POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI
PLIEK U DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN
BEBERAPA MIKROORGANISME PATOGEN
TESIS
Oleh
ANNISA AMMALIA KITI
117030033/BIO
PROGRAM PASCASARJANA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
PENGESAHAN TESIS
Judul Tesis : POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG
DIISOLASI DARI PLIEK U DALAM
MENGHAMBAT PERTUMBUHAN BEBERAPA
MIKROORGANISME PATOGEN
Nama Mahasiswa : ANNISA AMMALIA KITI
Nomor Induk Mahasiswa : 117030033
Program Studi : Magister Biologi
Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Sumatera Utara
Menyetujui
Pembimbing I Pembimbing II
Dr. Ir. Herla Rusmarilin, MP Dr. It Jamilah, M.Sc
NIP.131420019 NIP.19631012 199103 1 001
Ketua Program Studi, Dekan,
Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed Dr. Sutarman, M.Sc
POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI
PLIEK U DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN
BEBERAPA MIKROORGANISME PATOGEN
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister
Sains dalam Program Studi Magister pada Program Pascasarjana
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Sumatera Utara
Oleh
ANNISA AMMALIA KITI
117030033/BIO
PROGRAM PASCASARJANA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
PERNYATAAN ORISINALITAS
POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI
PLIEK U DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN
BEBERAPA MIKROORGANISME PATOGEN
TESIS
Dengan ini saya nyatakan bahwa saya mengakui semua karya tesis ini adalah hasil kerja saya sendiri kecuali kutipan dan ringkasan yang tiap satunya telah di jelaskan sumbernya dengan benar.
Medan, 23 Agustus 2013
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH
UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Sebagai sivitas akademika Universitas Sumatera Utara, saya yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama : Annisa Ammalia Kiti
NIM : 117030033
Program Studi : Magister Biologi Jenis Karya Ilmiah : Tesis
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada Universitas Sumatera Utara Hak Bebas Royalti Non-Eksklusif (Non-Exclusive Royalty Free Right) atas Tesis saya yang berjudul :
Potensi Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Pliek u dalam Menghambat Pertumbuhan Beberapa Mikroorganisme Patogen
Beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). DenganHak Bebas Royalti Non-Eksklusif ini, Universitas Sumatera Utara berhak menyimpan, mengalih data, menformat, mengelola dalam bentuk data-base, merawat dan mempublikasikan Tesis saya tanpa meminta izin dari saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis dan sebagai pemegang dan atau sebagai pemilik hak cipta.
Demikian pernyataan ini dibuat dengan sebenarnya.
Medan, 23 Agustus 2013
Telah diuji pada
Tanggal : 23 Agustus 2013
PANITIA PENGUJI TESIS
Ketua : Dr. Ir. Herla Rusmarilin, MP
Anggota : 1. Dr. It Jamilah, M.Sc
2. Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc
3. Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc
DAFTAR RIWAYAT HIDUP
DATA PRIBADI
Nama lengkap berikut gelar : Annisa Ammalia Kiti, S.Si, M.Si
Tempat dan Tanggal Lahir : Sigli, 17 Juli 1983
Agama : Islam
Nama Ayah : Zuki Sofyan, HA
Nama Ibu : Zuhairaty, AR, S.Pd
Nama Adik : Ghammatiki Perdana, SP
Nama Suami : Muhammad Yudi, SE
Nama Anak : Hanifah Dinny Aliyah
Alamat : Jl. Cempaka No. 3 D KPR BTN Dusun Indah Garot
Keutapang, Aceh Besar
e-mail : nissa_atjeh@yahoo.com
RIWAYAT PENDIDIKAN
SD : MIN Teladan Banda Aceh Tamat : 1995
SMP : SLTP Negeri 7 Banda Aceh Tamat : 1998
SMA : SMU Negeri 4 Banda Aceh Tamat : 2001
Strata-1 : FMIPA Biologi Unsyiah Banda Aceh Tamat : 2007
KATA PENGANTAR
Assalamu’alaikum Wr. Wb.
Alhamdulillahirabbil’alamiiin, penulis panjatkan kehadirat Allah SWT., atas segala karunia dan rahmat-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang
berjudul “Potensi Bakteri Asam Laktat yang diisolasi dari Pliek U dalam Menghambat Pertumbuhan Beberapa Mikroorganisme Patogen” dengan baik.
Salawat dan salam bagi junjungan Rasulullah Muhammad SAW., beserta keluarga dan para sahabat yang telah membimbing kita dari alam jahiliyah ke alam yang berilmu pengetahuan.
Penyusunan tesis ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains (M.Si) dalam Program Pascasarjana bidang studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Universitas Sumatera Utara (USU).
Dalam penyusunan tesis ini, berbagai pihak telah banyak memberikan bantuan, saran serta doa kepada penulis, sehingga pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa hormat dan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya, kepada :
Ibu Dr. It Jamilah M.Sc dan Ibu Dr. Ir. Herla Rusmarilin, MP selaku dosen pembimbing serta Bapak Prof. Dr. Erman Munir M.Sc dan Bapak Prof. Dr. Dwi Suryanto M.Sc selaku dosen penguji yang dengan penuh kesabaran telah banyak memberikan bimbingan, pengetahuan kepada penulis selama proses penelitian dan penyusunan tesis ini.
Kepala Laboratorium Mikrobiologi USU, Direktur Balai Teknis Kesehatan Lingkungan dan Penanggulangan Penyakit Menular (BTKL-PPM) Kelas I Medan dan Kepala Laboratorium Biologi BTKL-PPM Medan serta staf Laboratorium Biologi, Kimia dan Parasitologi pada instansi tersebut atas segala bantuan dan kemudahan yang telah diberikan selama penelitian.
Bapak Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M. Biomed selaku Ketua Program Studi Pascasarjana Biologi dan Ibu Dr. Suci Rahayu, M.Si selaku Wakil Program Studi Pascasarjana Biologi beserta seluruh staf atas segala bantuan dan kemudahan yang telah diberikan selama pendidikan.
Bunda dan Ayah yang penulis cintai, Zuhairaty, AR, S.Pd dan Zuki Sofyan, HA beserta adikku tersayang Ghammatiki Perdana yang selalu memberikan dukungan baik moril dan materil sehingga tugas akhir ini dapat terlaksana dengan baik.
Abi Muhammad Yudi atas segala cinta, doa, kesabaran, motivasi, perhatian, dan kebersamaannya dalam suka maupun duka selama bunda menuntut ilmu lagi, serta putri kecilku Hanifah Dinny Aliyah yang keceriaan dan kehangatan senyumnya selalu terpatri di hatiku walaupun sering terpisah oleh jarak dan waktu.
Atika Ningrum, Pak Samirin, kak Endang S. Gultom serta semua teman-teman Biologi angkatan 2011 atas motivasi dan doanya.
Kepada semua pihak yang telah membantu yang tidak dapat disebutkan satu persatu, penulis mengucapkan terima kasih.
Dengan keterbatasan pengalaman, pengetahuan maupun pustaka yang ditinjau, penulis menyadari bahwa tesis ini masih banyak kekurangan dan perlu pengembangan lebih lanjut agar dapat bermanfaat. Oleh sebab itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran agar tesis ini lebih sempurna serta sebagai masukan bagi penulis untuk penelitian dan penulisan karya ilmiah di masa yang akan datang. Akhir kata, penulis berharap tesis ini memberikan manfaat bagi kita semua terutama untuk pengembangan ilmu pengetahuan. Aamiiin Ya Rabbal’alamiiin.
Wassalamu’alaikum Wr. Wb.
POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI PLIEK U
DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN BEBERAPA MIKROORGANISME PATOGEN
ABSTRAK
Pliek u merupakan bahan pangan khas Provinsi Aceh, Indonesia yang dibuat dengan proses fermentasi tanpa penambahan kultur starter bakteri. Bakteri asam laktat (BAL) secara alami diduga berperan dalam fermentasi tersebut. Keberadaan BAL dalam bahan pangan fermentasi menghasilkan senyawa metabolit yang berperan sebagai antimikroba, sehingga dapat menghambat atau mengontrol pertumbuhan mikroorganisme lain seperti bakteri patogen dan perusak bahan pangan. Penelitian ini bertujuan untuk isolasi, karakterisasi isolat yang diperoleh dari pliek u dan mengetahui potensinya dalam menghambat mikroba patogen. Karakterisasi isolat dilakukan secara fenotipik dengan mengamati sifat morfologi dan fisiologi tiap isolat dan pengujian daya hambat terhadap mikroba patogen dilakukan secara invitro. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, dan NQ5 dapat menghambat pertumbuhan Escherichia coli
ATCC 25922 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923, namun tidak dapat menghambat isolat klinis Candida albicans. Penghambatan tertinggi terhadap E. coli dan Staph. aureus berturut-turut ditunjukkan oleh isolat NQ2 dengan diameter zona bening sebesar 8,5 mm dan 4 mm, sedangkan penghambatan terendah ditunjukkan oleh isolat NQ3 dan NQ4, masing-masing sebesar 1,5 mm dan 1,2 mm. Berdasarkan karakterisasi sifat morfologi dan fisiologinya, isolat NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, dan NQ5 memiliki beberapa perbedaan dengan BAL pada umumnya yaitu katalase positif, motil. Karakteristik lain dari isolat ini memiliki endospora dan Gram positif basil sehingga diduga digolongkan ke dalam genus Bacillus. Kelima isolat tersebut toleran terhadap asam dan kadar NaCl 10% serta memiliki aktivitas proteolitik, amilolitik, dan kitinolitik. Berdasarkan hal tersebut dapat disimpulkan bahwa pliek u dapat dijadikan sebagai makanan fungsional dan isolat bakteri yang diperoleh dapat dijadikan sebagai kandidat dalam formulasi probiotik dan fermentasi makanan.
