Pengaruh pemberian ekstrak etanol kulit buah Manggis
(Garcinia Mangostana.L) terhadap perubahan makroskopis, mikroskopis dan tampilan immunohistokimia antioksidan CopperZinc Superoxide Dismutase
(Cu Zn SOD) pada ginjal mencit jantan (Mus musculus.L) strain DDW
yang di papari oleh Monosodium glutamate (MSG) dibandingkan dengan vitamin E
TESIS
Oleh:
Lestari Mukti 107008013
PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN
Pengaruh pemberian ekstrak etanol kulit buah Manggis
(Garcinia Mangostana.L) terhadap perubahan makroskopis, mikroskopis dan tampilan immunohistokimia antioksidan CopperZinc Superoxide Dismutase
(Cu Zn SOD) pada ginjal mencit jantan (Mus musculus.L) strain DDW
yang di papari oleh Monosodium glutamate (MSG) dibandingkan dengan vitamin E
TESIS
Diajukan Untuk Melengkapi Persyaratan Memperoleh Gelar Magister Biomedik Pada Program Studi Magister Ilmu Biomedik
Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara
oleh : Lestari Mukti
107008013
PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN
Judul : Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Kulit Buah Manggis (Garcinia Mangostana.L) Terhadap Perubahan Makroskopis, Mikroskopis dan Tampilan Immunohistokimia Antioksidan
Copper Zinc Superoxide Dismutase (Cu Zn SOD) Pada Ginjal Mencit Jantan (Mus Musculus.L) Strain DDW Yang di Papari Oleh Monosodium Glutamate (MSG) Dibandingkan Dengan Vitamin E
Nama mahasiswa : Lestari Mukti Nomor Pokok : 107008013
Prof. dr. Gontar A. Siregar, Sp.PD, KGEH NIP 19540220 198011 1001
Telah diuji pada
Tanggal : 26 Juli 2013
PANITIA PENGUJI TESIS
Ketua : dr. Betty.,M.Ked.(PA), Sp.PA Anggota : dr.Datten Bangun, MSc., SpFK
ABSTRAK Pendahuluan :
Ekstrak kulit manggis (Garcinia Mangostana L) yang selama ini telah banyak digunakan masyarakat sebagai obat, salah satunya sebagai antioksidan untuk mencegah radikal bebas. Penggunaan MSG sebagai penyedap dalam makanan telah dilaporkan mempunyai efek toksik terhadap ginjal yang dapat menurunkan fungsi ginjal dan menyebabkan peningkatan peroksidasi lipid sehingga menimbulkan stres oksidatif. Pemberian EEKM secara oral diharapkan dapat menurunkan efek radikal bebas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektifitas EEKM sebagai antioksidan pada mencit yang dipapari dengan MSG. Metode :
Metode penelitian yang digunakan adalah metoda eksperimental yang dilakukan terhadap mencit jantan dengan 5 kelompok perlakuan dan 5 ulangan. Kelompok (P0): kontrol aquadest 0,3 ml/mencit/hari dari hari 1-35, (P1): MSG 8 mg/g BB mencit/hari dari hari 1-21 dan hari ke 22-35 tanpa perlakuan. (P2): MSG 8 mg/g BB mencit/hari dari hari 1-22 dan hari ke 22-35 pemberian EEKM 600mg/kg BB mencit/hari, (P3): MSG 8 mg/g BB mencit/hari dari hari 1-21 dan pada hari ke-22-35 pemberian vitamin E 0,2 mg/g BB mencit/hari, dan (P4): EEKM sebanyak 600 mg/kg BB mencit/hari selama 14 hari.
Hasil penelitian :
Hasil penelitian menunjukkan pemberian MSG menyebabkan kerusakan makroskopis ginjal walaupun secara tidak bermakna (p>0,05), namun menyebabkan kerusakan mikroskopis pada ginjal secara bermakna (p<0,05) dan dapat diperbaiki dengan pemberian EEKM secara bermakna (p<0,05). MSG dapat menurunkan tampilan immunohistokimia antioksidan copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) pada ginjal secara bermakna (p<0,05), namun tampilan immunohistokimia copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) ini dapat ditingkatkan secara bermakna dengan pemberian EEKM (p<0,05).
Kesimpulan:
Dari hasil penelitian disimpulkan bahwa EEKM dapat berfungsi sebagai antioksidan dan dapat memperbaiki kerusakan jaringan ginjal secara mikroskopis.
ABSTRACT
Introduction :
Extract of Mangosteen rind (Garcinia Mangostana L) is widely used as a medicine, one of them as antioxidants to prevent the effect of free radicals. The use of MSG as a flavoring in food have been reported have a toxic effects in the kidney caused decreased kidney function and increased lipid peroxidation leading to oxidative stress. Giving ethanolic extract of mangosteen rind orally sugested reduce effects of free radicals. This study aimed to know the effectiveness ethanolic extract of mangosteen rind as antioxidants in mice given MSG.
Method :
This is an experimental investigation, using mice. The mice divided into 5 groups. First group (P0) was a control group only given distilled water 0.3 ml/mouse/day on 1-35 days, (P1):was given MSG 8 mg/g bw/day on 1-21 days and 22-35 days no treatment. (P2): was given MSG 8 mg/g bw/day on 1-21 days and 22-35 days given ethanolic extract of mangosteen rind 600 mg/kg bw/day, (P3): was given MSG 8 mg/g bw/day on 1-21 days and on 22-35 days of vitamin E 0.2 mg/g bw/day, and (P4):only given mangosteen rind extracts as much as 600 mg/kg bw/day for 14 days.
Result :
The results showed MSG in the given dose produced macroscopic damage to the kidney although not significant (p>0.05), but microscopically significant (p<0.05) and with ethanolic extract of mangosteen rind could be repaired significantly (p<0,05). MSG could suppress the immunohistochemistry appearance of copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) in the kidney significantly (P<0.05), but with ethanolic extract of mangosteen rind this appearance improved significantly (p<0,05).
Conclusion:
In this experiments, it was found that the ethanolic extracts of the mangosteen rind could repair the damage in the kidney induced by MSG, microscopicallay and also improved the immunohistochemistry appearance .
Keywords:
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis sampaikan kehadirat Allah SWT atas berkat, rahmat dan anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyusun dan menyelesaikan tesis yang berjudul ”Pengaruh pemberian ekstrak etanol kulit buah Manggis (Garcinia Mangostana.L) terhadap perubahan makroskopis, mikroskopis dan tampilan immunohistokimia antioksidan Copper Zinc Superoxide Dismutase (Cu Zn SOD) pada ginjal mencit jantan (Mus musculus.L) strain DDW yang di papari oleh Monosodium glutamate (MSG) dibandingkan dengan vitamin E”. Penulisan tesis ini merupakan salah satu persyaratan dalam memperoleh Gelar Magister pada Program Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan.
Proses penulisan tesis ini tidak terlepas dari bimbingan, bantuan, dukungan, doa dan perhatian dari berbagai pihak, pada kesempatan ini ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada yang terhormat:
1. Bapak Prof. dr. Gontar A. Siregar, SpPD-KGEH., Dekan Fakultas Kedokteran dan Ibu dr. Yahwardiah Siregar, Ph.D., Ketua Program Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. 2. Ibu dr. Betty.,M.Ked.(PA), Sp.PA selaku Ketua Komisi Pembimbing dan
3. Ibu dr. Lidya Imelda Laksmi., M. Ked.(PA), Sp.PA selaku ketua Komisi Pembanding dan Ibu Dr. Ir. Herla Rusmarilin, MP selaku anggota Komisi Pembanding yang telah banyak memberi masukan dan saran untuk perbaikan dalam penyelesaian tesis ini.
