flavonol (3-OH bebas)
4 245-274 310-330 bahu Isoflavon
5 275-295 300-330 bahu Flavanon dan dihidroflavonol
6 230-270
8 270-280 465-560 Antosianidin dan antosianin
Spektrum infra merah suatu molekul adalah hasil transisi antara tingkat energi getaran (vibrasi) yang berlainan. Inti-inti atom yang terikat oleh ikatan kovalen mengalami getaran (vibrasi) atau osilasi (oscillation) dengan cara serupa dengan dua bola yang terikat oleh suatu pegas.
Bila molekul menyerap radiasi inframerah, energi yang diserap menyebabkan kenaikan dalam amplitudo getaran atom-atom yang terikat itu. Jadi molekul ini berada dalam keadaan vibrasi tereksitasi , energi yang diserap ini akan dibuang dalam bentuk panas bila molekul itu kembali ke keadaan dasar. Panjang gelombang eksak dari absorpsi oleh suatu tipe ikatan, bergantung pada macam getaran dari ikatan tersebut. Oleh karena itu, tipe ikatan yang berlainan (C-H, C-C, C=O, C=C, O-H, dan sebagainya) menyerap radiasi inframerah pada panjang gelombang yang berlainan.
Dengan demikian spektrometri inframerah dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya gugus fungsi dalam suatu molekul. Banyaknya energi yang diserap juga beraneka ragam dari ikatan ke ikatan. Ini disebabkan sebagian oleh
perubahan dalam momen dipol (µ≠0) pada saat energi diserap. Ikatan nonpolar (seperti
C-H atau C-C) menyebabkan absorpsi lemah, sedangkan ikatan polar (seperti misalnya O-H, N-H, dan C=O) menunjukkan absorpsi yang lebih kuat.
Suatu ikatan dalam sebuah molekul dapat mengalami berbagai vibrasi molekul. Secara umum terdapat dua tipe vibrasi molekul:
1. Streching (vibrasi regang/ulur): vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi perpanjangan atau pemendekan ikatan.
Oleh karena itu suatu ikatan tertentu dapat menyerap energi lebih dari satu panjang gelombang. Contohnya, ikatan O-H menyerap energi pada frekuensi 3330 cm-1, energi pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi regang ikatan O-H itu. Suatu ikatan O-H itu juga menyerap pada kira-kira 1250 cm-1, energi pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi lentur. Tipe vibrasi yang berlain-lainan ini disebut cara vibrasi fundamental (Supratman, 2010).
2.7.3 Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Setelah spektroskopi inframerah, spektroskopi resonansi magnetik inti (NMR) adalah yang metode yang paling penting digunakan dalam kimia organik. Dalam spektroskopi inframerah mengandung infromasi mengenai adanya gugus fungsi pada molekul, sedangkan spektroskopi NMR memberikan informasi mengenai jumlah dari masing-masing hidrogen.
Kemampuan terhebat resonansi inti magnetik timbul karena tidak semua proton dalam molekul memiliki resonansi yang identik pada frekuensi yang sama. Hal ini sesuai dengan fakta bahwa berbagai macam proton dalam molekul dikelilingi oleh elektron dan memiliki sedikit perbedaan dalam lingkungan elektronik dari satu dan yang lainnya. Proton akan terlindungi oleh elektron yang mengelilingi mereka. Dalam daerah magnetik, peredaran elektron valensi dari daerah penghasil proton yang bertentangan dengan daerah
magnetik yang berlaku. Pergeseran kimia dalam unit δ ditunjukkan dalam jumlah
resonansi proton yang bergeser dari TMS dalam bagian per juta (ppm) dari frekuensi dasar spektroskopi
δ=frekuensi spektrometer dalam MHzpergeseran dalam Hz
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang
Menurut perkiraan, kira-kira 2% dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuhan (atau kira-kira 1 x 109 ton/tahun) diubah menjadi flavonoid atau senyawa yang berkaitan erat dengannya. Sebagian besar tanin pun berasal dari flavonoid. Jadi, flavonoid merupakan salah satu golongan fenol alam terbesar. Sebenarnya, flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan hijau sehingga pastilah ditemukan pula pada setiap telaah ekstrak tumbuhan (Markham, 1988).