POTENCY OF LACTIC ACID BACTERIA WHICH IS ISOLATED FROM PLIEK U IN INHIBITING THE GROWTH OF SEVERAL
PATHOGEN MICROORGANISMS
ABSTRACT
Pliek u is one of a distinctive food from Aceh Province, Indonesia. The fermentation process of pliek u was done without adding starter culture of bacteria. Lactic acid bacteria (LAB) naturally alleged involved in this fermentation. The presence of LAB in a fermented food produced some metabolites compound that act as antimicrobial agent, which can inhibits or control the growth of pathogenic bacteria or food spoilage. The aims of this research were to isolate, characterize bacteria isolated from pliek u and to determine their potential activity in inhibiting pathogenic microbes. The phenotypic characterization of isolates were conducted by observing the morphology and physiology of each isolate and the inhibition zone against pathogens microbial which were carried in vitro. The results showed that NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, and NQ5 isolates have inhibited activities towards the growth of Escherichia coli ATCC 25922 and Staphylococcus aureus ATCC 25923, but could not inhibit clinical isolate Candida albicans. The highest inhibition against E. coli and Staph. aureus was consecutively shown by NQ2 isolates as much as 8.5 mm and 4 mm, while the lowest inhibition shown by NQ3 and NQ4 isolates, respectively 1.5 mm and 1.2 mm. Based on cells morphological characterization and physiological properties, five isolates NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, dan NQ5 were quite different from known LAB generally, i.e. catalase positive and motile. The other characteristics are they have endospores and Gram-positive bacilli, so it is alleged classified into the genus Bacillus. All isolates were tolerant to acid and 10% NaCl concentration and they have proteolytic, amylolytic, and chitinolytic activities. In conclusion, pliek u could be used as a functional food and the isolates that has been found could be used as candidates in probiotics formulation and fermentation foods.
DAFTAR ISI
2.4 Peran BAL dalam Menghambat Pertumbuhan Mikroba Patogen
3.3.2 Penghitungan Populasi BAL dan Non BAL 3.3.3 Isolasi BAL
3.3.4 Uji Antagonis BAL Terhadap Mikroorganisme Patogen
3.4.5 Uji Pembentukan H2S dan Fermentasi gula
3.4.6 Pengaruh Suhu dan pH terhadap Pertumbuhan Isolat Terpilih
3.4.7 Pengaruh NaCl terhadap Pertumbuhan Isolat Terpilih 3.4.8 Uji Produksi Gas dari Glukosa
3.5 Identifikasi Isolat yang Diduga BAL Sampai Tingkat Genus 3.6 Uji Kualitatif Aktivitas Protease, Amilase, dan Kitinase
3.7 Pengukuran Total Asam Supernatan Isolat BAL Terpilih
DAFTAR TABEL
Nomor Judul Halaman
3.1 Reaksi-reaksi yang dapat terlihat pada media TSIA 18
4.1 Karakteristik morfologi Koloni bakteri yang diduga BAL 24 4.2 Karakteristik morfologi dan fisiologi sel isolat terpilih 35 4.3 Perbedaan dan persamaan karakteristik utama antar genus
Bacillus, Lactobacillus, dan Sporolactobacillus dengan kelima isolat yang diisolasi dari pliek u
36
DAFTAR GAMBAR
Nomor Judul Halaman
2.1 Tahap proses pembuatan pliek u. 7
4.1 Persentase total asam pada tiga tahapan pengolahan
pliek u
22
4.2 Diameter zona hambat (mm) 5 isolat BAL terhadap
E. coli ATCC 25922 dan Staph. aureus ATCC 25923
25
4.3 Uji in vitro 5 isolat BAL terpilih terhadap E. coli ATCC dan Staph. aureus ATCC 25923
27
4.4 Pewarnaan Gram isolat BAL terpilih 30
4.5 Pewarnaan spora isolat BAL terpilih 32
4.6 Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan 5 isolat BAL terplilih
41
4.7 Pengaruh pH terhadap pertumbuhan5 isolat BAL terpilih
44
4.8 Pertumbuhan isolat BAL terpilih pada MRSA+NaCl 4% 46
4.9 Zona hidrolis protease, amilase, dan kitinase 47
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Judul Halaman
A Diagram Alir Proses Pembuatan Pliek U L-1
B Diagram Alir Prosedur Penelitian L-2
C Komposisi Media Susu Skim dan Media MGMK L-3
POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI PLIEK U
DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN BEBERAPA MIKROORGANISME PATOGEN
ABSTRAK
Pliek u merupakan bahan pangan khas Provinsi Aceh, Indonesia yang dibuat dengan proses fermentasi tanpa penambahan kultur starter bakteri. Bakteri asam laktat (BAL) secara alami diduga berperan dalam fermentasi tersebut. Keberadaan BAL dalam bahan pangan fermentasi menghasilkan senyawa metabolit yang berperan sebagai antimikroba, sehingga dapat menghambat atau mengontrol pertumbuhan mikroorganisme lain seperti bakteri patogen dan perusak bahan pangan. Penelitian ini bertujuan untuk isolasi, karakterisasi isolat yang diperoleh dari pliek u dan mengetahui potensinya dalam menghambat mikroba patogen. Karakterisasi isolat dilakukan secara fenotipik dengan mengamati sifat morfologi dan fisiologi tiap isolat dan pengujian daya hambat terhadap mikroba patogen dilakukan secara invitro. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, dan NQ5 dapat menghambat pertumbuhan Escherichia coli
ATCC 25922 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923, namun tidak dapat menghambat isolat klinis Candida albicans. Penghambatan tertinggi terhadap E. coli dan Staph. aureus berturut-turut ditunjukkan oleh isolat NQ2 dengan diameter zona bening sebesar 8,5 mm dan 4 mm, sedangkan penghambatan terendah ditunjukkan oleh isolat NQ3 dan NQ4, masing-masing sebesar 1,5 mm dan 1,2 mm. Berdasarkan karakterisasi sifat morfologi dan fisiologinya, isolat NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, dan NQ5 memiliki beberapa perbedaan dengan BAL pada umumnya yaitu katalase positif, motil. Karakteristik lain dari isolat ini memiliki endospora dan Gram positif basil sehingga diduga digolongkan ke dalam genus Bacillus. Kelima isolat tersebut toleran terhadap asam dan kadar NaCl 10% serta memiliki aktivitas proteolitik, amilolitik, dan kitinolitik. Berdasarkan hal tersebut dapat disimpulkan bahwa pliek u dapat dijadikan sebagai makanan fungsional dan isolat bakteri yang diperoleh dapat dijadikan sebagai kandidat dalam formulasi probiotik dan fermentasi makanan.
POTENCY OF LACTIC ACID BACTERIA WHICH IS ISOLATED FROM PLIEK U IN INHIBITING THE GROWTH OF SEVERAL
PATHOGEN MICROORGANISMS
ABSTRACT
Pliek u is one of a distinctive food from Aceh Province, Indonesia. The fermentation process of pliek u was done without adding starter culture of bacteria. Lactic acid bacteria (LAB) naturally alleged involved in this fermentation. The presence of LAB in a fermented food produced some metabolites compound that act as antimicrobial agent, which can inhibits or control the growth of pathogenic bacteria or food spoilage. The aims of this research were to isolate, characterize bacteria isolated from pliek u and to determine their potential activity in inhibiting pathogenic microbes. The phenotypic characterization of isolates were conducted by observing the morphology and physiology of each isolate and the inhibition zone against pathogens microbial which were carried in vitro. The results showed that NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, and NQ5 isolates have inhibited activities towards the growth of Escherichia coli ATCC 25922 and Staphylococcus aureus ATCC 25923, but could not inhibit clinical isolate Candida albicans. The highest inhibition against E. coli and Staph. aureus was consecutively shown by NQ2 isolates as much as 8.5 mm and 4 mm, while the lowest inhibition shown by NQ3 and NQ4 isolates, respectively 1.5 mm and 1.2 mm. Based on cells morphological characterization and physiological properties, five isolates NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, dan NQ5 were quite different from known LAB generally, i.e. catalase positive and motile. The other characteristics are they have endospores and Gram-positive bacilli, so it is alleged classified into the genus Bacillus. All isolates were tolerant to acid and 10% NaCl concentration and they have proteolytic, amylolytic, and chitinolytic activities. In conclusion, pliek u could be used as a functional food and the isolates that has been found could be used as candidates in probiotics formulation and fermentation foods.