4. Terima kasih yang tulus penulis ucapkan kepada Ayahanda H. Imam dan Ibunda Alm Hj. Lasimah, serta mami mertua Hj. Ratna Juita berkat doa dan dukungan yang selalu menyertai dalam kehidupan sehingga mampu melindungi dan menghantarkan penulis dalam meraih cita-cita. Terima kasih kepada suami tercinta Rudi Putra, Dipl, atas segala kesabaran, doa, pengertian dan pengorbanan dalam mendukung cita-cita penulis selama proses pendidikan, Ananda Elang Samudra yang menjadi penyemangat untuk segera menyelesaikan pendidikan, keluarga besar Kakanda Sri Rejeki, AMK dan Kompol Husni serta keluarga besar Adinda drh. Agus Rahayu yang selalu memberikan dukungan selama penulis menjalani pendidikan di Sekolah Pasca sarjana Program Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan. 5. Pimpinan dan seluruh staf Laboratorium Fisiologi Hewan Jurusan Biologi
FMIPA, Laboratorium Farmakologi Fakultas Farmasi dan Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan, yang menyediakan tempat dan membantu penulis untuk penelitian dalam menyelesaikan tesis ini.
mengikuti pendidikan pada Sekolah Pasca sarjana Program Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan. 7. Seluruh staf pengajar, tenaga administrasi dan semua rekan-rekan
mahasiswa khususnya angkatan 2010 di lingkungan Progran Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan, yang telah banyak memberikan bimbingan, arahan, motivasi dan bantuan selama penulis mengikuti pendidikan.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih perlu mendapat koreksi dan masukan untuk kesempurnaan. Oleh karena itu Penulis berharap adanya kritik serta saran untukpenyempurnaan tulisan ini. Akhir kata penulis berharap kiranya tesis ini dapat bermanfaat bagi kita semua dan menambah wawasan bagi yang membaca. Amin
Medan, Juli 2013
DAFTAR RIWAYAT HIDUP A. Identitas Diri
Nama : Lestari Mukti
Tempat / tgl lahir : Wonosobo, 12 September 1979
Agama : Islam
Alamat : Gang Sedar No 64, Sriwijaya,
Kuala Simpang, Aceh Tamiang
Telp/Hp : 085262509099
Email : Lestari.Mukti43@yahoo.com
B. Riwayat pendidikan
SD Simpang III Pasaman : Tamat Tahun 1991
SMPN Simpang III Pasaman : Tamat Tahun 1994
SMF Prayoga Padang : Tamat Tahun 1997
Universitas Andalas Padang : Tamat Tahun 2004
C. Riwayat pekerjaan
2.1. Monosodium Glutamat ... 3.8. Bahan Dan Alat Penelitian ...
BAB 4
BAB 5
3.9. Etika Penelitian ... 3.10.Pelaksanaan Penelitian... 3.10.1Persiapan Dan Pemeliharaan Hewan Percobaan…. 3.10.2Prosedur Pembedahan Hewan mencit ….……...…. 3.10.3 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Manggis……….. 3.10.4 Prosedur Pembuatan Preparat Histologi Ginjal
Mencit……….
3.10.5 Prosedur Pewarnaan Haematoxylin Eosin………...
3.10.6 Prosedur Pewarnaan Immunohistokimia Copper ZincSOD...
3.11. Analisa Data...
HASIL DAN PEMBAHASAN... 4.1 Pemeriksaan Makroskopis Ginjal ... 4.2 Pemeriksaan Mikroskopis Ginjal ... 4.3.Tampilan Pewarnaan Immunohistokimia Cu ZnSOD...
DAFTAR GAMBAR
2.6. Anatomi ginjal normal………... 25
2.7. Struktur nefron………...……… 26
2.8. Histologi glomerulus ginjal………...…… 27 2.9.
Gambaran histologi kortek ginjal normal..………….…... Gambaran histologi ginjal yang terpapar MSG...…….……. Kerangka teori ……….….
Gambar kurva berat ginjal……….
Gambar makroskopis ginjal………...
Gambar mikroskopis ginjal………...
Tampilan pewarnaan immunohistokimia Cu Zn SOD ……..
DAFTAR TABEL
Tabel Judul Halaman
3.1. Dosis pemberian ekstrak kulit manggis pada kelompok
perlakuan ... 46 4.1.
4.2. 4.3.
Hasil pengamatan kerusakan ginjal secara makroskopis... Hasil pengamatan kerusakan ginjal secara mikroskopis... Tampilan pewarnaan immunohistokimia Cu Zn SOD ginjal...
DAFTAR SINGKATAN
Cooper Zinc Superoxide Dismutase
NTA
Ni SOD
ROS
SOD
Strain DDW
WHO
Nekrosis Tubular Akut
Nickel SOD
Reactive Oxygen Species
Superoxide Dismutase
Strain Double Distsch Webster
DAFTAR LAMPIRAN Surat Ethical Clearance hewan percobaan.
Surat keterangan izin penelitian laboratorium Fisiologi FMIPA USU
Proses pembuatan ekstrak etanol kulit manggis Dokumentasi pemeliharaan dan perlakuan hewan percobaan
Sertifikat analisa vitamin E Dokumentasi prosessing jaringan
Dokumentasi proses pewarnaan immunohistokimia
Cu Zn SOD
ABSTRAK Pendahuluan :
Ekstrak kulit manggis (Garcinia Mangostana L) yang selama ini telah banyak digunakan masyarakat sebagai obat, salah satunya sebagai antioksidan untuk mencegah radikal bebas. Penggunaan MSG sebagai penyedap dalam makanan telah dilaporkan mempunyai efek toksik terhadap ginjal yang dapat menurunkan fungsi ginjal dan menyebabkan peningkatan peroksidasi lipid sehingga menimbulkan stres oksidatif. Pemberian EEKM secara oral diharapkan dapat menurunkan efek radikal bebas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektifitas EEKM sebagai antioksidan pada mencit yang dipapari dengan MSG. Metode :
Metode penelitian yang digunakan adalah metoda eksperimental yang dilakukan terhadap mencit jantan dengan 5 kelompok perlakuan dan 5 ulangan. Kelompok (P0): kontrol aquadest 0,3 ml/mencit/hari dari hari 1-35, (P1): MSG 8 mg/g BB mencit/hari dari hari 1-21 dan hari ke 22-35 tanpa perlakuan. (P2): MSG 8 mg/g BB mencit/hari dari hari 1-22 dan hari ke 22-35 pemberian EEKM 600mg/kg BB mencit/hari, (P3): MSG 8 mg/g BB mencit/hari dari hari 1-21 dan pada hari ke-22-35 pemberian vitamin E 0,2 mg/g BB mencit/hari, dan (P4): EEKM sebanyak 600 mg/kg BB mencit/hari selama 14 hari.
Hasil penelitian :
Hasil penelitian menunjukkan pemberian MSG menyebabkan kerusakan makroskopis ginjal walaupun secara tidak bermakna (p>0,05), namun menyebabkan kerusakan mikroskopis pada ginjal secara bermakna (p<0,05) dan dapat diperbaiki dengan pemberian EEKM secara bermakna (p<0,05). MSG dapat menurunkan tampilan immunohistokimia antioksidan copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) pada ginjal secara bermakna (p<0,05), namun tampilan immunohistokimia copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) ini dapat ditingkatkan secara bermakna dengan pemberian EEKM (p<0,05).
Kesimpulan:
Dari hasil penelitian disimpulkan bahwa EEKM dapat berfungsi sebagai antioksidan dan dapat memperbaiki kerusakan jaringan ginjal secara mikroskopis.
ABSTRACT
Introduction :
Extract of Mangosteen rind (Garcinia Mangostana L) is widely used as a medicine, one of them as antioxidants to prevent the effect of free radicals. The use of MSG as a flavoring in food have been reported have a toxic effects in the kidney caused decreased kidney function and increased lipid peroxidation leading to oxidative stress. Giving ethanolic extract of mangosteen rind orally sugested reduce effects of free radicals. This study aimed to know the effectiveness ethanolic extract of mangosteen rind as antioxidants in mice given MSG.
Method :
This is an experimental investigation, using mice. The mice divided into 5 groups. First group (P0) was a control group only given distilled water 0.3 ml/mouse/day on 1-35 days, (P1):was given MSG 8 mg/g bw/day on 1-21 days and 22-35 days no treatment. (P2): was given MSG 8 mg/g bw/day on 1-21 days and 22-35 days given ethanolic extract of mangosteen rind 600 mg/kg bw/day, (P3): was given MSG 8 mg/g bw/day on 1-21 days and on 22-35 days of vitamin E 0.2 mg/g bw/day, and (P4):only given mangosteen rind extracts as much as 600 mg/kg bw/day for 14 days.
Result :
The results showed MSG in the given dose produced macroscopic damage to the kidney although not significant (p>0.05), but microscopically significant (p<0.05) and with ethanolic extract of mangosteen rind could be repaired significantly (p<0,05). MSG could suppress the immunohistochemistry appearance of copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) in the kidney significantly (P<0.05), but with ethanolic extract of mangosteen rind this appearance improved significantly (p<0,05).
Conclusion:
In this experiments, it was found that the ethanolic extracts of the mangosteen rind could repair the damage in the kidney induced by MSG, microscopicallay and also improved the immunohistochemistry appearance .
