Laporan Praktikum Protein Biuret

(1)

I. JUDUL : Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

II. HARI/TANGGAL : Kamis, 23 Oktober 2014

III. TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan cara biuret

IV. DASAR TEORI :

Secara umum, sumber dari protein adalah dari sumber nabati dan hewani. Protein sangat penting bagi kehidupan organisme pada umumnya, karena ia berfungsi untuk memperbaiki sel-sel tubuh yang rusak dan suplai nutrisi yang dibutuhkan tubuh. Maka, penting bagi kita untuk mengetahui tentang protein dan hal-hal yang berkaitan dengannya. Struktur protein tidak stabil karena mudah mengalami denaturasi, yaitu keadaan dimana protein terurai menjadi struktur primernya, baik reversibel maupun irreversibel. Faktor-faktor yang menyebabkan denaturasi adalah pH, panas, pelarut, kekuatan ion zat terlarut, dan radiasi. Protein ada yang reaktif karena asam amino penyusunnya mengandung gugus fungsi yang reaktif, seperti SH, -OH, NH2, dan –COOH. Kelarutan protein di dalam suatu cairan, sesungguhnya sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain, pH, suhu, kekuatan ionik dan konstanta dielektrik pelarutnya.

Telur puyuh memiliki ciri khas unik yang berbeda dengan jenis telur lainnya yaitu berbentuk oval, mungil, berwarna putih keabuan dengan corak hitam kecoklatan dan memiliki berat antara 10 hingga 12 gram perbutirnya. Telur yang memiliki genus Conturnix ini memang mudah di dapat dengan harga yang relative murah.

Dalam 100 gram telur puyuh mengandung 13,05 gram protein, sedikit lebih tinggi dari telur ayam dan telur bebek. Dari kandungan protein yang tinggi ini menyimpan satu keunggulan, yaitu memiliki daya cerna yang sangat tinggi, artinya setiap gram protein yang masuk akan dicerna di dalam tubuh secara sempurna. Oleh karena itu, telur puyuh merupakan sumber protein terbaik. Telur puyuh mempunyai beberapa manfaat yaitu:

1. Sebagai nutrisi otak dari kandungan 263,4 mg kolin dalam 100 gramnya. Manfaat ini sangat membantu untuk memperkuat daya

▸ Baca selengkapnya: biuret mengandung zat

(2)

ingat bagi anak- anak, menghindari kepikunan bagi orang tua lanjut usia, mengurangi resiko kematian pada janin bagi ibu hamil, mendukung perkembangan otak bayi secara optimal bagi ibu menyusui, juga mempertahankan fungsi otak agar tetap bugar dan memperbaiki memori otak yang rusak bagi mereka dalam usia produktif,

2. Untuk melindungi mata dari kandungan senyawa lutein dan zeaksatin. Dari kedua senyawa inilah yang memberikan pigmen berwarna kuning, sehingga dapat membantu melindungi mata dari kerusakan dengan cara memfilter sinar biru yang berasal dari pancaran sinar matahari, layar televisi, ataupun komputer bagi bayi dan anak- anak.

3. Untuk mereduksi resiko penyakit kanker dan tumor dari kandungan leutin dan zeaksatin

Untuk mendapat manfaat tersebut, hendaknya makan secukupnya atau dengan kata lain berada dalam batas yang normal dan tidak sering dikonsumsi untuk menghindari terjadinya hal- hal yang tidak diinginkan. Apabila konsumsi telur puyuh secara berlebihan dan berulang- ulang, kemungkinan dapat terjadi alergi pada semua usia yang ditandai dengan gatal- gatal, merah, mual, muntah, pusing dan bentuk alergi lainnya. Selain itu juga dapat menimbulkan jerawat pada usia remaja hingga kolesterol yang bisa menyerang dari usia anak- anak hingga dewasa.

Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu, secara kualitatif terdiri atas: reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi. Secara kuantitatif terdiri dari ; metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV. Metode Biuret Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif

(3)

yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet. Reaksinya yang terbentuk adalah sebagai berikut:

Konsentrasi larutan yang dianalisis sebanding dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terdapat dalam larutan tersebut. Dalam hal ini, hukum Lambert-Beer dapat menyatakan hubungan antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan. Di bawah ini adalah persamaan Lambert-Beer:

A = - log T = εb c

Dengan A = absorban ; T = transmitan; ε = absortivitas molar (Lcm-1_.mol -1_{) ; b = panjang sel (cm) ; dan c = konsentrasi zat (mol/L).}

(4)