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang
Pohon kelapa (Cocos nucifera L.) telah dikenal sejak ratusan tahun yang lalu sebagai
pohon kehidupan karena telah menyediakan berbagai macam kebutuhan penting bagi
manusia. Kelapa sudah dimanfaatkan sebagai makanan, minuman, bahan untuk
membangun rumah, bahan bakar dan penggunaannya dalam industri. Selain itu juga
dapat dimanfaatkan sebagai obat (Conrado, 2000). Di daerah Provinsi Aceh, masyarakat
mengolah daging buah kelapa menjadi minyak pliek u (minyeuk simplah dan minyeuk
brok) yang residu akhirnya menjadi pliek u.
Pliek u merupakan bahan pangan khas yang berasal dari Provinsi Aceh yang
secara turun-temurun telah digunakan sebagai bumbu masak, sambal dan pakan ternak.
Secara tradisional pliek u diolah dari daging buah (mesocarp)kelapa yang difermentasi
selama 15 – 20 hari. Pada umumnya pembuatan produk tersebut meliputi beberapa tahapan seperti proses fermentasi, pemerasan dan penjemuran di bawah sinar matahari
(Nurliana et al., 2002; Nurliana et al., 2008, 2009, Nurliana, 2009; Nurliana dan
Sudirman, 2009; Darsono et al., 2011a, 2011b; dan Mustaqimah et al., 2011). Makanan
tradisional ini dihasilkan melalui fermentasi tanpa penambahan kultur starter atau
Berdasarkan penelitian Nurliana (2002), diduga fermentasi pada bahan makanan
ini disebabkan oleh bakteri asam laktat. Supernatan isolat BAL yang diperoleh diduga
menghasilkan senyawa bioaktif (bakteriosin) karena mampu menghambat pertumbuhan
bakteri Listeria monocytogenes.
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan salah satu mikroorganisme yang berperan
dalam fermentasi berbagai jenis makanan. BAL telah lama dikenal dan digunakan oleh
manusia dalam proses pengolahan pangan yang menghasilkan produk akhir dengan
kualitas yang dapat lebih diterima daripada bahan bakunya. Bakteri ini memberikan
kontribusi terhadap karakteristik yang khas seperti aroma, rasa, tekstur dan masa simpan
produk yang lebih lama. Bila ditinjau dari nilai gizinya, produk fermentasi menghasilkan
komponen-komponen nutrisi yang lebih mudah dicerna melalui perombakan serta
diproduksinya senyawa-senyawa yang bermanfaat oleh mikroorganisme yang terlibat di
dalamnya (Wirawati, 2002; Jay et al., 2005; Hutkins, 2006).
BAL yang diisolasi dari berbagai makanan tradisional telah dilaporkan dapat
menghambat pertumbuhan mikroba patogen. Lactobacillus plantarum ATCC 25927
yang diisolasi dari ogi, makanan tradisional yang difermentasi dari jagung dapat
menghambat Candida albicans dengan zona hambatan 22 mm (Oluwafemi dan
Adetunji, 2011). Bettache et al. (2012) menyatakan bahwa hasil isolasi BAL pada dhan,
mentega susu fermentasi tradisional yang berasal dari Negara Algeria Barat ditemukan
genus Leuconostoc sebanyak 8 isolat, Lactococcus 13 isolat dan 35 isolat Lactobacillus.
Ketiga genus tersebut mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli,
Staphylococcus aureus dan Listeria innocua. Selanjutnya BAL yang diisolasi dari
berbagai makanan tradisional di Indonesia seperti gatot, growol, tempoyak, peda,
bekasam, tape, tempe, wadi dan terasi umumnya didominasi oleh L. plantarum,
Streptococcus thermophillus, dan Pediococcus acidilactici. Dari hasil skrining, diketahui
yang dapat menghambat berbagai jenis bakteri patogen yang diujikan (Rahayu et al.,
1996, 2000; Wirawati, 2002; Rahayu, 2003; Wikandari et al., 2012; dan Putri et al.,
2012).
Keberadaan BAL dalam bahan pangan yang mengalami fermentasi
menghasilkan senyawa metabolit yang berperan sebagai antimikroba, sehingga dapat
menghambat atau mengontrol pertumbuhan mikroorganisme lain seperti bakteri patogen
dan perusak bahan pangan. BAL menghasilkan komponen antimikroba seperti asam
organik (asam laktat, asam asetat, asam propionat), hidrogen peroksida dan bakteriosin
(Ray dan Bhunia, 2008; Amezquita dan Brashears, 2002; dan Vuyst dan Leroy, 2007).
Sampai saat ini belum ada informasi yang jelas mengenai jenis BAL yang berperan
dalam fermentasi pliek u. Oleh karena itu berdasarkan uraian di atas, peneliti tertarik
untuk mengisolasi dan mengidentifikasi BAL dari pliek u dan menguji potensinya dalam
menghambat pertumbuhan beberapa mikroorganisme patogen.
1.2Perumusan Masalah
Berdasarkan hasil penelitian Nurliana (2009), melalui ekstraksi menggunakan
pelarut etanol dan heksan telah diketahui bahwa pliek u mengandung senyawa
antimikrob serta berpeluang sebagai makanan kesehatan. Namun belum diketahui secara
pasti mikroba yang berperan dalam fermentasi pliek u, khususnya jenis bakteri asam
laktat. Oleh karena itu telah dikaji lebih lanjut mengenai jenis bakteri asam laktat yang
berperan dalam proses fermentasi pliek u dan pengujian aktivitas antagonisnya terhadap
1.3Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk (1) mengisolasi dan mengkarakterisasi BAL dari
pliek u pada beberapa tahapan pengolahan (2) mengetahui potensi BAL yang diisolasi
dari pliek u dalam menghambat beberapa mikroorganisme patogen seperti Escherichia
coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, dan isolat klinis Candida
albicans (3) mengetahui Total Plate Count (TPC) BAL dan Non-BAL dari pliek u.
1.4Hipotesis
Hipotesis yang diajukan ialah bakteri asam laktat yang diisolasi dari pliek u
berpotensi menghambat pertumbuhan beberapa mikroorganisme patogen.
1.5Manfaat Penelitian
Melalui penelitian ini diharapkan dapat memperoleh jenis-jenis bakteri asam
laktat asal pliek u yang berpotensi untuk menghambat pertumbuhan beberapa
mikroorganisme patogen. Informasi yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat
mendukung upaya pengembangan dan konsumsi makanan tradisional Aceh, khususnya
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Fermentasi Pliek u
Selama lebih kurang sepuluh ribu tahun manusia telah mengkonsumsi makanan
fermentasi. Sepanjang sejarah, fermentasi merupakan salah satu teknik untuk
memproduksi makanan yang diawetkan dengan baik dan aman dikonsumsi. Sampai saat
ini, fermentasi makanan masih menjadi salah satu teknik yang paling populer. Sekitar
sepertiga makanan yang dikonsumsi ialah makanan yang difermentasi. Fermentasi
bertujuan untuk mengawetkan makanan yang mudah rusak sehingga diperoleh produk
dengan kualitas yang lebih baik dari bahan bakunya (Hutkins, 2006). Sejak fermentasi
makanan bermula, nenek moyang kita mengakui bahwa makanan fermentasi tidak hanya
memiliki rasa yang segar dan khas, tetapi juga tahan lebih lama selama penyimpanan
serta mengurangi kemungkinan terserangnya penyakit yang disebabkan oleh
kontaminasi mikroorganisme melalui makanan. Melalui proses fermentasi, berbagai
jenis bahan pangan dapat diawetkan secara alami menjadi beragam produk yang
kualitasnya lebih baik daripada bahan bakunya, sehingga hal ini menjadi alasan utama
makanan fermentasi begitu populer di kalangan masyarakat peradaban dahulu yang
berlokasi di daerah bertemperatur tinggi (Ray dan Bhunia, 2008).