Keywords:
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Radikal bebas adalah molekul yang kehilangan elektron, sehingga molekul tersebut menjadi tidak stabil dan selalu berusaha mengambil elektron dari molekul atau sel lain. Radikal bebas mempunyai banyak bentuk seperti radikal hidroksil, peroksil, anion superoxidea, dan lain-lain (Murray, et al., 2003). Apabila radikal bebas terdapat dalam jumlah yang berlebihan maka akan terjadi stres oksidatif dimana terjadi ketidak seimbangan antara jumlah radikal bebas terhadap oksidan intra sel. Stres oksidatif yang berlangsung terlalu lama dapat menimbulkan kerusakan mulai dari tingkat molekul DNA, protein, lipid, sampai dengan kerusakan pada tingkat selular, jaringan, dan organ yang menyebabkan disfungsi, jejas sel (cell injury), degenerasi, penurunan fungsi, dan akhirnya dapat memicu terjadinya penyakit degeneratif dan memperpendek umur biologis atau penuaan serta kematian sel (Wresdiyati, 2006). Radikal bebas berasal dari hasil metabolisme tubuh dan faktor eksternal seperti asap rokok, hasil penyinaran ultra violet, zat kimiawi dalam makanan dan polutan lain.
Penemuan ini melengkapi 4 jenis rasa sebelumnya yaitu asam, manis, asin dan pahit dengan umami dari akar kata umai (Ardyanto, 2004). MSG berasal dari ganggang laut (Laminaria japonica), MSG ini pertama kali di isolasi dalam bentuk kristal dan di indentifikasi sebagai asam amino glutamate yang dapat meningkatkan rasa lezat pada makanan (Tawfik, et al., 2012). Glutamat
merupakan asam amino alami yang merupakan komponen utama dari protein dan
peptide pada jaringan. MSG mengandung 78% asam glutamat dan 22% natrium dan air (Inuwa, et al., 2011).
Taiwan adalah negara yang paling tinggi mengkonsumsi MSG yaitu 3 gram per-kapita per-hari, sedangkan di negara Amerika merupakan negara yang paling rendah mengkonsumsi MSG yaitu hanya sekitar 0,5 gram kapita per-hari. Angka rata-rata konsumsi MSG di Indonesia sekitar 0,6 g/hari. Kadar MSG
yang dikonsumsi tergantung pada isi kandungan MSG sendiri di dalam makanan dan pilihan rasa seseorang yaitu sekitar 0,1-0,8% dari makanan yang disajikan (Simanjuntak, 2010). Pada tahun 1959, Food and Drug Administration di negara Amerika mengelompokkan MSG sebagai generally recognized as safe (GRAS), sehingga tidak perlu pengaturan khusus. Tetapi tahun 1968, muncul laporan tentang keluhan beberapa gangguan setelah makan di restoran China, sehingga keluhan tersebut disebut sebagai Chinese Restaurant Syndrome. Karena kompisisinya dianggap signifikan dalam masakan itu, MSG diduga sebagai penyebabnya, tetapi belum dibuktikan secara ilmiah (Ardyanto, 2004), sehingga
120 mg/kg BB/hari. Nilai ambang keamanan ini harus diperhatikan oleh setiap konsumen MSG agar tidak melebihi jumlah konsumsinya (Elpiana, 2012).
Penelitian yang dilakukan oleh Vinodini, et al.(2010), menyatakan bahwa pemberian MSG 4 g/kgBB secara intra peritoneal dapat menyebabkan menurunnya fungsi ginjal dan menyebabkan peningkatan peroksidasi lipid sehingga menimbulkan stres oksidatif. Thomas, et al. (2009), menyebutkan MSG
juga dapat menginduksi stres oksidatif pada eritrosit, hepar, ginjal, jantung dan otak.
Ginjal merupakan organ yang berpasangan yang terletak pada dinding perut posterior, mempunyai fungsi utama untuk merubah metabolit beracun dan produk limbah dari darah serta mengatur jumlah cairan dan keseimbangan elektrolit dalam tubuh (Eweka, et al., 2007; Tawfik, et al., 2012). Tiap-tiap ginjal terdiri dari 1-4 juta unit filtrasi fungsional yang disebut nefron yang terdiri dari: glomerulus, tubulus kontortus proksimalis, loop of Henle, dan tubulus kontortus distalis (Junqueira, 2007).
menjadi ratusan kali lebih besar pada ginjal dibanding organ lain (Abass, et al., 2011).
Untuk mencegah atau mengurangi penyakit kronis karena radikal bebas diperlukan antioksidan. Antioksidan ada dua jenis yaitu antioksidan eksogen seperti vitamin C, vitamin E dan antioksidan endogen yang disebut antioksidan intra sel yang berbentuk enzim. Enzim antioksidan yang terdapat dalam sel meliputi catalase, glutathione peroksidase dan superoxide dismutase (SOD). Berdasarkan adanya logam yang berperan sebagai kofaktor maka SOD ini terdiri dari mangan SOD (Mn SOD), Copper Zinc SOD (Cu Zn SOD) dan Nickel SOD
(Ni SOD) dan berdasarkan tempat distribusinya maka terdapat pula extracellular SOD (EC SOD). Copper Zinc Superoxide Dismutase (Cu Zn SOD) merupakan salah satu antioksidan endogen yang berperan utama dalam mengkatalisis radikal bebas anion superoxidea menjadi hydrogen peroksida dan molekul oksigen (Mates, et al., 1999 dalam Wresdiyati, et al., 2010).
dikenal juga sebagai ratu buah. Kulit manggis (pericarp) tebal, keras dan berwarna ungu tua. Buah ini telah banyak digunakan dalam pengobatan pada beberapa negara di Asia Tenggara seperti Indonesia, Malaysia, Srilanka, Philipina dan Thailand. Masyarakat luas menggunakan ekstrak etanol kulit manggis dalam mengatasi diare, penyembuhan luka infeksi, nyeri perut, peradangan serta berbagai penyakit (Chaivisuthangkura, et al., 2008).
Penelitian fitokimia yang telah dilakukan sebelumnya menunjukkan bahwa kulit buah manggis kaya akan senyawa xanthones yang mempunyai berbagai aktivitas biologi seperti antioksidan, anti bakteri, anti jamur, anti tumor, anti agregasi platelet dan anti trombotik. (Shan, et al., 2011; Akao, et al., 2008 dan Sato, et al., 2004). Ekstrak kulit buah manggis mengandung senyawa-senyawa yang diduga mempunyai potensi sebagai antioksidan tetapi yang menunjukkan aktivitas poten adalah 8- hidroksikudraxanton, gartanin, alpha mangostin, gamma mangostin dan smeathxanton A (Jung, et al., 2006). Penelitian oleh Weecharangsan, et al. (2006), menunjukan bahwa ekstrak etanol kulit manggis yang diekstraksi dengan pelarut air, etanol 50% dan 95% dan etil asetat yang diperiksa dengan metoda 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) ternyata mempunyai aktivitas antioksidan dengan mekanisme penangkapan radikal bebas dan penelitian yang dilakukan oleh Moongkarndi, et al. (2004) menyebutkan bahwa ekstrak kulit buah manggis merupakan antioksidan kuat yang bekerja dengan cara menghambat secara signifikan produksi Reactive Oxygen Species
Penelitian mengenai potensi ekstrak kulit buah manggis sebagai anti oksidan telah banyak dilakukan. Namun demikian, belum dilakukan penelitian tentang pengaruh ekstrak kulit buah manggis terhadap kandungan Cu Zn SOD
pada organ tubuh khususnya di ginjal. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh ekstrak kulit buah manggis terhadap kandungan antioksidan intrasel copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) pada ginjal mencit secara immunohistokimia.
1.2. Perumusan Masalah
Adakah pengaruh pemberian ekstrak etanol kulit manggis terhadap perubahan gambaran makroskopis, mikroskopis dan tampilan immunohistokimia antioksidan endogen copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) ginjal mencit jantan strain DDW setelah diberi MSG dibandingkan dengan vitamin E.
1.3. Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan Umum
Untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol kulit manggis (EEKM) terhadap perubahan makroskopik, mikroskopik dan tampilan immunohistokimia antioksidan endogen copper zinc superoxide dismutase
(Cu Zn SOD) pada ginjal mencit jantan strain DDW setelah dipapari oleh MSG
1.3.2. Tujuan Khusus
1. Untuk mengetahui pengaruh pemberian EEKM terhadap perubahan berat, warna dan konsistensi pada ginjal mencit jantan strain DDW yang dipapari oleh MSG dan di bandingkan dengan vitamin E.
2. Untuk mengetahui pengaruh pemberian EEKM terhadap mikroskopis ginjal mencit jantan strain DDW yang papari oleh MSG dibandingkan dengan vitamin E yang dinilai dengan pewarnaan Hematoksilin Eosin. 3. Untuk mengetahui pengaruh pemberian EEKM terhadap tampilan
immunohistokimia antioksidan endogen copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) sel ginjal mencit jantan strain DDW yang papari oleh MSG dibandingkan vitamin E.