Spektrum absorpsi yang diperoleh dari hasil analisis dapat memberikan informasi panjang gelombang dengan absorbansi maksimum dari senyawa atau unsur. Panjang gelombang dan absorbansi yang dihasilkan selama proses analisis digunakan untuk membuat kurva standar. Konsentrasi suatu senyawa atau unsur dapat dihitung dari kurva standar yang diukur pada panjang gelombang dengan absorbansi maksimum. Dari kurva standar kalibrasi, diperoleh persamaan garis: y = ax + b

Dimana y merupakan serapan dan x adalah konsentrasi unsur atau senyawa. Dengan persamaan garis tersebut dapat ditentukan konsentrasi sampel. Pada spektrofotometer UV-Vis, warna yang diserap oleh suatu senyawa atau unsur adalah warna komplementer dari warna yang teramati. Hal tersebut dapat diketahui dari larutan berwarna yang memiliki serapan maksimum pada warna komplementernya. Namun, apabila larutan berwarna dilewati radiasi atau cahaya putih, maka radiasi tersebut pada panjang gelombang tertentu akan diserap secara selektif sedangkan radiasi yang tidak diserap akan diteruskan.

V. ALAT DAN BAHAN

1. Alat:

a. Tabung reaksi 9 buah b. Pipet gondok 1 buah c. Gelas kimia 7 buah d. Gelas ukur 1 buah e. Spatula 1 buah 2. Bahan :

a. Larutan standar protein b. Larutan sampel protein c. Reagen biuret

(5)

1 ml larutan standar protein dengan kadar 1mg, 2mg,3mg, 4mg, 5mg per ml protein

Absorbansi Ditambah 4 ml reagen biuret

Dikocok

Diinkubasi pada suhu 39oC selama 10 menit

Dibiarkan pada suhu ruang selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil dan sempurna Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis

1 ml aquades

Absorbansi Ditambah 4 ml reagen biuret Dikocok

Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis

VI. ALUR KERJA

Pembuatan Larutan standar

(6)

0.4 gram putih telur puyuh

Absorbansi

Dilarutkan pada 100 mL air

1 ml putih larutan sampel

Dikocok

Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis Penetapan absorbansi larutan sampel

(7)

1 ml larutan standar protein dengan kadar 1 mg, 2 mg,3 mg, 4 mg, 5 mg per ml protein

Dikocok

Dibiarkan pada suhu ruang selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil dan sempurna Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis

VII. HASIL PENGAMATAN

Prosedur Percobaan Hasil Pengamatan Dugaan/Reaksi Kesimpulan Pembuatan larutan standar  Larutan Standar: tidak

berwarna

 H2O: tidak berwarna  Reagen biuret : larutan

biru jernih

 Volume pengenceran bertahap 5mg/l hingga 1 mg/l pada labu ukur 10 mL: a. V1 = 5 ml b. V2 = 8 ml c. V3 = 7.5ml d. V4 = 6.67 ml e. V5 = 5 ml

Kandungan senyawa/zat pada reagen biuret :

CuSO4 → memberikan kompleks berwarna

NaOH → memberikan suasana basa (mengubah Cu2+

→ _Cu+₎

Larutan ion Cu2+_membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein sehingga menghsilkan warna ungu dengan absorbansi dari panjang gelombang ( λ ) maksimal 540 nm

Reaksi :

CuSO4.5H2O(aq) + 2NaOH(aq) 

Dari spektrosfotometri UV-Vis didapatkan persamaan :

Y=0.04649x dengan R2_{= 0,98296}

Dari microsoft excel didapatkan

persamaan:

Y=0.0476x -0.004 R2_{= 0.9825}

(8)

Sebelum :

 Larutan standar berbagai konsentrasi : tidak berwarna

Sesudah :

 Larutan standar + Reagen Biuret : larutan biru jernih

 Larutan standar + r. Biuret + diinkubasi : larutan biru-ungu  Kepekatan larutan dari

pekat sampai tidak pekat (ungu-biru tua keunguan)

5mg> 4mg> 3mg> 2mg> 1mg

Cu(OH)2(aq) + Na2SO4(aq) + 5H2O(l) Dalam suasana basa

(9)

C (mg/ml) A 1 0.043 2 0.091 3 0.132 4 0.203 5 0.225

Dari sepktrosfotometri UV-Vis didapatkan persamaan : y = 0,0395x + 0,02942 R2_{= 0,99618}

2. Penetapan absorbansi larutan blanko Sebelum :

 Aquades : tidak berwarna

 Reagen biuret : biru

Larutan blangko aquades adalah 0

(10)

1 ml aquades

Dikocok

Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis jernih

Sesudah :

 Aquades + reagen biuret : biru jernih (+)

Penetapan absorbansi larutan sampel Sebelum :

(11)