Menurut Ray dan Bhunia (2008), pengetahuan mengenai keamanan dan stabilitas
makanan fermentasi telah digunakan selama berabad-abad dan membantu peneliti untuk
memahami dasar-dasar ilmiahnya. Saat ini telah diketahui bahwa mikroba yang terkait
sifat antimikroba seperti asam organik, aldehid, keton, alkohol, diasetil, etanol, hidrogen
peroksida, reuterine, dan bakteriosin, serta adanya senyawa-senyawa lain yang belum
dapat diidentifikasi. Semakin meningkatnya minat penggunaan antimikroba dalam
makanan nonfermentasi (nonfermented foods) yang bertujuan untuk meningkatkan
stabilitas dan keamanan pangan. Beberapa hasil fermentasi mikroba seperti asam laktat
dan asam asetat (cuka) telah sejak lama digunakan dalam berbagai jenis makanan. Selain
itu beberapa jenis khamir telah ditemukan dapat menghambat pertumbuhan kapang pada
buah-buahan dan sayur.
Pliek u merupakan salah satu makanan khas dari Aceh yang dihasilkan dari
fermentasi daging buah kelapa secara tradisional. Selama berabad-abad pengetahuan
mengenai teknologi fermentasi tradisional biasanya diturunkan dari satu generasi ke
generasi selanjutnya. Produk fermentasi pliek u menjadi bagian yang tidak terpisahkan
dari menu makanan sehari-hari masyarakat Aceh, biasanya pliek u dimanfaatkan sebagai
bumbu untuk memasak sayur (gulé pi’u), sambal dan bumbu rujak. Diduga selama
proses pengolahannya terjadi berbagai perubahan sehingga menghasilkan berbagai
metabolit yang mempunyai aktivitas antimikrob. Senyawa tersebut dapat terbentuk dari
bahan baku ataupun juga dihasilkan oleh mikroba selama proses fermentasi, karena
proses fermentasi makanan erat kaitannya dengan mikroorganisme atau enzim.
Senyawa- senyawa yang dihasilkan secara alami oleh mikroba tersebut dapat diekstraksi
dan dipurifikasi, serta dapat digunakan untuk mengawetkan makanan dan sebagai bahan
antimikroba (Nurliana, 2009).
Berdasarkan penelitian Nurliana (2009), proses pembuatan pliek u (Gambar 2.1)
dilakukan selama lebih kurang 20 hari dengan cara pemeraman (fermentasi secara
tradisional) daging buah kelapa tanpa menambahkan mikroba apapun. Menurut
masyarakat Aceh, produk ini diajarkan secara turun-temurun dari orang tua mereka dan
pemeraman buah kelapa, pemeraman daging buah kelapa, dan pemeraman serta
penjemuran daging buah kelapa.
Pada tahap pertama, buah kelapa dibelah (tidak sampai terbuka) dan airnya
dibuang, kemudian dibiarkan selama 4 – 5 hari. Setelah itu daging buah kelapa dikukur dan ditempatkan dalam wadah tertutup. Selanjutnya dibiarkan selama 4 – 5 hari pada suhu kamar (29 – 36 ºC) yang tidak terpapar cahaya. Tahap ini merupakan tahap kedua. Minyak yang terbentuk pada tahap ini diambil, minyak tersebut dikenal dengan minyeuk
simplah atau minyeuk reutek. Tahap selanjutnya adalah tahap ketiga. Pada tahap ini
Gambar 2.1 Tahap proses pembuatan pliek u. (A) buah kelapa yang sudah
dibuang airnya dan dibiarkan selama 4-5 hari; (B,C,D) daging buah kelapa yang sudah dikukur dan dibiarkan 5 hari sampai keluar minyak (minyeuk simplah); (E,F,G,H,I) proses penjemuran, pemeraman dan pemerasan untuk memperoleh minyak (minyeuk brok) dan pliek u (Nurliana, 2009)
A
B
C
D
E
F
dilakukan penjemuran, pemeraman (fermentasi) dan pengepresan terhadap residu yang
dihasilkan pada tahap kedua, yang dilakukan selama lebih kurang 5 hari pada suhu
kamar (29 – 36 ºC). Minyak yang diperoleh pada tahap ini disebut minyeuk brok, sedangkan residu yang diperoleh disebut pliek u atau patarana, namun masyarakat
umumnya menyebut pliek u. Secara organoleptik pliek u ini mudah dikenal karena
warna, bau dan rasanya yang khas (Nurliana, 2009). Secara singkat proses pembuatan
pliek u dapat dilihat pada Lampiran A. Menurut Nurliana (2009), pliek u masih
mengandung lemak, walaupun kadar lemaknya lebih rendah dibandingkan kadar lemak
dalam daging buah kelapa. Berdasarkan analisis proksimat, komposisi kimia yang
terdapat pada pliek u terdiri dari air 18.97%, lemak 4.94%, protein 23.56%, karbohidrat
47.44%, serat kasar 15.72% dan total abu 8.34%.
2.2 Senyawa Antimikroba Pliek U
Berdasarkan penelitian Nurliana et al. (2002), diketahui bahwa ekstrak metanol pliek u
kering dan pliek u basah menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Bacillus subtilis dan
empat strain enteropatogenik E. coli (EPEC) dengan aktivitas tergolong sedang dan
sangat aktif berturut-turut yaitu 6.67 – 10.33 mm dan 6.00 – 7.33 mm. Selanjutnya Nurliana (2009) menyebutkan bahwa ekstrak kasar etanol pliek u berpotensi sangat aktif
sebagai senyawa antimikrob dalam menghambat beberapa strain bakteri seperti
B. subtilis, Stap. aureus, E. coli, Salmonella enteritidis, B. cereus, Pseudomonas
aeruginosa, P. fluorescens dan khamir C. albicans.
Nurliana (2009) menyatakan bahwa, berdasarkan hasil uji GC-MS dapat
diidentifikasi 22 komponen senyawa kimia dari ekstrak kasar etanol pliek u. Hampir
sebagian besar senyawa yang terkandung dalam ekstrak kasar etanol adalah asam lemak
dan derivatnya, seperti asam kaprat, asam laurat, asam mirisitat, asam palmitat, asam
palmitoleat, asam stearat, asam oleat, asam linoleat, 7-10-13-asam heksadekatienoat,
Nurliana juga menambahkan bahwa ekstrak kasar etanol (EEP) pliek u berpotensi
sebagai senyawa antimikrob dengan konsentrasi hambatan minimal (MIC) EEP adalah
2.5 – 10 mg/ml dan konsentrasi mikrobisida (MMC) EEP adalah 10 – 20 mg/ml.
2.3 Bakteri Asam Laktat (BAL)
Bakteri asam laktat didefinisikan sebagai sekelompok bakteri Gram positif batang dan
kokus yang memproduksi asam laktat, yang memiliki berbagai karakteristik biokimia,
fisiologis dan genetik yaitu bersifat anaerob fakultatif, katalase negatif, fermentatif, tidak
membentuk spora (non-sporeforming), low mol % G + C, non-motile, dan toleran
terhadap asam. Selain itu dalam hal memperoleh energi, BAL diklasifikasikan sebagai
heterotrophic chemoorganotrophs, yang berarti bahwa BAL membutuhkan karbon
organik sebagai sumber karbon dan energinya (Hutkins, 2006).
Bakteri asam laktat sering digambarkan sebagai sekelompok bakteri yang
tergolong rewel (fastidious), hal ini disebabkan karena persyaratan untuk
pertumbuhannya harus memenuhi nutrisi yang kompleks. Ada spesies BAL tertentu
yang dapat tumbuh hanya pada lingkungan yang kaya nutrisi, yaitu pada media yang
diperkaya dengan kondisi optimal. Namun, ada juga spesies BAL yang cukup fleksibel
sehubungan dengan lingkungan pertumbuhannya yang tetap dapat tumbuh cukup baik
bahkan ketika komposisi nutrisinya kurang ideal. Selain itu, sebenarnya ada beberapa
BAL yang dikenal mempunyai kemampuan untuk tumbuh pada lingkungan yang tidak
ramah (inhospitable), termasuk yang sering dijumpai dalam makanan fermentasi. Hal ini
menunjukkan bahwa BAL dapat tumbuh dan menempati berbagai macam habitat yang
meliputi tidak hanya material tanaman, susu dan daging, tetapi juga garam (salt brines),
makanan dengan pH rendah, maupun lingkungan yang mengandung etanol (Hutkins,
Karakteristik BAL yang paling relevan kemungkinan yang berkaitan dengan
metabolisme nutrien. Secara khusus, alasan utama mengapa BAL digunakan dalam
makanan yang difermentasi ialah karena kemampuannya untuk memetabolisme gula
yang menghasilkan asam laktat dan produk akhir lainnya. Ada dua jalur fermentasi yang
terjadi, yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. Pada jalur homofermentatif, lebih
dari 90% substrat berupa gula diubah secara eksklusif menjadi asam laktat. Sebaliknya
hasil dari jalur heterofermentatif menghasilkan sekitar 50% asam laktat, dan sisanya
ialah asam asetat, etanol, dan karbon dioksida. Metabolisme BAL dapat terjadi melalui
salah satu jalur, yaitu BAL yang bersifat homofermentatif atau obligat heterofermentatif,
meskipun ada beberapa jenis BAL yang memiliki sarana metabolisme untuk melakukan
keduanya (fakultatif homofermentatif) (Hutkins, 2006).