1.4. Hipotesis
1.5. Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi ilmiah mengenai ekstrak etanol kulit manggis (Garcinia mangostana Linn.) dan dapat dijadikan pertimbangan bagi masyarakat untuk menggunakan ekstrak etanol kulit manggis sebagai antioksidan untuk mencegah radikal bebas yang disebabkan oleh MSG. 2. Berguna sebagai acuan untuk penelitian selanjutnya untuk
BAB 2
TINJAUAN KEPUSTAKAAN
2.1 Monosodium Glutamat
Gambar 2.1 Rumus bangun Monosodium glutamat (Inuwa, 2011)
Monosodium glutamat (MSG) berupa serbuk kristal putih dengan rumus
molekul C5H8NNaO4, berat molekul 187,13, mempunyai sifat kelarutan 74 g/100 ml air (sangat mudah larut dalam air), tetapi tidak bersifat higroskopis
dan praktis tidak larut dalam pelarut organik umum seperti eter (Wikipedia, 2012). MSG mengandung 78% asam glutamat, 22% sodium dan 1%
air (Eweka, 2011).
seperti kaldu dimana karakteristik umami berupa sedap, lezat dan enak berbeda
dengan empat rasa yang lain yaitu pahit, manis, asin, dan asam (Jinap, et al., 2010).
Glutamat juga dibentuk oleh tubuh dan berikatan dengan asam amino lain untuk membentuk struktur protein. Apabila glutamat berikatan dengan molekul protein menjadi tidak berasa dan tidak akan menimbulkan rasa umami pada makanan, namun hidrolisa protein oleh pemanasan selama proses pemasakan akan menyebabkan pelepasan glutamat sehingga glutamat menjadi bentuk bebas yang dapat menimbulkan rasa umami. Glutamat dalam bentuk bebas banyak ditemukan dalam bahan makanan seperti keju, daging dan sayuran, kedelai, jamur, teh hijau dan kol bahkan air susu ibu juga mengandung glutamat. Konsentrasi glutamat yang paling tinggi terdapat pada tomat matang 140 mg/100g dan keju parmesan 1200 mg/100g (Jinap, et al., 2010; Khropycheva, et al., 2009). MSG banyak digunakan pada masakan Cina dan Asia tenggara yang dikenal dengan nama ajinomoto, sasa, vet-sin, miwon, atau weichaun.
Tubuh memetabolisme glutamat yang berasal dari MSG dengan cara yang sama dengan terhadap glutamat alami. Tubuh hanya akan mengenali glutamat, tetapi tidak dapat membedakan dari mana asalnya, apakah berasal dari keju, tomat, jamur, atau berasal dari MSG (Jinap, et al., 2010).
MSG diabsorbsi sangat cepat didalam saluran cerna dan menyebabkan meningkatnya kadar glutamat dalam plasma darah (Abbas, et al., 2011). Dalam sirkulasi MSG akan berdisosiasi menjadi natrium dan L- glutamat, L-glutamat
sistem transportasi menggunakan ATP. sebagian L- glutamat akan berkonjugasi di dalam sel dan akan mengalami proses eliminasi dan sebagian lagi akan berubah menjadi glutamin (Abass, et al., 2011)
Reseptor glutamat ada 2 jenis, ionotropik dan metabotropik. Reseptor Jenis ionotropik (terkait kanal ion) ada tiga, yaitu N-methyl-D-aspartate receptor
(NMDA), α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor (AMPA) and kainite receptor (KA). Reseptor NMDA ini banyak ditemukan diotak yaitu pada bagian cortex cerebral dan hippocampus, selain itu ditemukan juga pada jaringan ekstraneuronal seperti sel beta pankreas, saluran urogenital pria bagian bawah, ginjal dan limfosit (Gao, et al., 2007; Abass, et al., 2011).
Glutamat memicu reseptor NMDA dengan efek membuka reseptor sehingga terjadi pembukaan kanal ion Ca+2 , ion kalsium yang masuk akan mengaktifkan enzim enzim seperti protease, lipase dan endonuklease yang dapat berpengaruh terhadap posfolipid yang merupakan penyusun membran sel (Kumar, et al., 2004), proses ini disertai pelepasan radikal oksigen bebas berbentuk radikal superoxide (O2.-), oleh SOD akan dirubah menjadi bentuk H2O2, dengan adanya logam Fe2+ melalui reaksi Fenton akan terbentuk radikal hidroksi (OH-) dan diakhiri dengan peroksidasi lipid, peroksidasi protein dan kerusakan DNA, sehingga menyebabkan peroksidasi membran sel yang kemudian pecah dan
isi sel mengalir keluar dan mengalami kematian sel akibat nekrosis (Gao, et al., 2007; Abass, et al ., 2011).
Information Council Foundation). Pada tahun 1958 Menurut FDA MSG masuk dalam kategori “generally recognized as safe” (GRAS), sama seperti bahan tambahan lain seperti garam, cuka dan baking powder (IFIC Foundation), sehingga tahun 1970 FDA menetapkan batas aman konsumsi MSG 120 mg/kg berat badan/hari yang disetarakan dengan konsumsi garam (Ardyanto, 2004).
Bila penggunaanya dalam jumlah besar dan lama MSG dapat menimbulkan berbagai macam gejala berupa rasa kebas, jantung berdebar-debar, mual dan sakit kepala, gejala ini kemudian dikenal dengan Chinese restaurant syndrome (Attia, et al., 2008). Oleh karena itu penelitian terhadap efek MSG banyak dilakukan, dari penelitian yang dilakukan oleh Inuwa, et al., 2011, masyarakat Nigeria menggunakan MSG selain sebagai penyedap juga digunakan sebagai pemutih pakaian untuk menghilangkan noda dari pakaian, dari sini timbul pemikiran bahwa zat pemutih bisa saja berefek berbahaya pada jaringan dan organ pada tubuh yang menyebabkan penyakit bila di konsumsi sebagai penyedap makanan, didapatkan hasil bahwa MSG dengan dosis 200 mg, 300 mg dan 400 mg selama empat minggu menimbulkan efek toksikologi pada ginjal yang ditandai dengan peningkatan kadar ureum dan kreatinin.
perubahan pada jaringan ginjal seperti adanya pembengkakan pada endothelium glomerulus dan atropi glomerulus (Abbas, et al., 2011)
2.2 GarciniaMangostanLinn
Buah manggis dapat diklasifikasikan dalam golongan divisi:
Spermatophyta (tumbuhan berbiji); subdivisi: Angiospermae (berbiji tertutup); kelas: Dicotyledonae (biji berkeping dua); famili: Guttiferae; genus: Garcinia; dan spesies: GarciniaMangostanaL.
Manggis dengan nama Latinnya Garcinia mangostana Linn (GM) dikenal juga sebagai Queen of the Tropical Fruits di luar negeri. Tanaman ini pertama kali ditemukan di Burma dan Thailand, merupakan tanaman tropis dengan tinggi pohon antara 7-25 meter (Misra, et al., 2009). Manggis dibudidayakan di hutan hujan tropis pada beberapa negara di Asia Tenggara seperti Indonesia, Malaysia, Sri Lanka, Filipina, dan Thailand. Masyarakat di berbagai negara ini telah menggunakan kulit GM sebagai obat tradisional untuk pengobatan sakit perut, diare, disentri, luka yang terinfeksi dan gastritis kronis (Doi, et al., 2009). Penelitian lain telah menunjukkan bahwa ekstrak GM memiliki aktifitas antioksidan, anti tumor, anti alergi, anti inflamasi, anti bakteri, dan anti virus.
Kulit buah manggis mengandung berbagai senyawa seperti mangostin,
tannin, Xanthon, crysanthemin, garcinone, gartanin, vitamin B1, B2, terpen,
anthocyanin, phenol dan zat bioaktif lainnya (Moongkarndi, et al., 2004; Shan, et al., 2011). Diduga yang mempunyai aktifitas farmakologi adalah golongan
Xanthone yang terdiri dari α-mangostin, - mangostin dan - mangostin (Doi, et al., 2009). Xanthone merupakan senyawa polifenol alami yang terdapat di dalam tanaman, dan telah disintesis secara luas dan memiliki efek antioksidan (Mahabusarakam, et al., 2000).
Xanthone atau xanthen-9H-one merupakan senyawa organik dengan rumus molekul C13H8O2 merupakan salah satu metabolit sekunder yang banyak ditemui pada beberapa tanaman tingkat tinggi, jamur dan lichen. Inti dari xanthone adalah 9-xanthene atau Dibenzo-c-pyrone. Xanthone di klasifikasikan dalam lima kelompok yaitu: (a) simple oxygenated xanthones; (b) xanthone glycosides; (c) prenylated xanthones; (d) xanthoneolignoids; dan (e) xanthone
jenis lain (Chaverri, et al., 2006).