0.4 gram putih telur puyuh

Absorbansi

Dilarutkan pada 100 mL air

1 ml sampel

Absorbansi

Ditambah 4 ml reagen biuret Dikocok

Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis

dan encer

 Reagen biuret : biru jernih

Sesudah :

 Sampel + reagen biuret : biru jernih

 Sampel + reagen biuret + diinkubasi : biru (+) Sampel Absorbansi Sampel 1 0.095 Sampel 2 0.039 Sampel 3 0.029

literatur 13, 6% dari grafik excel didapatkan kadar protein rata-rata sebesar 3.05%

(12)

VIII. ANALISIS DATA DAN PEMBAHASAN Pembuatan Larutan Standar

Pada percobaan ini terlebih dahulu membuat lima larutan standar dengan kadar yang berbeda- beda, yaitu 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, dan 5 mg dari larutan induk yang sama. Kemudian masing- masing larutan standar protein dari kadar yang berbeda- beda tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 1 mL. Lalu masing- masing tabung reaksi ditambahkan 4 mL reagen biuret dan dikocok. Reagen biuret dapat dibuat dengan mencampurkan larutan NaOH dengan CuSO4 yang sesuai dengan persamaan reaksi sebagai berikut:

CuSO4.5H2O(aq) + 2NaOH(aq)  Cu(OH)2(aq) + Na2SO4(aq) + 5H2O(l)

Penambahan biuret mengakibatkan larutan yang awalnya tidak berwarna menjadi biru, jernih. Hal ini dikarenakan ion Cu2+_{dalam pereaksi} biuret dapat membentuk kompleks dengan ikatan peptida pada larutan induk protein, yang sesuai dengan reaksi di bawah ini:

(13)

Kemudian diinkubasi pada suhu 39°C selama 10 menit yang bertujuan menstabilkan senyawa kompleks yang terbentuk dari reaksi antara ion Cu2+ dengan larutan induk protein. Setelah itu diukur absorbansi larutan standar ini pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis. Hasil absorbansinya adalah sebagai berikut:

Konsentrasi (mg/ml) Absorbansi 1 0,043 2 0,091 3 0,132 4 0,203 5 0,225

Dari data konsentrasi dan absorbansi pada larutan standar tersebut, didapatkan kurva seperti berikut ini:

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 f(x) = 0.05x - 0 R² = 0.98

Kurva Standar

konsentrasi (mg/mL) Absorbansi

Dari kurva larutan standar protein didapatkan persamaan y = 0,0476x + 0,004 denga regresi linear (R2_{) sebesar 0,9825. Persamaan garis tersebut akan} digunakan untuk menghitung kadar protein dalam larutan blanko dan larutan sampel.

(14)

Penetapan Absorbansi Larutan Blanko

Larutan blanko ini terbuat dari 1 mL aquades yang merupakan larutan tidak berwarna ditambah 4 mL reagen biuret, sehingga menghasilkan larutan berwarna biru jernih. Warna biru jernih ini menandakan tidak terbentuknya senyawa kompleks karena aquades tidak mengandung protein. Setelah itu larutan blanko diinkubasi pada suhu 39°C selama 10 menit agar mendapat kepekatan larutan secara maksimal. Kemudian diukur absorbansi larutan blanko ini pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis. Dari pengukuran tersebut didapatkan nilai absorbansi sebesar 0.

Penentuan Absorbansi Larutan Sampel

Pada penentuan absirbansi larutan sampel mula- mula sampel yang berupa putih telur puyuh ditimbang seberat 0,4 gr, kemudian diencerkan dengan 100 mL aqudes. Setelah itu sampel yang telah diencerkan diambil 1 mL dan dimasukkan masing ke dalam 3 tabung reaksi. Pada masing-masing tabung reaksi tersebut ditambahkan 4 mL reagen biuret kemudian dikocok sehingga menghasilkan larutan berwarna ungu jernih. Warna ungu ini menandakan ion Cu2+_{dalam pereaksi biuret dapat membentuk kompleks} dengan ikatan peptida pada larutan sampel protein. Setelah itu diinkubasi pada suhu 39°C selama 10 menit untuk menstabilkan senyawa kompleks yang terbentuk dari reaksi antara ion Cu2+_{dengan larutan sampel protein.} Kemudian diukur absorbansi larutan sampel ini pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis. Dari pengukuran tersebut didapatkan nilai absorbansi sebagai berikut.