Spesies-spesies anggota BAL tidak bersifat patogen, hanya sedikit spesies saja
yang dapat menyebabkan penyakit. BAL merupakan mikroba yang tergolong ke dalam
Generally Recognized as Safe status. Jenis-jenis BAL tergolong ke dalam genus
Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Oenococcus, Enterococcus,
dan Leuconostoc (Mozzi et al., 2010).
2.4 Peran BAL dalam Menghambat Mikroba Patogen
Menurut Ray dan Bhunia (2008), BAL berperan sebagai pengawet bahan pangan. Proses
ini melibatkan penambahan sel bakteri BAL dalam jumlah besar seperti Lactococcus
lactis, beberapa jenis Lactobacillus, dan beberapa spesies Pediococcus yang bersifat
mesofilik untuk mengendalikan bakteri pembusuk dan patogen selama penyimpanan di
dalam lemari es pada suhu 5 ºC atau di bawah 5 ºC. Pertumbuhan bakteri pembusuk dan
patogen psikotrofik dilaporkan dapat dikendalikan dengan adanya BAL mesofilik
tersebut. Pertumbuhan beberapa bakteri pembusuk dan patogen pada suhu yang sedikit
lebih tinggi (10-12 °C) juga berkurang. Studi dilakukan dengan menambahkan BAL
asap untuk menghambat bakteri Clostridium botulinum, Salmonella serovars, dan Stap.
aureus. Pada susu mentah, daging, telur dan makanan laut yang disimpan dalam lemari
pendingin ditambahkan beberapa jenis BAL seperti Lactobacillus, Lactococcus, dan
Leuconostoc untuk mengontrol pertumbuhan dari bakteri pembusuk psikrofilik seperti
Pseudomonas spp. Pada beberapa penelitian dilaporkan bahwa pertumbuhan bakteri
psikotrof dihambat oleh 90% atau lebih BAL selama 4 – 10 hari penyimpanan dalam lemari pendingin. Penambahan BAL dalam susu mentah juga meningkatkan produksi
keju dan memperpanjang umur simpannya. Kemampuan penghambatan ini disebabkan
pelepasan senyawa antimikroba intraseluler, seperti asam organik, bakteriosin dan
hidrogen peroksida dari sel BAL.
Berdasarkan penelitian Petrova et al. (2009), BAL dari genus Lactobacillus
memiliki kemampuan potensial dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen,
termasuk isolat-isolat yang resisten terhadap antibiotik seperti Staphylococcus aureus
MRSA. Selanjutnya Muhialdin et al. (2012) menyebutkan bahwa, 3 isolat BAL yang
terdiri dari L. fermentum Te007, P. pentosacues Te010, L. pentosus G004 yang diisolasi
dari tempe, tempoyak, guava dan pisang dapat menghambat pertumbuhan bakteri
patogen seperti B. subtilis, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, E.coli,
Stap. aureus, S. epidermidis, Shigella sonnei, Klebsiella pneumonia, dan
S. tyhpimurium. Ketiga isolat BAL tersebut memiliki aktivitas penghambatan dengan
spektrum yang bervariasi dari sedang hingga kuat. Isolat-isolat bakteri patogen tersebut
BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Februari sampai dengan Agustus 2013 di
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA)
Biologi Universitas Sumatera Utara (USU) dan Laboratorium Biologi Balai Teknis
Kesehatan Lingkungan dan Pemberantasan Penyakit Menular (BTKL dan PPM) Medan.
3.2 Alat dan Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah pliek u tahap I, II dan III yang
sudah berumur 2 hari yang diperoleh dari industri rumah tangga yang berlokasi di Desa
Geundering Kecamatan Darul Imarah, Aceh Besar. Pliek u tersebut dibuat melalui 3
tahapan berdasarkan penelitian Nurliana (2009), namun setiap tahapan masing-masing
dilakukan selama 4 hari. Medium untuk isolasi, identifikasi, uji antagonis serta uji
biokimia lainnya terdiri dari medium de man rogosa sharpe agar (MRSA), nutrient
broth (NB), triple sugar iron agar (TSIA), sulfide indole motility (SIM) dan mueller
hinton agar (MHA), melacyt green, media agar susu skim, media garam minimum kitin
(MGMK), starch agar (SA). Komposisi dan cara pembuatan media MGMK dan susu
skim dapat dilihat pada Lampiran C. Bahan untuk pewarnaan Gram ialah kristal violet,
akuades, lugol, alkohol 95%, dan safranin. Kultur mikroorganisme uji yang digunakan
ialah E. coli ATCC 25922, Staph. aureus ATCC 25923, dan isolat klinis C. albicans
acetate buffer pH 3.5, pH 4, pH 4.5, pH 5, pH 5,5, dan phosphate buffer pH 6, pH 6.5,
pH 7, pH 7.5, dan pH 8. Pembuatan buffer dapat dilihat pada Lampiran D.
Alat-alat yang digunakan terdiri dari jarum ose, labu erlenmeyer, silinder ukur,
gelas kimia, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung, pipet serologi (ukuran 0.1 ml, 1 ml,
dan 10 ml), propipet, corong, kaca benda, bunsen, autoklaf (STURDY SA-300VF),
blank disc (OXOID), mikroskop (OLYMPUS), timbangan digital (OHAUS), lemari
pendingin (DENPOO), oven (MEMMERT), BR-2000 vortexer (BIO-RAD), hot plate
stirrer (LabTech), inkubator (LabTech) dan Laminar Air Flow (ESCO), cary 50
uv-visible spectrophotometer (VARIAN Inc.), mechanical hand counter, dan sentrifus
(SORVALL Biofuge Primo R).
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini terbagi menjadi 7 tahapan, yaitu : (1) Pengukuran total asam pada sampel
pliek u tahap pemerosesan I, II, dan III, (2) Penghitungan populasi BAL dan non-BAL
(3) Isolasi BAL dari pliek u tahap I, II, dan III (4) Uji antagonis BAL terhadap
mikroorganisme patogen (5) Karakterisasi isolat bakteri potensial berdasarkan sifat
morfologis, fisiologis dan biokimia (6) Identifikasi BAL sampai tingkat genus
menggunakan Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (7) Uji kualitatif enzim
protease, amilase, dan kitinase. Diagram alir prosedur kerja dapat dilihat pada lampiran
B.
3.3.1 Pengukuran Total Asam yang Diduga Asam Laktat
Pengukuran total asam dilakukan dengan metode Association of Official Analytical
Chemists (A.O.A.C) (Akmar, 2006; Candra, 2006). Sebanyak 10 g sampel pliek u tahap
I, II dan III dihancurkan dengan menggunakan mortar. Sampel yang telah homogen
sampel didiamkan selama 30 menit dan diaduk. Larutan yang berisi sampel tersebut
disaring dan dipipet sebanyak 10 ml yang kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass.
Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 2-3 tetes fenolftalein dan dititrasi dengan NaOH
0,1 N sampai warna berubah menjadi merah muda. Konsentrasi total asam tertitrasi
dihitung sebagai persen asam laktat yang dihitung berdasarkan rumus:
% Total Asam = V NaOH x N NaOH x 90 x FP x 100% Bobot sampel x 1000
Keterangan :
V NaOH = Volume NaOH yang terpakai
N NaOH = Normalitas NaOH (0,1 N)
90 = Berat molekul asam laktat
FP = Faktor Pengenceran (10)
Bobot sampel = 10 g
3.3.2 Penghitungan Populasi BAL dan Non BAL
Penghitungan jumlah BAL dan non BAL dilakukan dengan metode cawan sebar
(Lay,1994; Cappucino dan Sherman, 1999) dengan modifikasi. Dibuat pengenceran 10-1
sampai dengan 10-7 untuk sampel pliek u tahap III. Sebanyak 0.1 ml dari pengenceran
10-3 sampai 10-7 disebar ke dalam cawan petri, untuk BAL ditumbuhkan pada media
MRSA dan untuk non BAL pada media PCA yang diinkubasi selama 48 jam pada suhu
37°C. Dihitung koloni pada cawan yang mempunyai 30-300 koloni dengan
menggunakan mechanical hand counter. Setelah itu dihitung jumlah sel mikroorganisme
hidup dengan mengalikan faktor pengenceran dengan jumlah koloni yang dinyatakan
3.3.3 Isolasi BAL
Isolasi BAL dilakukan dengan metode cawan sebar, yaitu dengan mensuspensikan 1 g
pliek u ke dalam 9 ml NaCl fisiologis 0.85% secara aseptis, kemudian pengenceran 10-4
-10-7, diambil 0.1ml dan disebar ke cawan petri steril yang berisi media MRSA dengan
dua kali ulangan. Setelah itu diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37° C dan diamati
pertumbuhan koloninya (Cappuccino dan Sherman, 1999) .