Ada sekitar 50 jenis xanthone yang terdapat dalam pericarp buah manggis beberapa di antaranya adalah α-Mangostin, -Mangostin -Mangostin, Garcinone A, Garcinone B, Garcinone C, Garcinone D, Garcinone E, Garcimangosone A (Chaverri, et al., 2006). Jung, et al. (2006), berhasil mengidentifikasi kandungan ekstrak xanthone yang terlarut di dalam diklorometana, berupa dua xanthone
yang sudah teroksidasi yaitu 8-hidroksikudraksanton G, dan mangostingon
7-metoksi-2(3-metil-2-butenil)-8-(3-metil-2-okso-3-butenil)-1,3,6 trihidroksiksanton
Garsimangostin; (3) Garsinon; (4). Garsinon-E; (5) Gartanin; (8) 1-isomangostin; (9) Alfamangostin; (10) Gamma-mangostin; (11) Mangostinon smeathxanthone A; dan (12) Tovofillin A. Struktur kimia dari kandungan ekstrak etanol kulit manggis terdapat pada gambar 2.3.
Gambar 2.3. Struktur inti Xanthone dan beberapa rumus kimia kandungan pericarp GarciniaMangostanaLinn
Mekanisme kerja senyawa xanthone ini adalah dengan cara menghambat produksi ROS intraseluler secara signifikan (Moongkarndi, et al., 2004). Penelitian Chomnawang, et al. (2007), menyebutkan bahwa ekstrak etanol kulit buah manggis mempunyai aktivitas antioksidan yang signifikan yang diukur dengan penghambatan pembentukan radikal dengan metoda DPPH dan menghasilkan bahwa ekstrak etanol kulit manggis mampu menghambat 50% pembentukan radikal dan juga mereduksi produksi ROS dengan menghambat radikal superoxide (O2-). Selain itu juga dapat menangkap radikal hidroksil (OH-), tetapi kerjanya lebih kuat dalam menghambat radikal superoxide (Kosem, et al., 2007). Evaluasi terhadap α mangostin sebagai antioksidan juga dilakukan dengan cara percobaan terhadap tikus yang diberi isopretenolol 150 mg/kg BB selama dua hari untuk menginduksi infark miokardia memperlihatkan penurunan enzim antioksidan seperti gluthation S transferase (GST), gluthation peroxidase (GPx)
2.3 Radikal Bebas
Radikal bebas atau oksidan adalah molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbit terluarnya. Oleh karena itu untuk menstabilkan diri maka mempunyai kecendrungannya memperoleh elektron dari substansi lain menjadikan radikal bebas sangat reaktif (Murray, et al., 2003). Radikal bebas terdapat dalam tubuh dengan berbagai cara, umumnya akibat proses biokimiawi, antara lain hasil samping dari proses oksidasi atau pembakaran sel yang berlangsung pada waktu bernafas, metabolisme sel, olahraga berlebihan, peradangan, atau ketika tubuh terpapar polusi lingkungan berupa asap kendaraan, asap rokok, bahan pencemar dan radiasi matahari.
Radikal yang sangat berpengaruh terhadap proses biologi adalah yang berasal dari oksigen dan disebut reactive oxygen species (ROS). Oksigen memiliki dua elektron tidak berpasangan di orbital terpisah di kulit terluarnya. Struktur elektronik membuat oksigen sangat rentan terhadap pembentukan radikal. Kelompok ROS terdiri dari: (i) superoxide anion; (ii) peroxide (hydrogen peroxide); dan (iii) hydroxyl radical (Bowen, 2003). (gambar 2.4)
Gambar 2.4 Struktur ROS (Bowen, 2003)
Radikal bebas dapat merusak senyawa yang penting untuk mempertahankan integritas sel, yaitu :
1. Asam lemak, khususnya asam lemak tak jenuh yaitu fosfolipid, glikolipid yang merupakan komponen penting penyusun membran sel. Asam lemak tak jenuh sangat rawan terhadap serangan-serangan radikal, terutama radikal hidroksil. Radikal hidroksil dapat menimbulkan reaksi rantai yang dikenal dengan nama peroksidasi lipid
2. Protein, Oksidan dapat merusak asam amino yang merupakan penyusun protein, seperti sistein yang mengandung gugusan sulfidril (SH) yang paling peka terhadap radikal hidroksil sehigga terbentuk ikatan disulfida (-S-S-) menimbulkan ikatan intra atau antar molekul sehingga protein tersebut kehilangan fungsi biologisnya.
3. DNA, Radikal bebas dapat menimbulkan berbagai perubahan pada DNA
berlangsung lama dapat mengakibatkan kerusakan sel yang berat atau menetap menyebabkan cedera ireversibel dan sel yang terkena akan mengalami kematian (Murray, et al., 2003).
2.4 Antioksidan
Antioksidan terdiri dari dua kelompok yaitu antioksidan enzimatis dan antioksidan nonenzimatis. Antioksidan enzimatis (primer): merupakan antioksidan endogen, yaitu enzim superoxidea dismutase (SOD), catalase,
glutation peroksidase (GSH-PX), serta glutation reduktase (GSHR). Enzim SOD
bekerja dengan cara mengubah radikal anion superoxidea (O2-) yang sangat reaktif menjadi H2O2 yang kurang reaktif, sedangkan catalase dan glutation peroksidase bekerja dengan cara mengubah H2O2 menjadi H2O dan O2 (Mates, et al., 1999 dalam Wresdiyati, et al., 2010; Bowen, 2003). Antioksidan non ezimatis (sekunder): disebut juga antioksidan eksogen, antioksidan ini bekerja secara preventif. Terbentuknya senyawa oksigen reaktif dihambat dengan cara menangkap radikal dan mencegah terjadinya reaksi berantai. Komponen ini meliputi vitamin C, vitamin E, -karoten, flavonoid. Senyawa-senyawa fitokimia ini membantu melindungi sel dari kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas (Mates, et al., 1999 dalam Wresdiyati, et al., 2010; Bowen, 2003Mates,et al., 1999).
unit yang identik dengan berat 32 KDa; (iii) Ni SOD (Nickel superoxide dismutase) mengandung empat unit yang identik dengan berat 13,4 KDa; (iv) EC SOD (extracellular superoxide dismutase), (Goodsel, 2007).
Pengukuran kandungan enzim antioksidan SOD merupakan cara untuk mengetahui kondisi pertahanan sel terhadap radikal bebas. Aktivitas SOD
bervariasi pada beberapa organ. Aktivitas SOD tertinggi terdapat pada hati, diikuti kelenjar adrenal, ginjal, darah, limpa, pankreas, otak, paru-paru, usus, ovarium dan timus. Pada masa embrional Cu Zn SOD terdapat pada organ yang sedang berkembang dan sangat kuat terekspresi pada ependymal epithelium dari choroid plexus, ganglia, sel sensor pada olfactory dan epitel vestibulocochlear, sel darah, hepatosit, sel hematopoetik liver, dan kulit. Selama masa organogenesis dan pada masa akhir kehamilan levelnya akan meningkat pada sel yang telah matang dan akan terdeteksi pada sel epitel dari saluran cerna, saluran pernafasan, pankreas dan ginjal (Yon, et al., 2008)
maupun yang terbentuk dari luar ginjal (Wresdiyati, et al., 2002). Pengamatan immunohistokimia dilakukan terhadap inti sel tubulus proksimal dan tubulus distal renalis yang memberikan reaksi positif pada berbagai tingkat kandungan Cu Zn SOD yaitu coklat tua (positif kuat/+++), coklat sedang (positif sedang/++), coklat muda campur biru (positif lemah/+), dan warna biru (negatif/-).
2.5 Vitamin E (Tokoferol)
Gambar 2.5 α- Tokoferol (Murray, et al., 2003)
Vitamin E merupakan senyawa 6-hidroksikromana (tokol) yang tersubsitusi isoprenoid seperti pada gambar 2.5. Di alam vitamin E terdiri dari berbagai jenis seperti: α tokoferol (5,7,8-Trimetil tokol), tokoferol (5,8-Dimetil
tokol), tokoferol (7,8-Dimetil tokol), δ tokoferol (8-Metil tokol), yang
mempunyai aktifitas biologis terbesar dan distribusi alami yang paling luas adalah
α tokoferol dengan rumus kimia C29H50O2 (Murray, et al., 2003).
Tokoferol merupakan antioksidan non enzimatik, memutus reaksi rantai radikal bebas dengan mekanisme mendonorkan ion hidrogen fenolat kepada radikal bebas peroksil asam lemak tak jenuh ganda yang terperoksidasi seperti persamaan berikut ini:
ROO.+ TocOH ROOH + TocO. ROO. + TocO. ROO +
(Produk non radikal bebas)
Radikal bebas fenoksi yang dihasilkan dapat bereaksi dengan vitamin C untuk menghasilkan kembali tokoferol atau bereaksi dengan radikal bebas peroksil berikutnya sehingga cincin kromana serta rantai samping dioksidasi menjadi produk bukan radikal bebas. Kerja vitamin E akan efektif bila bekerja pada konsentrasi oksigen tinggi sehingga vitamin E cenderung terdapat pada struktur lipid yang terpajan tekan parsial O2 paling tinggi seperti membran eritrosit dan retina.