Efek flavonoid terhadap macam-macam organisme sangat banyak macamnya dan dapat menjelaskan mengapa tumbuhan yang mengandung flavonoid dipakai dalam pengobatan tradisional. Aktivitas antioksidannya mungkin dapat menjelaskan mengapa flavonoid tertentu merupakan komponen aktif tumbuhan yang digunakan secara tradisional untuk mengobati gangguan fungsi hati (Robinson, 1995).
Flavonoida yang terdapat di dalam tumbuhan dapat digunakan sebagai pelindung tubuh manusia dari radikal bebas dan dapat mengurangi resiko penyakit kanker dan peradangan (Nessa, 2003). Senyawa flavonoid diduga sangat bermanfaat dalam makanan karena berupa senyawa fenolik, senyawa ini yang bersifat antioksidan kuat. Oleh karena itu, makanan yang kaya flavonoid dianggap penting untuk mengobati penyakit-penyakit, seperti kanker dan penyakit jantung (Heinrich, 2010).
digunakan untuk obat infeksi luka, dan beberapa telah memakan sebagai salad (Chew, et al, 2011).
Beberapa peneliti terdahulu telah melakukan penelitian terhadap tumbuhan bunga kupu-kupu rambat; Chew, et al (2011) melakukan penelitian tentang penilaian kapasitas antioksidan dan komposisi fenolik untuk daun dan bunga tumbuhan bunga kupu-kupu rambat. Dimana dengan menggunakan IC50 diperoleh total fenolik sebesar 27,0 ± 5,0 µg/mL. Sedangkan untuk kapasitas antioksidannya diukur dengan menggunakan DPPH dan dengan bakteri Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA), diperoleh nilai MID berkisar antara 100 µg / disc. Hal ini menandakan bahwa kemampuan antioksidan dan antibakteri dari tumbuhan bunga kupu-kupu rambat yang baik terutama untuk perawatan infeksi luka.
Sejauh ini penelitian terhadap kandungan flavonoida dari daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat belum ada di literature. Oleh karena itu, peneliti tertarik untuk meneliti kandungan flavonoida dari daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat.
Dari uji pendahuluan yang peneliti lakukan dengan uji skrining fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak metanol dan etil asetat daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat mengandung senyawa flavonoida.
1.2Permasalahan
Permasalahan dalam penelitian ini adalah bagaimana cara mengisolasi senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat.
1.3Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat.
1.4Manfaat Penelitian
1.5Lokasi Penelitian
1. Tempat Pengambilan Sampel
Sampel yang digunakan diperoleh dari area kampus Universitas Sumatera Utara Padang Bulan Medan.
2. Tempat Melakukan Penelitian
Penelitian dilakukan di laboratorium Kimia Bahan Alam FMIPA Universitas Sumatera Utara (USU).
3. Lokasi Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
Analisis Spektrofotometer Inframerah (FT-IR), Spektrofotometer UV-Visible dan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) dilakukan di Pusat Penelitian Kimia- LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang.
1.6Metodologi Penelitian
Dalam penelitian ini, isolasi senyawa flavonoida dilakukan terhadap daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat berupa serbuk halus yang kering sebanyak 1200 gram. Tahap awal dilakukan uji skrining fitokimia untuk senyawa flavonoida, yaitu dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5%, Mg-HCl dan H2SO4(p).
ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN BUNGA KUPU-KUPU RAMBAT (Bauhinia kockiana Lour)
ABSTRAK
Isolasi senyawa flavonoida yang terkandung di dalam daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat (Bauhinia kockiana Lour.) dilakukan dengan cara ekstraksi maserasi menggunakan pelarut metanol. Ekstrak metanol dipekatkan lalu dilarutkan dengan etil asetat kemudian disaring dan diuapkan hingga seluruh etil asetat menguap. Ekstrak pekat etil asetat yang diperoleh dilarutkan dengan metanol dan diekstraksi partisi dengan n-heksana. Ekstrak pekat metanol dihidrolisis dengan HCl 6% dan selanjutnya diekstraksi partisi dengan kloroform. Ekstrak pekat kloroform dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan eluen n-heksana : etil asetat (90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50 (v/v)). Fraksi dari perbandingan (60:40) v/v dimurnikan dan dikristalisasi, menghasilkan kristal kuning amorf dengan massa=33,8 mg, titik lebur 1550 C dan harga Rf=0,29. Selanjutnya senyawa yang diperoleh dianalisis dengan Spektrofotometer UV-Visibel, Inframerah (FT-IR) dan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR). Dari hasil identifikasi data spektrofotometer diindikasikan senyawa hasil isolasi adalah senyawa flavonoida golongan Flavonol.
ISOLATION OF FLAVONOID COMPOUNDS FROM LEAVES OF KUPU-KUPU RAMBAT (Bauhinia kockiana Lour)
ABSTRACT
Isolation of flavonoid compounds from the leaves of bunga kupu-kupu rambat (Bauhinia kockiana Lour.) has been done by maceration technique with methanol solvent. The concentrated methanol extract was evaporated and dissolved with ethyl acetate, filtered, concentrated and evaporated. Concentrated ethyl acetate extract was dissolved with methanol and partitioned with n-hexane solvent. Concentrated methanol extract was hydrolyzed with HCl 6% and then partitioned with chloroform solvent. Concentrated chloroform extract was separated by column chromatography with the eluent n-hexane: ethyl acetate (90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50 (v/v)) as mobile phase. The fraction from n-hexane : ethyl acetate (60:40 ) v/v was crystallized to get a pure compound, yielding a yellow crystalline amorphous with mass = 33.8 mg, melting point = 155o C and Rf = 0.29. And then, the compounds were analyzed by UV-Visible, Infrared (FT-IR) and Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer (1H-NMR). Based on spectrofotometer analysis indicated that the compound isolated is flavonoid an a flavonol.
ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN
BUNGA KUPU-KUPU RAMBAT (Bauhinia kockiana Lour.)
SKRIPSI
CINTAKU PANJAITAN
120802037
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN BUNGA KUPU-KUPU RAMBAT (Bauhinia kockiana Lour.)
SKRIPSI
Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Sains
PERSETUJUAN
Judul : Isolasi Senyawa Flavonoida Dari Daun Tumbuhan Bunga Kupu-kupu Rambat (Bauhinia kockiana Lour.)
Kategori : Skripsi
Nama Mahasiswa : Cintaku Panjaitan Nomor Induk Mahasiswa : 120802037
Program Studi : Sarjana (S1) Kimia
Departemen : Kimia
Fakultas : Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Sumatera Utara
Disetujui di
Medan, Juni 2016 Komisi Pembimbing :
Pembimbing 2 Pembimbing 1
Prof.Dr. Tonel Barus Drs. Albert Pasaribu, M.Sc NIP. 1945 0801 1974 121001 NIP. 1964 0810 1991 031002
Diketahui/Disetujui oleh
Departemen Kimia FMIPA USU Ketua
PERNYATAAN
ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN BUNGA KUPU-KUPU RAMBAT (Bauhinia Kockiana Lour.)
SKRIPSI
Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil kerja saya sendiri, kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.
Medan, Juni 2016
PENGHARGAAN
Puji syukur penulis panjatkan kehadiran Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan karunia yang begitu luar biasa karena melalui penyertaanNya skripsi ini dapat diselesaikan dalam waktu yang telah ditetapkanNya.