Koloni yang terpisah dengan bentuk dan ukuran yang berbeda diambil
menggunakan jarum ose steril dan digoreskan pada MRSA padat dan diinkubasi pada
suhu 37 °C selama 2 hari. Penggoresan dilakukan sampai diperoleh koloni yang
seragam. Koloni yang telah murni dipilih berdasarkan sifat morfologi koloninya sebagai
karakterisasi awal. Selanjutnya kultur dipindahkan ke dalam 1 tabung NB yang
mengandung 0.2% agar dan CaCO3 untuk digunakan sebagai kultur stok, sedangkan
kultur kerja dibuat dalam agar miring yang disimpan dalam lemari es. Kultur stok
diperbaharui setiap 3 bulan sekali.
3.3.4 Uji Antagonis BAL Terhadap Mikroorganisme Patogen
Isolat-isolat yang telah murni diujikan daya hambatnya terhadap mikroorganisme
patogen secara in vitro. Pada uji ini lempengan agar MHA disemai dengan suspensi
mikroorganisme yang akan diuji (E. coli ATCC 25922, Staph. aureus ATCC 25923, dan
C. albicans) dengan konsentrasi 108 sel/ml menggunakan cotton swab steril. Isolat yang
sudah ditandai diinokulasi dengan cara ditotolkan menggunakan tusuk gigi steril pada
medium MHA. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 °C selama 72 jam. Pengamatan
dilakukan dengan mengukur zona bening menggunakan jangka sorong (Lay, 1994; dan
3.3.5 Karakterisasi Isolat Potensial
Isolat-isolat yang memiliki daya hambat terhadap mikroba patogen selanjutnya
dikarakterisasi sifat morfologis selnya dengan pewarnaan Gram (diamati bentuk dan
penataan selnya) dan pewarnaan spora, uji fisiologis (pertumbuhan pada pH, suhu, dan
toleransi terhadap konsentrasi NaCl yang berbeda), dan uji biokimia (uji katalase,
motilitas, uji H2S, fermentasi gula dan pembentukan gas dari glukosa) (Wirawati, 2002;
Bulut, 2003; Yavuzdurmaz, 2007; Putri et al.2012).
3.4 Prosedur Analisis
3.4.1 Pewarnaan Gram
Suspensi bakteri diambil secara aseptis dan dibuat ulasan tipis di atas gelas benda
yang sebelumya sudah ditetesi akuades dan dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan
preparat ulas di atas api. Pada lapisan tipis tersebut ditetesi zat warna kristal violet dan
dibiarkan selama 1 menit, kemudian dibilas dengan akuades selama 5 detik dengan cara
menjepit gelas benda dengan pinset pada posisi miring. Sisa air yang tertinggal pada
gelas benda dibuang dan ditetesi dengan lugol serta dibiarkan selama 1 menit, dicuci
kembali dengan akuades selama 5 detik, kemudian dengan alkohol 95% dan dibiarkan
selama 10 – 20 detik. Setelah itu dicuci kembali dengan akuades selama 5 detik dan ditetesi dengan zat warna safranin, dibiarkan selama 15 detik. Gelas benda dibilas
dengan akuades selama 5 detik dan dikering anginkan. Preparat kemudian diamati di
bawah mikroskop yang telah diolesi dengan minyak immersi. Melalui pengamatan
secara mikroskopik ini, maka dapat ditentukan bentuk sel bakteri dan
pengelompokannya. Bakteri Gram positif akan ditunjukkan dengan warna ungu dan
bakteri Gram negatif akan ditandai dengan warna merah atau merah muda (Seeley dan
3.4.2 Pewarnaan Spora
Pewarnaan spora dilakukan dengan membuat preparat ulas dari isolat berumur
72 jam. Dipanaskan preparat ulas yang sudah diberi zat warna hijau malakit, kemudian
dilakukan pemanasan dengan menempatkan kertas saring di atas preparat ulas, diberi zat
warna malakit hijau kemudian didinginkan selama 1 menit, dibuang kertas saring
kemudian dicuci dengan air. Selanjutnya preparat ditetesi dengan zat warna safranin
selama 60 detik. Terakhir dilakukan pencucian preparat dengan air, dikeringkan, diamati
di bawah mikroskop (Lay, 1994 dan Waluyo, 2010).
3.4.3 Uji Katalase
Satu loop isolat bakteri diambil secara aseptis dan dipindahkan pada gelas benda.
Selanjutnya preparat ditetesi dengan larutan H2O2 3%. Adanya enzim katalase ditandai
dengan terbentuknya gelembung-gelembung seperti busa yang menandakan uji katalase
positif, sebaliknya bila tidak terbentuk gelembung seperti busa, maka uji katalase
negatif. Reaksi ini mengindikasikan ada tidaknya pembentukas gas CO2 (Wirawati,
2002; Morello et al., 2003).
3.4.4 Uji Motilitas
Pengujian motilitas bakteri dilakukan dengan cara sebagai berikut: secara aseptis
dengan menggunakan jarum ose yang lurus bagian ujungnya, isolat bakteri ditusukkan
ke dalam media SIM. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 °C selama 48 jam. Bila
pertumbuhan menyebar, maka bakteri tersebut bersifat motil dan bila pertumbuhan
bakteri tidak menyebar, hanya berupa garis saja (hanya tumbuh terbatas pada bekas
tusukan jarum inokulasi), maka bakteri tersebut bersifat non motil (Lay, 1994; Morello
3.4.5 Uji Pembentukan H2S dan Fermentasi Gula
Pengujian ini menggunakan media triple sugar iron agar (TSIA). Uji tersebut
bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasi glukosa, laktosa
atau sukrosa dan pembentukan gas dari glukosa dan produksi H2S. Isolat yang akan diuji
diinokulasikan pada agar miring TSIA dengan cara membuat goresan pada media agar
miring tersebut dan selanjutnya ditusukkan sampai ke bawah agar. Inkubasi pada suhu
37 °C selama 48 jam (Lay, 1994). Reaksi-reaksi yang terjadi pada media TSIA dapat
dilihat pada Tabel 3.1.
Tabel 3.1 Reaksi-reaksi yang dapat terlihat pada media TSIA
Bagian bawah agar Bagian atas agar
Keterangan
3.4.6 Pengaruh Suhu dan pH Terhadap Pertumbuhan Isolat Terpilih
Pengaruh suhu: isolat bakteri terpilih diinokulasikan pada tabung berisi media
NB dan diinkubasikan pada suhu 10, 30, 45 dan 50°C selama 3 hari. Adanya
pertumbuhan ditandai dengan kekeruhan pada tabung dan diukur optical density (OD)
Pengaruh pH: sebanyak 1 ml kultur ditumbuhkan pada medium NB dengan
penambahan acetate buffer pH 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, dan phosphate buffer pH 6, 6.5, 7, 7.5,
8, diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 hari. Adanya pertumbuhan ditandai dengan
kekeruhan pada tabung dan diukur optical density (OD) pada 600 dengan
spektrofotometer (Lay, 1994; Wirawati, 2002; Santoso, 2008 dengan modifikasi).
3.4.7 Pengaruh NaCl terhadap Pertumbuhan Isolat Terpilih
Toleransi isolat terpilih terhadap NaCl dilakukan dengan menotolkan isolat yang
diperoleh pada media MRSA yang sudah ditambahkan NaCl dengan konsentrasi yang
berbeda yaitu 2%, 4%, 6%, 6,5%, 8%, dan 10%. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37°C
selama 48 jam dan diamati pertumbuhannya dengan mengamati besar kecilnya koloni
(Bulut, 2003; Yavuzdurmaz, 2007).
3.4.8 Uji Produksi Gas dari Glukosa
Pengujian ini dilakukan untuk membedakan antara BAL homofermentatif dan
BAL heterofermentatif. Sebanyak 1 ml kultur BAL yang berumur 24 jam dipipetkan ke
dalam tabung reaksi berisi tabung Durham dan media NB yang ditambahkan 2%
glukosa. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 5 hari. Tabung Durham
digunakan untuk melihat terbentuknya gas atau tidak. Tabung yang menghasilkan gas
menunjukkan adanya produksi gas dari glukosa yang menandakan isolat tersebut bersifat
heterofermentatif, tabung yang tidak terbentuk gas menandakan isolat bersifat
homofermentatif (Bulut, 2003; Yavuzdurmaz, 2007).