2.6 Ginjal
Pada manusia bentuk ginjal seperti kacang merah dengan ukuran panjang sekitar 10-12 cm, lebar sekitar 6 cm dan ketebalan 3,5 cm dengan berat sekitar 150 gram dan terbenam dalam dasar lemak yang disebut lemak perirenal. Terdapat pada posterior abdomen bagian atas pada masing-masing sisi vertebrata lumbal atas, letak ginjal kanan biasanya terletak lebih rendah di bandingkan ginjal kiri (Gambar 2.6). Ginjal di bungkus oleh simpai jaringan fibrosa yang tipis. Setiap ginjal memiliki bukaan yang disebut hilus yang menghubungkan arteri renal, vena renal, dan ureter (Watson, 2002). Pada pelvis renalis yakni ujung atas ureter yang melebar terbagi menjadi tiga kaliks mayor dan 12-18 cabang kecil atau kaliks minor. Ginjal dibagi menjadi korteks luar dan medulla didalam yang terdiri dari 10-18 struktur piramid yang disebut pyramid medulla. Dari dasar tiap pyramid terjulur berkas tubulus yang parallel disebut berkas medulla yang menyusup kedalam korteks (Junqueira, et al., 2007).
Unit fungsional ginjal yaitu nefron yang berjumlah 1-4 juta, nefron memiliki beberapa segmen yaitu: (1) korpuskel renalis (Malpighi); (2) Tubulus kontortus proksimal; (3) Segmen tipis; (4) Segmen tebal; (5) Lengkung Henle; (6) Tubulus kontotortus distal; (7) Tubulus; dan (8) Duktus koligentes (gambar 2.7).
Gambar 2.7 Struktur nefron (Junqueira, et al., 2007)
Bowman berjumlah lebih dari satu juta unit dalam satu ginjal (gambar 2.8) (Junqueira, et al., 2007).
Gambar 2.8 A. Gambaran histologi glomerulus ginjal, (CL: Capylary lumen, MES: mesangium; END:endothelium; EP: visceral epithelia
cells); dan B. Skema glomerulus (Kumar, 2010)
korpuskel renal, reabsorbsi pada saluran tubular dan sekresi pada epitel tubulus (Silverthone, 2001).
Tubulus kontortus proksimal dimulai dari korpuskel ginjal, panjangnya sekitar 14 mm dengan diameter 50-60 µm dan berkelok membentuk lengkungan yang menghadap ke permukaan kapsula ginjal dan berakhir sebagai saluran lurus menuju tempat tubulus melanjutkan diri dengan ansa Henle. Fungsi tubulus kontortus proksimal adalah reabsorpsi filtrat glomerulus dengan proses aktif melalui pompa natrium (Na+/K+ATPase) yaitu mengabsorbsi seluruh glukosa, asam amino, lebih kurang 85% NaCl dan air dari filtrat, selain fosfat dan kalsium (Junqueira, et al., 2007).
Epitel yang melapisi tubulus ini adalah selapis kuboid atau silindris yang menunjang dalam mekanisme absorbsi dan ekskresi. Sel-sel epitel ini memiliki sitoplasma asidofilik yang disebabkan oleh adanya mitokondria panjang dalam jumlah besar. Apeks sel memiliki banyak mikrovili dengan panjang sekitar 1 μm, yang membentuk suatu brush border (Junqueira, et al., 2007).
Tubulus kontortus distal dimulai sesudah ansa Henle segmen tebal dan bentuknya berkelok-kelok. Tubulus ini dilapisi oleh sel epitel selapis kuboid dan berbeda dengan tubulus proksimal karena tidak mempunyai sel brush border,
Fungsi dari ginjal sebagian besar untuk mempertahankan kestabilan lingkungan cairan internal meliputi:1) Mengatur keseimbangan H2O dalm tubuh; 2) Mengatur jumlah dan konsentrasi ion cairan ekstra sel termasuk Na+, Cl-, K+, HCO3-, Mg++, SO4=; 3) Memelihara volume plasma sehingga sangat berperan dalam pengaturan jangka panjang tekanan darah arteri; 4) Memelihara keseimbangan asam basa tubuh dengan menyesuaikan pengeluaran H+dan HCO3 -melalui urin; 5) Memelihara osmolaritas (konsentrasi zat terlarut) berbagai cairan tubuh melalui pengaturan H2O; 6) Mengekskresikan produk sisa metabolisme tubuh; 7) mengekskresikan senyawa asing misalnya obat, bahan tambahan makanan, pestisida dan bahan eksogen yang masuk kedalam tubuh; 8) mengekskresikan eritropoietin (hormon yang merangsang pembentukan sel darah merah); 9) Mengekskresikan rennin; dan 10) Mengubah vitamin D menjadi bentuk aktifnya (Sherwood, 2001).
terutama terjadi pada tubulus kontortus proksimalis, tubulus kontortus proksimalis juga mempunyai epitelium yang mudah bocor bila dibandingkan dengan tubulus kontortus distalis yang relatif rapat dan mempunyai ketahanan elektrik tinggi, maka diduga tubulus kontortus proksimalis akan mengalami kerusakan yang lebih berat apabila dibandingkan dengan tubulus kontortus distalis (Muliani, 2006).
Hal ini seperti penelitian yang dilakukan Abbas, et al. (2011) yang menyebutkan bahwa pemberian MSG pada tikus dengan dosis 830 mg/kgBB selama 28 hari secara oral akan menyebabkan terjadinya perubahan histopatologi pada ginjal, seperti terlihatnya pembengkakan pada endothelium glomerulus yang berhubungan dengan atropi glomerulus, dan juga terdapat degenerasi hidropic tubula dengan dilatasi tubula dan hyaline casts. Pada daerah inter tubula memperlihatkan adanya dilatasi dan kongesti pada pembuluh darah kortikal dengan haemorroge diantara tubula (Gambar 2.9 dan 2.10).
Gambar 2.10 Gambaran bagian ginjal tikus yang mendapat MSG memperlihatkan degenerasi hidropik dan
vakuolisasi tubulus (panah), dilatasi tubulus (D) dengan hyaline casts (C) (Abbas, et al., 2012)
Ketika sel mengalami stres fisiologis atau patologis sel bisa beradaptasi mencapai kondisi baru dan mempertahankan kelangsungan hidupnya. Dalam batas tertentu bersifat reversibel dan sel akan kembali ke kondisi semula. Stres yang berat atau menetap menyebabkan cedera ireversibel dan sel yang terkena menjadi mati (Kumar, et al., 2010).
2.7 Kerangka Teori
Gambar 2.13 Kerangka Teori
Reactive Oxygen Species (ROS)
Stres oksidatif
Peroksidasi lipid
ginjal
Ekstrak etanol kulit manggis
Keterangan
: menghambat
: memacu
Perubahan makroskopis, mikroskopis dan tampilan immunohistokimia antioksidan
CU Zn SOD pada ginjal
MSG
BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Desain Penelitian
Jenis penelitian ini adalah eksperimental laboratorium dengan rancangan
the post testonly control group dengan cara membandingkan hasil observasi pada kelompok perlakuan (eksperimen) dengan kelompok kontrol.
3.2. Tempat dan Waktu penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA) USU sebagai tempat dimulainya proses aklimatisasi, pemberian perlakuan dan pembedahan hewan coba selama 6 minggu, Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU untuk pembuatan dan pembacaan preparat immunohistokimia dan laboratorium Farmasi USU untuk pembuatan ekstrak etanol kulit manggis. Penelitian ini di laksanakan dari Januari 2012 hingga Juli 2013.
3.3. Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1. Populasi Penelitian
Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit (Mus musculus.L), Strain DDW (Double Distsch Webster) dewasa, jenis kelamin
3.3.2. Sampel penelitian
Besar sampel yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan rumus Federer (Wahyuni, 2010)
Dimana :
n = besarsampel dalam kelompok perlakuan
t = banyaknya kelompok perlakuan (5 kelompok perlakuan) Banyak sampel yang dibutuhkan dalam kelompok :
{(5 – 1) (n -1)} ≥ 15 4 (n –1) ≥ 15
4n –4 ≥ 15 4n ≥ 19 n ≥ 5
Maka jumlahnya adalah 5 ekor per kelompok, sehingga jumlah keseluruhan hewan coba yang diperlukan dalam penelitian ini adalah 25 ekor mencit jantan dewasa
Sampel penelitian adalah 25 ekor mencit jantan strain DDW yang dipilih dengan tekhnik acak sederhana. Sampel dikelompokkan atas lima kelompok, yakni kelompok I sebagai kontrol, sedangkan kelompok II sampai V adalah kelompok perlakuan.