Ucapan terima kasih secara khusus penulis sampaikan dengan segala kerendahan hati kepada kedua orang tua tercinta penulis, Bapak M. Panjaitan dan Ibu D. Pakpahan, atas doa, dukungan dan kasihnya kepada penulis sejak mula terlahir kedunia sampai pada seorang Sarjana dan sampai selama-lamanya, serta kakak, abang dan adik tersayang Marini Panjaitan, Rimpun Panjaitan, Edwin Panjaitan, Marpen Panjaitan, Lamris Panjaitan, Tetty Panjaitan, Rejeki Panjaitan dan Roberto Panjaitan atas bantuan, dukungan dan doa yang tak henti-hentinya kepada penulis. Penulis juga menyadari bahwa skripsi ini tidak akan selesai tanpa adanya bantuan dari berbagai pihak, maka penulis juga mengucapkan terima kasih yang luar biasa kepada:
1. Bapak Drs. Albert Pasaribu, M.Sc selaku pembimbing I sekaligus Sekertaris Departemen Kimia FMIPA USU dan Bapak Prof.Dr. Tonel Barus selaku dosen pembimbing II yang telah banyak membimbing, mengajari dan memotivasi penulis selama melakukan penelitian dan penulisan skripsi. 2. Ibu Dr. Rumondang Bulan Nst, M.S selaku ketua Departemen Kimia FMIPA
USU, serta Bapak Dr. Firman Sebayang, M.S selaku dosen PA penulis dan kepada staf pengajar di Kimia FMIPA USU
3. Kepala laboratorium Bapak Lamek Marpaung, M.Phil, Ph.D atas bantuan kepercayaan dan kerja sama selama saya menjadi asisten dan kepada seluruh asisten Laboratorium Kimia Bahan Alam Hayati (Bang Andre, Bang Rickson, Bang Handes, Kak Debi, Kak Rut, Geofrey, Haposan, Jessy, Debby, Defrista, Ronal, Ferdinan, Yuni dan Parawita).
4. Seluruh teman-teman saya stambuk 2012 beserta adik-adik stambuk 2013, 2014 dan 2015 terimakasih atas seluruh dukungannya.
5. Teman-teman satu kelompok (Ka Chapryn dan David Sinaga) serta adik-adik kelompokku (Ratijul, Titin dan Mawar) terimakasih atas perhatiannya dan doa-doannya.
6. Teman-teman satu kos (Kak Dewi, Kak Awen dan Rico) terimakasih atas semua motivasinya dan doanya.
7. Teman-teman dari Koordinasi K.O GLORIA (Keynes, Sri, Lisa, Devinta, Devi, David, Bagus dan Iin) terimakasih untuk dukungan semangatnya. 8. Dan kepada semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu, terima
kasih.
Kiranya Tuhan selalu memberikan perlindungan dan kasih sayang kepada kita. Tuhan memberkati kita semua.
ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN BUNGA KUPU-KUPU RAMBAT (Bauhinia kockiana Lour)
ABSTRAK
Isolasi senyawa flavonoida yang terkandung di dalam daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat (Bauhinia kockiana Lour.) dilakukan dengan cara ekstraksi maserasi menggunakan pelarut metanol. Ekstrak metanol dipekatkan lalu dilarutkan dengan etil asetat kemudian disaring dan diuapkan hingga seluruh etil asetat menguap. Ekstrak pekat etil asetat yang diperoleh dilarutkan dengan metanol dan diekstraksi partisi dengan n-heksana. Ekstrak pekat metanol dihidrolisis dengan HCl 6% dan selanjutnya diekstraksi partisi dengan kloroform. Ekstrak pekat kloroform dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan eluen n-heksana : etil asetat (90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50 (v/v)). Fraksi dari perbandingan (60:40) v/v dimurnikan dan dikristalisasi, menghasilkan kristal kuning amorf dengan massa=33,8 mg, titik lebur 1550 C dan harga Rf=0,29. Selanjutnya senyawa yang diperoleh dianalisis dengan Spektrofotometer UV-Visibel, Inframerah (FT-IR) dan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR). Dari hasil identifikasi data spektrofotometer diindikasikan senyawa hasil isolasi adalah senyawa flavonoida golongan Flavonol.