3.5 Identifikasi Isolat yang Diduga BAL Sampai Tingkat Genus
Data yang telah diperoleh dari hasil pengujian karakterisasi, isolat bakteri
Pendugaan jenis bakteri dilakukan dengan menggunakan metode profile matching
berdasarkan Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Vos, 2009 dan Helen, 2012).
3.6 Uji Kualitatif Aktivitas Protease, Amilase dan Kitinase
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas proteolitik, amilolitik, dan
kitinolitik dari isolat yang diperoleh. Analisis hidrolisis protein, amilum, dan kitin
dilakukan dengan menumbuhkan isolat yang diperoleh pada medium susu skim (Lay,
1994; Smita et al., 2012), SA (Putri et al. 2012), dan MGMK (Dewi, 2008). Selanjutnya
diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37°C. Isolat-isolat yang menghasilkan protease,
amilase dan kitinase akan menunjukkan zona bening pada masing-masing permukaan
media. Diameter zona bening yang terbentuk diukur untuk melihat besarnya aktivitas
enzim tersebut secara kualitatif.
3.7 Pengukuran Total Asam Supernatan Isolat BAL Terpilih
Isolat yang telah disegarkan pada media MRSA kemudian diambil satu ose
dan dimasukkan ke dalam media NB sebagai inokulum. Inokulum diinkubasi pada
suhu 37°C pada shaker water bath selama 18 jam. Sebanyak 10% inokulum
dimasukkan ke dalam media produksi dengan volume kerja 100 ml, kemudian
diinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 37° C selama 24 jam. Pemanenan
supernatan dilakukan dengan cara sentrifugasi media kultivasi pada suhu 4° C
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipisah dari biomassa
untuk diukur total asam yang dinyatakan sebagai persen asam laktat (AOAC, 1995;
Purnama, 2009; Mardiana, 2010; Nielsen, 2010; Omemu et al., 2011; Saputra, 2011
dengan Modifikasi).
Pengukuran total asam tertitrasi merupakan penentuan konsentrasi total
asam. Pada supernatan, asam tertitrasi dihitung sebagai persen asam laktat. Pengukuran
ke dalam labu erlenmeyer, kemudian ditambahkan 3 tetes indikator phenolphtalein 1%.
Sampel dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N sampai terbentuk warna merah muda yang
merupakan titik akhir titrasi. Volume titran yang digunakan, normalitas basa standar,
volume contoh digunakan untuk menghitung total asam tertitrasi. Perhitungan total
asam tertitrasi dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
Total Asam (%) = V NaOH x N NaOH x 90 x FP x 100% V sampel x 1000
Keterangan :
V NaOH = Volume NaOH yang terpakai (ml)
N NaOH = Normalitas NaOH (0,1 N)
90 = Berat molekul asam laktat
FP = Faktor pengenceran
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Persentase Total Asam pada Bahan Pangan Pliek U
Sebelum dilakukan tahapan isolasi, setiap sampel pliek u tahap I, II, dan III diukur total
asam yang diduga sebagai asam laktat. Dari hasil pengukuran diketahui bahwa setiap
tahapan dari proses pembuatan pliek u menghasilkan persentase total asam yang
berbeda. Berdasarkan Gambar 4.1 dapat dilihat kadar asam tertinggi berasal dari pliek u
tahap III yaitu sebesar 4,92%, sedangkan yang terendah ialah pada pliek u tahap I yaitu
sebesar 1,07%. Hal ini dapat dihubungkan dengan adanya perbedaan jenis dan jumlah
BAL yang ditemukan di setiap tahapan pengolahan pliek u, sehingga kadar asam yang
dihasilkan juga bervariasi.
0 1 2 3 4 5 6
To
ta
l
asam
(%)
PT1 PT2 PT3
Telah diketahui bahwa pliek u diolah dari daging buah kelapa (C. nucifera) yang
terfermentasi secara spontan, dan daging kelapa tersebut tersusun oleh berbagai jenis
komponen, salah satunya ialah karbohidrat. Sumber karbohidrat tersebut akan diuraikan
oleh BAL menjadi senyawa-senyawa lain menjadi produk yang berbeda dari bahan
bakunya. Menurut Fardiaz (1992), karbohidrat merupakan substrat utama yang dipecah
dalam proses fermentasi. Polisakarida terlebih dahulu akan diurai menjadi gula
sederhana sebelum difermentasi, sebagai contoh hidrolisis pati menjadi unit-unit
glukosa. Glukosa selanjutnya akan diurai menjadi senyawa-senyawa lain. Pada BAL,
asam piruvat yang yang terbentuk dari jalur glikolisis bertindak sebagai penerima
hidrogen, dimana reduksi asam piruvat oleh NADH2 menghasilkan asam laktat.
Fermentasi ini disebut fermentasi homolaktat, karena satu-satunya produk yang
dihasilkan ialah asam laktat dan BAL yang berperan dalam fermentasi tipe ini dikenal
dengan BAL homofermentatif.
4.2 Isolasi BAL dari Pliek U
Sebanyak 8 isolat yang diduga BAL telah diisolasi dari sampel pliek u tahap I, II, dan
III. Kedelapan isolat yang berbeda tersebut yaitu NSP1, MY2, MY3, NQ2, NQ3, NQ4,
NQ5, dan NQ6, masing-masing isolat mempunyai profil yang beragam. Berdasarkan
hasil pengamatan terhadap sifat morfologi koloni dapat diketahui bahwa dari sampel
pliek u tahap I, dimulai dari pemupukan ke media MRSA yang berasal dari pengenceran
10-3 sampai dengan pengenceran 10-7 keseluruhannya hanya ditumbuhi oleh isolat NSP1.
Isolat tersebut memiliki ciri-ciri koloni berbentuk bulat, berwarna putih susu dengan tepi
halus dan elevasi konveks.
Pada pliek u tahap II, ditemukan 3 koloni yang berbeda yaitu MY1, MY2, dan
MY3. MY1 mempunyai ciri-ciri morfologis yang sama dengan NSP1, sedangkan MY2
dan MY3 berbeda. Pada pliek u tahap III, diperoleh 6 koloni yang berbeda yaitu NQ1,
NQ2, NQ3, NQ4, NQ5, dan NQ6. Pada tahap ini ditemukan satu koloni yang sama
pengolahan daging buah kelapa menjadi pliek u yang berbeda di setiap tahapnya
(Lampiran A) sehingga menyebabkan ditemukannya ciri-ciri koloni bakteri yang
berbeda. Keseluruhan sifat-sifat morfologis dari setiap isolat disajikan pada Tabel 4.1.
Tabel 4.1 Karakteristik morfologi koloni bakteri yang diduga BAL
Tahapan
Bentuk Warna Tepi Elevasi Keterangan
I NSP1 bulat putih
susu
halus konveks -
II NSP1 bulat putih
susu
halus konveks isolat sama
dengan
Krem bergelombang tumbuh ke
dalam
Menurut Wirawati (2002), pada fermentasi bahan pangan tradisional yang
berlangsung secara spontan, mikroorganisme yang secara alami ada di dalam bahan
dominan pada proses selanjutnya. Fardiaz (1992) juga menambahkan bahwa populasi
mikroba yang ditemukan pada setiap makanan, bila diamati jumlah dan jenisnya, sangat
bervariasi. Hal ini disebabkan karena adanya pengaruh selektif terhadap jumlah dan
jenis mikroba awal yang terdapat pada makanan. Sumber-sumber mikrobiota yang
terdapat pada makanan dapat berasal dari tanah, air permukaan, debu, kotoran hewan
atau manusia, lingkungan, udara dan sebagainya. Berbagai pengaruh selektif
menyebabkan satu atau beberapa jenis mikroba mungkin menjadi dominan dibandingkan
dengan jenis mikroba lainnya.
4.3 Seleksi Isolat Potensial Berdasarkan Uji In vitro
Diantara 8 isolat yang telah diisolasi, hanya 5 isolat yang memiliki kemampuan
menghambat bakteri patogen E. coli ATCC 25922 dan Staph. aureus ATCC 25923,
namun tidak dapat menghambat C. albicans. 5 isolat tersebut yaitu NQ1, NQ2, NQ3,
NQ4 dan NQ5. Penghambatan tersebut diduga disebabkan karena adanya aktivitas
antimikroba yang dihasilkan oleh 5 isolat tersebut.