3.4.Kriteria sampel 3.4.1. Kriteria inklusi
- Mencit jantan strain DDW
- Umur 8-12 minggu - Berat badan 25- 30 g
- Selama observasi 7 hari sebelum perlakuan, mencit tidak sakit, aktivitas dan tingkah laku normal.
3.4.2. Kriteria ekslusi
- Mencit dalam kondisi sakit. - Gerakan tidak aktif.
3.5. Variabel Penelitian 3.5.1. Variabel Bebas
Ekstrak kulit buah manggis
MSG
Vitamin E 3.5.2. Variabel tergantung
Gambaran makroskopik ginjal meliputi berat, warna dan konsistensi
3.7 Definisi Operasional
- Mencit (Mus musculus) merupakan hewan mamali dengan diklasifikasikan sebagai berikut: Kingdom Animalia, Filum Chordata, Klas Mamalia, Ordo
Rodentia, Famili Muridae, Genus Mus, Spesies M. musculus (Wikipedia, 2012). Pada penelitian ini digunakan 25 ekor mencit jantan strain DDW, umur 8 - 12 minggu, berat badan 25 - 30 gr, yang berasal dari Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,USU.
- Aklimatisasi merupakan suatu upaya penyesuaian fisiologis atau adaptasi dari suatu organisme terhadap suatu lingkungan baru yang akan dimasukinya, pada penelitian ini aklimatisasi hewan dilakukan selama satu minggu (IACUC, 2012).
- Kelompok perlakuan adalah kelompok hewan percobaan yang digunakan untuk penelitian, Pada penelitian ini hewan yang digunakan adalah mencit yang dibagi atas lima kelompok perlakuan sebagai berikut:
- Kelompok I (P0): kelompok kontrol tanpa diberi MSG, Vitamin E dan Ekstrak manggis, hanya diberi aquadest sebanyak 0,3 ml/mencit/hari dengan cara dicekok menggunakan jarum oral (gavage) dari hari pertama sampai hari ke- 35
- Kelompok II (P1): kelompok perlakuan yang diberi MSG 8 mg/gr BB setiap hari sebanyak 0,3ml/mencit/hari dengan cara dicekok menggunakan jarum oral (gavage) setiap hari selama 21 hari.
menggunakan jarum oral (gavage) setiap hari selama 21 hari dan pada hari ke-22 sampai hari ke-35 dilanjutkan dengan pemberian Ekstrak etanol kulit manggis 600 mg/kb/bb sebanyak 0,36 ml selama 14 hari.
- Kelompok IV (P3): kelompok perlakuan yang diberi MSG 8 mg/g BB setiap hari sebanyak 0,3 ml/mencit/hari dengan cara dicekok menggunakan jarum oral (gavage) setiap hari selama 21 hari dan pada hari ke-22 sampai hari ke-35 dilanjutkan dengan pemberian pemberian vitamin E 0,2mg/g bb selama 14 hari.
- Kelompok V (P4): kelompok perlakuan yang diberi ekstrak etanol kulit manggis dengan dosis 600 mg/kb/bb sebanyak 0,36 ml selama 14 hari dengan cara dicekok menggunakan jarum oral (gavage) setiap hari.
Masing-masing dari setiap kelompok P0, P1, P2, P3 dan P4 secara acak 5 ekor mencit didekapitasi, kemudian dilakukan penilaian perubahan makroskopik (berat, warna dan konsistensi ginjal), mikroskopis dengan pewarnaan HE dan kandungan antioksidan endogen Cu Zn SOD dengan pewarnaan immunohistokimia.
Buah manggis yang digunakan didapat dari daerah pantai Gemi, Stabat, Sumatera Utara.
- Monosodium glutamat (MSG) dengan rumus kimia C5H8O4NNaH2O terdiri atas Natrium sebanyak 12%, glutamat 78% dan air 10%, adalah garam sodium “L glutamat acid” yang mudah larut dalam air dan tidak berbau, dibuat
melalui proses fermentasi dari tetes gula (molases) oleh bakteri
Brevibacterium lactofermentum. Dari fermentasi ini dihasilkan asam glutamat. Asam glutamat kemudian ditambah soda (Natrium karbonat) sehingga terbentuk monosodium glutamat (MSG), kemudian dimurnikan dan dikristalisasi, sehingga merupakan serbuk kristal murni. Dosis yang diberikan adalah 8 mg/gr BB selama 21 hari dengan dicekok menggunakan jarum
gavage (Thomas, et al., 2009). Pada penelitian ini menggunakan Ajinomoto 29 gr (BPOM RI MD245813034037), diproduksi oleh PT Ajinomoto Indonesia, Mojokerto 61352- INDONESIA.
- Vitamin E merupakan antioksidan non enzimatis yang mampu mendonorkan ion hidrogen dan dapat mengubah radikal peroksil menjadi radikal tokoferol yang kurang reaktif sehingga tidak mampu menyerang rantai asam lemak. Dosis yang diiberikan sebanyak 0,2 mg/kg BB (Tawfik, et al., 2012) pada penelitian ini digunakan DL-A-TOCOPHERYL ACETATE, nomor produk: 0420085, lot no.: UT08010021, no. analisis: 03614504
- Gambaran makroskopis ginjal mencit yaitu penilaian yang meliputi berat ginjal, warna dan konsistensi. Ginjal normal berwarna merah kecoklatan, dan konsistensinya kenyal (Anggraini, 2008).
- Kriteria abnormal bila ditemukan: a.Perubahan berat ginjal b.Perubahan warna c.Perubahan konsistensi Derajat kerusakan ginjal:
0 (normal) =Tidak terdapat kelainan.
+ 1 (ringan) =Jika ditemukan 1 dari tiga kriteria di atas + 2 (sedang) =Jika ditemukan 2 dari tiga kriteria di atas + 3 (berat) =Jika ditemukan ketiga kriteria di atas
ke-4 bagian tersebut kemudian dijumlahkan dan dibagi empat. Kemudian tingkat kerusakan ginjal dinilai sebagai berikut: (Santoso, et al., 2006)
- Skor 1 (Normal) = Bila tidak ditemukan kerusakan ginjal
- Skor 2 (Ringan) = Bila luas kerusakan ginjal seluas < 25%
- Skor 3 (Sedang) = Bila kerusakan ginjal seluas 26-50%
- Skor 4 (Berat) = Bila kerusakan ginjal seluas > 50%
- Untuk memeriksa antioksidan endogen Cu Zn SOD digunakan tehnik pewarnaan immunohistokimia menggunakan SOD-1 polyclonal Antibody
(3458-100, PT. Bio Vision, pengenceran 1:50). Jaringan ginjal yang telah dipotong secara serial, diwarnai dengan pewarnaan immunohistokimia Cu Zn SOD dan diamati di bawah mikroskop cahaya, dengan pembesaran mulai 40x, 100x dan 400x
- Hasil pulasan immunohistokimia antioksidan Cu Zn SOD adalah tampilan pulasan berwarna coklat pada inti dan sitoplasma dari sel epitel pelapis glomerulus, tubulus renalis, serta daerah medulla (Wresdiyati, et al., 2006), dinilai tampilan pewarnaan berupa:
- Positif: tertampil warna coklat pada inti dan sitoplasma dari sel epitel pelapis glomerulus, tubulus renalis, serta daerah medulla.
- Untuk menilai hasil pewarnaan immunohistokimia antioksidan endogen Cu Zn SOD digunakan kontrol positif jaringan yang berasal dari hepar.
- Penilaian pewarnaan immunohistokimia merupakan hasil perkalian antara intensitas tampilan coklat dengan luas tampilan, dan hasil tersebut dibuat skor sebagai berikut: (Svensk, et al., 2004)
- 0 = negatif
- 1-3 = tampilan lemah
- 4-6 = tampilan sedang
- 7-9 = tampilan kuat
Penilaian Intensitas tampilan warna coklat yang dibandingkan dengan warna coklat yang tertampil pada kontrol positif dan diberi kategori sebagai berikut:
- 0 = Tidak tertampil / negatif
- 1 = Intensitas warna coklat tertampil lemah
- 2 = Intensitas warna coklat tertampil sedang
- 3 = Intensitas warna coklat tertampil kuat
Sedangkan penilaian luas tampilan hasil pewarnaan diberi skor sebagai berikut:
- 0 = Tidak tertampil
- 1 = Luas tampilan warna coklat < 25% yang terwarnai positif
- 3 = Luas tampilan warna coklat > 50% yang terwarnai positif.