ISOLATION OF FLAVONOID COMPOUNDS FROM LEAVES OF KUPU-KUPU RAMBAT (Bauhinia kockiana Lour)
ABSTRACT
Isolation of flavonoid compounds from the leaves of bunga kupu-kupu rambat (Bauhinia kockiana Lour.) has been done by maceration technique with methanol solvent. The concentrated methanol extract was evaporated and dissolved with ethyl acetate, filtered, concentrated and evaporated. Concentrated ethyl acetate extract was dissolved with methanol and partitioned with n-hexane solvent. Concentrated methanol extract was hydrolyzed with HCl 6% and then partitioned with chloroform solvent. Concentrated chloroform extract was separated by column chromatography with the eluent n-hexane: ethyl acetate (90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50 (v/v)) as mobile phase. The fraction from n-hexane : ethyl acetate (60:40 ) v/v was crystallized to get a pure compound, yielding a yellow crystalline amorphous with mass = 33.8 mg, melting point = 155o C and Rf = 0.29. And then, the compounds were analyzed by UV-Visible, Infrared (FT-IR) and Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer (1H-NMR). Based on spectrofotometer analysis indicated that the compound isolated is flavonoid an a flavonol.
DAFTAR ISI
Daftar Tabel viii
Daftar Gambar ix
Daftar Lampiran x
Bab 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Bab 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tumbuhan Bunga Kupu-kupu Rambat
1.1.1 Sistematika Tumbuhan Bunga Kupu-kupu Rambat 1.1.2 Morfologi dan Manfaat Tumbuhan
2.2 Senyawa Organik Bahan Alam 2.3 Metabolit Sekunder
2.4 Senyawa Flavonoida
Bab 3 METODE PENELITIAN
3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Bunga Kupu-kupu rambat 3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
3.3.6 Pemurnian
3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1iIdentifikasi dengan Spektrofotometer UV- Visible
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah (FT-IR)
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
3.4.1 Maserasi dengan menggunakan pelarut metanol Bab 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian 4.2 Pembahasan
43 43 47 Bab 5 KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan 5.2 Saran
50 50 50
DAFTAR PUSTAKA 51
DAFTAR TABEL
Nomor Lampiran
Judul Halaman
2.1 Urutan pelarut sesuai dengan efek elusinya 25 2.2 Rentangan Serapan Spektrum UV-Visible golongan
Flavonoida 28
4.1 Serapan panjang gelombang Ultraviolet-Visible
(UV-Vis) senyawa hasil isolasi 44
DAFTAR GAMBAR
Nomor Gambar
Judul Halaman
2.1 Jalur Metabolisme Flavonoid 12
2.2 2.3 2.4 2.5 2.6
Flavonoid-O-Glikosida Flavonoid-C-Glikosida Biflavonoid
Aglikon flavonoid yang aktif-optik
Diagram teknik Pemisahan Metabolit Sekunder
13 14 15 15 21 4.1 Spektrum Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Senyawa Hasil
Isolasi 43
4.2 Spektrum Inframerah (FT-IR) Senyawa Hasil Isolasi 44
4.3 Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi 45
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Lampiran
Judul Halaman
1 Gambar daun tumbuhan Bunga Kupu-kupu Rambat
(Bauhinia kockiana Lour.) 54
2 Hasil Determinasi daun tumbuhan Bunga Kupu-kupu
Rambat (Bauhinia kockiana Lour.) 55
3 Kromatogram Lapisan Tipis Ekstrak Pekat Kloroform daun tumbuhan Bunga Kupu-kupu Rambat (Bauhinia
kockiana Lour.) sebelum Kromatografi Kolom 56 4 Kromatografi Lapis Tipis ekstrak daun tumbuhan
Bunga Kupu-kupu Rambat (Bauhinia kockiana Lour)
setelah penggabungan fraksi 57
5 Kromatografi Lapis Tipis Setelah Kromatografi Kolom
yang Kedua 58
6 Kromatografi Lapis Tipissenyawa murni hasil isolasi 59 7 Spektrum Ultraviolet-Visible beberapa senyawa
Flavonoida 60
8 Ekspansi Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
pada δ=2,8-8,1 ppm 61
9 Ekspansi Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
pada δ=6,2-7,9 ppm 62
10 Ekspansi Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
pada δ=3,59-3,91 ppm 63