0,0
E. coli ATCC 25922 Staph. aureus ATCC 25923
Diameter zona hambat yang dibentuk oleh 5 isolat terhadap E. coli ATCC 25922
bervariasi (Gambar 4.1) yaitu 1,5 mm hingga 8,5 mm, sedangkan untuk patogen Staph.
aureus ATCC 25923 juga bervariasi dari 1,2 mm hingga 4 mm. Penghambatan tertinggi
terhadap E. coli dan Staph. aureus berturut-turut ditunjukkan oleh isolat NQ2 yaitu
sebesar 8,5 mm dan 4 mm. Penghambatan terendah ditunjukkan oleh isolat NQ3 dan
NQ4, masing-masing sebesar 1,5 mm dan 1,2 mm.
Adanya aktivitas antimikroba dapat diketahui dengan timbulnya zona bening di
sekitar koloni isolat-isolat BAL setelah diinkubasi selama 24-48 jam pada uji antagonis
(Gambar 4.2). Terbentuknya zona bening menyebabkan bakteri E. coli dan Staph.
aureus tidak dapat tumbuh. Hal tersebut mengindikasikan bahwa senyawa asam ataupun
komponen metabolit dari isolat NQ1 sampai NQ5 menghambat pertumbuhan bakteri uji
tersebut. Penghambatan yang ditunjukkan oleh 5 isolat BAL tersebut diduga disebabkan
terjadinya perubahan pH medium karena dihasilkannya asam-asam organik selama
fermentasi. Menurut Salminen et al. (2007), fermentasi oleh BAL mengurangi jumlah
karbohidrat yang tersedia dan menghasilkan komponen organik dengan bobot molekul
rendah yang menunjukkan aktivitas antimikroba.
Penelitian yang dilakukan oleh Trimulyono et al., (2011) menyebutkan bahwa
kultur sel dan supernatan BAL mampu menghambat pertumbuhan bakteri E. coli ATCC
35218 dan Staph. aureus ATCC 25923. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa
isolat yang diperoleh tidak memproduksi bakteriosin, namun mampu menghambat
bakteri uji sehingga diduga antimikroba yang berperan ialah asam organik yang
dihasilkan oleh isolat-isolat yang diperoleh. Bakteri uji yang digunakan merupakan
bakteri yang tidak tahan asam sehingga produksi asam organik yang tinggi dari isolat
BAL mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji. Produksi asam organik yang tinggi
didukung oleh hasil titrasi asam yang menunjukkan bahwa asam tertitrasi
masing-masing isolat di atas 90%. Namun demikian, senyawa antimikroba lain juga ikut
dihasilkan oleh BAL saling bersinergi dalam memberikan efek antimikroba yang hingga
kini belum diketahui mekanismenya secara pasti. Penelitian lain yang dilakukan oleh
Mansilla (2008) juga melaporkan bahwa BAL yang diisolasi dari berbagai macam buah
dan sayur dapat menghambat pertumbuhan berbagai mikroorganisme patogen.
Komponen antimikroba yang terdeteksi dari isolat-isolat yang diperoleh ialah asam
organik, hidrogen peroksida dan bakteriosin yang berperan utama dalam menghambat
pertumbuhan bakteri uji.
Gambar 4.3 Uji in vitro 5 isolat terpilih terhadap E. coli ATCC 25922 (A, B, C) dan Staph.
aureus ATCC 25923 (D, E, F)
De Vuyst dan Vandamme (1994) menyatakan asam laktat merupakan salah satu
senyawa inhibitor yang dihasilkan BAL dan merupakan produk akhir utama dari
katabolisme karbohidrat, karena dari proses konversi sumber karbon ini dihasilkan
setidaknya 50% asam laktat, sehingga kelompok bakteri ini dinamakan bakteri asam
penurunan pH dan menyebabkan mikroba patogen maupun perusak bahan pangan yang
umumnya tidak tahan suasana asam akan terhambat. Akumulasi produk akhir asam
mengakibatkan turunnya pH dan akan menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif
maupun Gram negatif. Aktivitas asam-asam lipofilik seperti asam laktat dalam bentuk
tidak terdisosiasi dapat menembus sel mikroba, dan pada pH intraseluler yang lebih
tinggi, berdisosiasi menghasilkan ion-ion hidrogen dan mengganggu fungsi metabolit
esensial, translokasi substrat dan fosforilasi oksidatif sehingga mereduksi pH
intraseluler.
Selain itu mekanisme penghambatan lain terhadap mikroba uji diantaranya ialah
penghambatan terhadap sintesis dinding sel. Komposisi dinding sel dari ketiga mikroba
yang diujikan berbeda sehingga menyebabkan sensitivitas yang berbeda pula.
S.aureus merupakan bakteri Gram positif yang dinding selnya tersusun oleh beberapa
komponen seperti peptidoglikan yang tebal, asam teikoat, protein dan polisakarida. E.
coli merupakan bakteri Gram negatif yang mempunyai komponen dinding sel
peptidoglikan yang lebih tipis dibandingkan dengan bakteri Gram positif tetapi
bakteri Gram negatif mempunyai dua membran yaitu membran luar dan membran
dalam, membran luar tidak terdapat pada bakteri Gram positif. Membran luar bakteri
Gram negatif mengandung protein, lipid, lipoprotein dan lipopolisakarida (Jawetz et al.,
2005; Madigan et al., 2012). Garraway dan Evans, 1984; Griffin, 1994 menyatakan
bahwa dinding sel C. albicans terdiri dari kitin, selulosa, β-glukan, mannan, khitosan, protein, lemak dan ion anorganik. Senyawa antimikroba yang dapat menghambat
biosintesis dinding sel fungi pada umumnya menghambat biosintesis kitin.
Senyawa antimikroba juga dapat merusak membran sel dengan mendenaturasi
protein serta lemak yang menyusun memban sel mikroba, sehingga mengganggu
pertukaran zat yang dibutuhkan oleh mikroba tersebut. Sitoplasma semua sel hidup
dibatasi oleh membran sitoplasma yang berperan sebagai barir permeabilitas selektif,
fungsi integritas membran sitoplasma dirusak, makromolekul dan ion keluar dari sel
yang menyebabkan kerusakan pada sel. Membran sel pada fungi dan bakteri mempunyai
struktrur yang berbeda, membran sel pada fungi mengandung sterol sedangkan bakteri
tidak. Jadi antimikroba yang dapat berikatan dengan sterol yang akan mampu merusak
membran sel fungi (Jawetz et al., 2005). Berdasarkan hal tersebut dapat diketahui bahwa
kedelapan isolat BAL yang diujikan tidak mampu menghambat C. albicans yang dapat
disebabkan oleh tidak adanya senyawa-senyawa metabolit yang dihasilkan oleh
isolat-isolat tersebut yang dapat berikatan dengan komponen penyusun dinding maupun
membran sel fungi tersebut.
Penelitian yang dilakukan oleh Kariptas et al., (2010) dan Lertcanawanichakul
(2005) juga menunjukkan rendahnya aktivitas antifungal dari BAL terhadap C. albicans,
bahkan tidak ada sama sekali. Hal tersebut diduga karena C. albicans yang diisolasi dari
manusia lebih resisten terhadap zat antimikroba karena pemakaian obat antifungal.
4.4 Karakterisasi Morfologi, Biokimia dan Fisiologi Sel Isolat Terpilih
Isolat-isolat yang menunjukkan zona penghambatan terhadap bakteri patogen kemudian
dikarakterisasi lebih lanjut untuk mengetahui sifat morfologi, biokimia dan fisiologi
selnya. Ada 5 isolat yang telah diamati yaitu NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, dan NQ5.
Pemeriksaan diawali dengan pewarnaan Gram yang selanjutnya diamati di bawah
mikroskop cahaya pembesaran 1000x. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa kelima
Gambar 4.4 Pewarnaan Gram isolat BAL terpilih
Pewarnaan Gram dilakukan terhadap isolat yang berumur 20 jam. Hasil
pengamatan menunjukkan bahwa kelima isolat tersebut berbentuk basil, namun dapat
dilihat masing-masing isolat mempunyai perbedaan dari segi ukuran dan penataan
selnya. Isolat NQ1 merupakan basil pendek (kokobasil) yang tidak berpasangan atau
membentuk rantai, basil ini dikenal dengan monobasil, sedangkan isolat NQ2 terlihat
berpasangan dan ukurannya lebih besar daripada isolat NQ1. Isolat NQ3 terlihat lebih
panjang dan ramping juga ada yang terlihat berpasangan (diplobasil), sedangkan isolat
NQ4 merupakan basil pendek yang menyerupai rantai (streptobasil). Isolat NQ5 terlihat
bergerombol dan ada yang membentuk rantai.
Menurut Waluyo (2010), pewarnaan Gram merupakan slah satu prosedur yang
penting dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan
Gram merupakan tahapan yang penting dalam identifikasi bakteri dan termasuk ke
NQ1 NQ2 NQ3