3.8. Bahan dan Alat Penelitian
Bahan-bahan yang dibutuhkan dalampenelitian
a. Ekstrak etanol kulit manggis yang didapat dari Pericarp buah manggis yang telah dideterminasi di Herbarium Medanense Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam (MIPA) Universitas Sumatera Utara. b. MSG
c. Vitamin E
d. Mencit jantan strain DDW dengan umur 8-12 minggu, mempunyai berat badan berkisar 25 – 30 gram, berasal dari FMIPA USU.
e. Pakan standar mencit berupa pellet produksi PT. Charoen Pokphan Medan yang dicampur jagung halus dengan perbandingan 2 : 1.
f. Reagensia untuk pembuatan preparat histologi ginjal. g. Reagensia untuk pewarnaan HE.
h. Regensia untuk pewarnaan immunohistokima antioksidan copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD).
Peralatan yang dibutuhkan dalam penelitian a. Kandang mencit dan perlengkapannya
b. Jarum gavage untuk cekok tikus, timbangan, sekam padi. c. Peralatan pembuatan preparat histologi ginjal
e. Peralatan untuk pewarnaan immunohistokomia antioksidan copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD)
f. Peralatan untuk membuat ekstrak kulit buah manggis (timbangan, oven, mesin penggiling, bejana tertutup, rotary evaporator)
g. Timbangan tikus, gelas arloji, bak bedah dan dissecting set, cawan petri, batang pengaduk, sarung tangan, masker, kertas milli.
h. Mikroskop binokuler
3.9. Etika Penelitian
Penggunaan dan penanganan hewan di laboratorium penelitian dilakukan sesuai dengan aturan etika penelitian hewan yang diatur dalam deklarasi Helsinki dan Ethical clearance diperoleh dari komite etik Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) USU Medan.
3.10 Pelaksanaan penelitian
3.10.1 Persiapan dan pemeliharaan hewan percobaan
setiap hari secara ad libitum dan pakan yang diberikan berupa pellet c-0,5
produksi PT. Chaeron Pokphan Medan. Cahaya ruangan, kelembaban ruangan dan suhu berada pada kisaran alamiah. Sampel yang terdiri dari 25 mencit dibagi secara acak dalam lima kelompok, masing-masing kelompok lima ekor. Tiap kelompok diberi kode kelompok I, II, III, IV dan V.
Perlakuan diberikan sesuai dengan kelompok. Sebelum perlakuan, lebih dulu dilakukan penimbangan berat badan tikus. Pakan diberikan setelah perlakuan dilakukan berupa pelet dicampur jagung halus dengan perbandingan 2 : 1 diberikan secara setiap pagi hari jam ± 10.00-11.00 WIB sebanyak 2,5-5 gr/hari/mencit serta air minum adlibitum dari Perusahaan Air Minum (PAM). Tabel 3.1. Dosis pemberian Ekstrak etanol kulit manggis pada kelompok
perlakuan
Kelompok Dosis Ekstrak etanol kulit manggis
I (P0) Kontrol
MSG + Ekstrak Manggis 600mg /kg bb MSG + Vitamin E (0,2mg/g bb) Ekstrak Manggis 600mg /kg bb
3.10.2 Prosedur pembedahan hewan mencit
bedah seperti gunting bedah, pinset, gelas arloji, cawan petri, papan bedah, pins, beker glas.
Tahap pembedahan, mencit dikorbankan secara neck dislocation. Mencit diposisikan pada papan bedah menggunakan pins dan di bedah mulai dari bagian perut menggunakan gunting bengkok. Organ ginjal diambil, dibersihkan dari kotoran yang menempel, dicuci dengan menggunakan NaCl 0,9% sampai bersih. Secara makroskopik, ditimbang berat dan diamati perubahan warna, konsistensi dan permukaan pada ginjal, setelah itu dimasukkan kedalam pot berisi formalin buffer 10%.
Tahap sanitasi dilakukan dengan cara memasukkan sisa organ mencit yang tidak terpakai dalam kantong plastik yang akan dibuang. Tempat kerja sisa melakukan pembedahan dibersihkan dan semua peralatan bedah yang terpakai dibersihkan.
3.10.3 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Buah Manggis
Sebanyak 2262,8 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana tertutup rapat dan dibasahi dengan etanol 96% sampai semua serbuk terendam, biarkan selama lima hari sambil diaduk 3-4 kali sehari. Setelah itu massa dipindahkan kedalam corong dan disaring menggunakan kertas penyaring. Hasil penyaringan yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator. Diperoleh ekstrak kental sebanyak 700 gram (BPOM, 2010).
3.10.4 Prosedur pembuatan preparat histologi ginjal mencit
Sampel jaringan ginjal mencit diambil dan dicuci dengan NaCl fisiologis, kemudian difiksasi dengan larutan formalin buffer 10% (0,1 mol/L Phospat Buffer saline) PH 7, selama 6-48 jam. Kemudian dilakukan dehidrasi dengan menggunakan alkohol 70%, 80%, 96%, dan alkohol absolut masing-masing 1 jam untuk pengeluaran air dari jaringan tersebut. Clearing atau penjernihan menggunakan xylol 1, 2 dan 3 selama 1 jam setelah itu dilakukan Impregnasi (penyusupan parafin) dengan parafin cair 1 dan 2 suhu 60-70oC masing-masing selama 2 jam. Pada penelitian ini menggunakan mesin tissue prosescing otomatis dengan merk Leica TP 1020.
Embedding (parafinisasi) yaitu pembuatan blok parafin dengan cara penanaman jaringan dalam kaset dan didinginkan, kemudian dilakukan proses
entelan, kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran mulai dari 40x, 100x dan 400x.
3.10.5 Prosedur pewarnaan Hematoxylin Eosin
Blok sediaan preparat yang telah diparafinisasi dicelupkan kedalam cairan
xylol yang ke 1, kemudian dicelupkan lagi kedalam larutan xylol ke 2 dan terakhir kedalam larutan xylol yang ke 3 masing-masing selama 1 menit. Kemudian dilakukan rehidrasi dengan alkohol absolut, alkohol 96%, alkohol 80%, dan alkohol 50% masing-masing 1 menit, kemudian dicuci dibawah air mengalir selama 1 menit dan dicelupkan kedalam larutan Mayer’s Hematoxylin selama 5
menit, bilas dengan air mengalir selama 30 detik, kembali dicelupkan kedalam larutan acid alkohol 1% : 15-30 detik, cuci kembali dengan air mengalir selama 2 menit kemudian blok sediaan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan agar tidak ada lagi sisa dari air, setalah itu dilakukan pewarnaan eosin selama 2-3 menit kembali dicuci dibawah air mengalir selama 30-60 detik. Kembali dicelupkan kedalam alkohol 95% dan alkohol absolut lebih kurang sebanyak 10 kali celupan, kemudian dicelupkan lagi kedalam xylol I selama 1 menit dan xylol
II selama 2 menit. Tetesi cairan permount dan tutup dengan deck glass dan entelan, proses terakhir adalah blok sediaan diamati dibawah mikroskop cahaya merk Olympus CX21.
3.10.6 Prosedur Pewarnaan Immunohistokimia
sisa xylol dengan menggunakan larutan alkohol absolut, alkohol 96%, alkohol 80%, dan alkohol 70% masing-masing selama 4 menit, kemudian dicuci di bawah air mengalir selama 5 menit. Masukkan slide ke dalam mesin pengering merk PT. Link Dako Epitope Retrieval, kemudian diatur set up Preheat 65oC, running time
98oC selama 15 menit, tunggu sampai ± 1 jam, setelah slide kering, dengan menggunakan spidol pap pen, preparat yang ada di slide dilingkari agar pada saat penetesan antibodi atau cairan lainnya tidak keluar melewati batas lingkaran pap pen tadi. Segera masukkan slide kedalam larutan Tris Buffered Saline (TBS) pH
7,4 selama 5 menit, kemudian dilakukan blocking dengan peroxidase, selama 5-10 menit, kemudian kembali dicuci dalam larutan Tris Buffered Saline (TBS) pH
7,4 selama 5 menit blocking kembali dengan Normal horse serum (NSH) 3%, selama 15 menit, cuci dalam larutan Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 selama 5 menit. Setelah itu di inkubasi menggunakan SOD-1 polyclonal Antibody (3458-100, PT. Bio Vision, pengenceran 1:50) masing-masing selama 1 jam. Cuci kembali kedalam larutan Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 atau Tween 20 selama 5 menit, kemudian tetesi dengan antibodi sekunder merk Dako Real Envision Rabbit/Mouse selama 30 menit. Setelah itu slide kembali dicuci dalam larutan Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 atau Tween 20 selama 5-10 menit. Kemudian slide
ditetesi dengan DAB + Substrat Chromogen solution dengan pengenceran 20µL