C (m g/ m L) Absorb a n s i 2,044 0,095 0,837 0,039 0,617 0,029

(15)

Nilai absorbansi ini akan digunakan untuk mencari kadar protein dalam larutan sampel dengan menggunakan persamaan kurva larutan standar. y = 0,0476x + 0,004

dimana:

y = Absorbansi larutan sampel

x = Kadar protein dalam larutan sampel sehingga diperoleh:

Sampel 1

y = 0.0476x - 0.004

0.095 = 0.0476x – 0.004

x= 2.0798 mg/mL ( x adalah konsentrasi sampel) Sampel 2

y = 0.0476x - 0.004

0.039 = 0.0476x – 0.004

y = 0.0476x - 0.004

0.029 = 0.0478x – 0.004

x= 0.6933 mg/mL ( x adalah konsentrasi sampel) Kadar protein = _{masa protein}x x 100 % Sampel 1 2.0798 40 x 100% = 5.19 % Sampel 2 0.9034 40 x 100% = 2.25 % Sampel 3 0.6933 40 x 100% = 1.73 % Rata- rata = 5.19+2.25+₃ 1.73 = 3.05 %

(16)

IX. DISKUSI

Pada percobaan penentuan kadar protein dengan metode biuret ini di dapatkan sampel putih telur puyuh mengandung protein sebesar 3.05%. Hal ini tidak sesuai teori, dimana kadar protein pada putih telur puyuh sebesar 13%. Ketidaksesuaian ini disebabkan adanya pengotor (kromofor) pada sampel sehingga pada saat di uji dengan uv vis tidak dapat terdetekdi dengan baik, serta belum homogennya sampel dengan aquades sehingga sampel belum terlarut dengan baik.

X. KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan tersebut dapat disimpulkan bahwa kadar protein yang terkandung dalam sampel dapat ditentukan dengan metode Biuret dan pada percobaan ini didapatkan kadar protein di dalam sampel putih telur puyuh adalah 3.05%.

XI. JAWABAN PERTANYAAN

1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva standar tersebut tentukan kadar protein sampel.

(17)

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 f(x) = 0.05x - 0 R² = 0.98

Kurva Standar

konsentrasi (mg/mL) Absorbansi y = 0,0476x + 0,004 dimana:

y = Absorbansi larutan sampel

x = Kadar protein dalam larutan sampel sehingga diperoleh:

Sampel 1

y = 0.0476x - 0.004

0.095 = 0.0476x – 0.004

y = 0.0476x - 0.004

0.039 = 0.0476x – 0.004

y = 0.0476x - 0.004

0.029 = 0.0478x – 0.004

x= 0.6933 mg/mL ( x adalah konsentrasi sampel) Kadar protein = _{masa protein}x x 100 % Sampel 1

2.0798

40 x 100% = 5.19 % Sampel 2

(18)

0.9034 40 x 100% = 2.25 % Sampel 3 0.6933 40 x 100% = 1.73 % Rata- rata = 5.19+2.25+₃ 1.73 = 3.05 %

2. Apakah peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret? Jika benar demikian, bagaimana menemukan kadar protein yang tercampur dengan peptida ?

Jawab:

Iya, yaitu dengan cara mengukur absorbansi campuran larutan sampel yang mengandung protein dengan biuret dalam suasana basa yang menghasilkan larutan berwarna ungu, sehingga dapat terbaca pada daerah visibel, yaitu dengan panjang gelombang 520 nm, yang kemudian dapat kita buat grafik antara absorbansi dengan konsentrasi. Dari grafik yang kita buat tersebut, kita bisa mendapatkan persamaan garisnya, sehingga konsentrasi protein yang terkandung dalam sampel dapat kita ketahui melalui grafik tersebut. Sesuai dengan hukum Lambert-Beer nilai absorbansi ini berbanding lurus dengan harga konsentrasi protein yang terkandung di dalam sampel. Contohnya seperti pada grafik di atas.

XII. DAFTAR PUSTAKA

Achmad, Nurdin. 2011. Reaksi Analisa Protein.(http://skp.unair.ac.id) (diakses tanggal 18 Oktober 2014).

Anonim.2012.Analisa Protein dengan Metode Biuret.

http://www.wikipedia.org/analisa-protein-dengan-metode-biuret (diakses tanggal 18 Oktober 2014).

(19)

http://www.beritaterkinionline.com/2012/07/manfaat-dan-bahaya-telur-puyuh.html (diakses tanggal 22 Oktober 2014)

L. Lehninger, Albert. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Jilid 1. (Penerjemah: Maggy Thenawidjaja). Jakarta: Erlangga.

Tim. 2012. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Unesa UniPress.

(20)

Sampel ditimbang seberat 0,4 gr Sampel yang telah diencerkan

Larutan standart protein, larutan blanko Larutan standart protein, larutan blanko dan sampel dan sampel yang telah di inkubasi