Isolasi Senyawa Alkaloida Dari Biji Tumbuhan Jintan Hitam (Nigella Sativa L.) Serta Karakterisasi Isolat Secara Spektrofotometri Sinar Ultraviolet Dan Inframerah

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Uraian Tumbuhan 2.1.1 Habitat

Tumbuhan jintan hitam (Nigella sativa L.) merupakan salah satu

spesies dari genus Nigella yang memiliki kurang lebih 14 spesies tanaman

yang termasuk dalam famili Ranunculaceae (Widyaningrum, 2012). Jintan

hitam juga dikenal dengan nama daerah jinten hitam pahit, sedangkan nama

asingnya black cumin (Inggris), habbatussauda (Arab), kalonji (India)

(Mahendra, 2008).

2.1.2 Morfologi

Tanaman jintan hitam merupakan tanaman semak belukar dengan

ketinggian 50 cm. Tanaman ini memiliki batang tegak dan berusuk, daunnya

berbentuk lanset dan bergaris dengan panjang 1,5 sampai 2 mm. Ujungnya

runcing serta memiliki tiga tulang daun yang berbulu (Rahmi, 2011). Bunga

jintan hitam memiliki lima buah kelopak bunga yang berbentuk bulat telur,

pangkalnya mengecil membentuk sudut yang pendek (Widyaningrum, 2012),

ujungnya agak runcing sampai agak tumpul serta memiliki benang sari yang

tergolong banyak (Depkes, 1979).

Buah jintan hitam berbentuk bulat panjang dan berwarna coklat

kehitaman, biji kecil bersudut tiga sampai empat tidak beraturan, panjangnya

hitam kecoklatan, hitam kelabu sampai hitam, kasar dan berkerut

(Widyaningrum, 2012; Depkes, 1979).

2.1.3 Sistematika tumbuhan

Menurut Widyaningrum (2012) tanaman jintan hitam (Nigella sativa

L.) diklasifikasikan sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Divisio : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Ranunculales

Famili : Ranunculaceae

Genus : Nigella

Spesies : Nigella sativa L.

2.1.3 Kandungan kimia

Kandungan kimia biji Nigella sativa L. adalah saponin, polifenol

(Hutapea, 1994), alkaloida, steroida dan flavonoida (Liu, et al., 2011).

Kandungan kimia lainnya adalah protein, karbohidrat dan asam lemak esensial.

Disamping itu terdiri dari asam linoleat, asam oleat, kalsium, kalium, besi,

seng, magnesium, selenium, natrium, vitamin A, vitamin B1, vitamin B2,

niasin, vitamin C . Argin (untuk pertumbuhan bayi), 15 asam amino termasuk

delapan dari sembilan asam amino utama dan serat (Mahendra, 2008), karoten

yang akan diubah oleh hati menjadi vitamin A yang dikenal berfungsi sebagai

2.2 Uraian Kimia 2.2.1 Alkaloida

Alkaloida adalah suatu golongan senyawa organik yang terbanyak

ditemukan dialam. Hampir seluruh senyawa alkaloida berasal dari

tumbuh-tumbuhan yang tersebar luas dalam berbagai jenis tumbuh-tumbuhan. Semua alkaloida

mengandung paling sedikit satu atom nitrogen yang biasanya bersifat basa dan

pada sebagian besar alkaloid atom nitrogen ini merupakan bagian dari cincin

heterosiklik (Lenny, 2006). Menurut Harborne, alkaloida adalah senyawa

bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen yang terletak

dalam sistem siklik. Disamping itu alkaloida dapat didefinisikan sebagai suatu

senyawa yang mengandung nitrogen, bersifat basa, terdapat pada tanaman

dalam jumlah yang relatif kecil dan mempunyai aktivitas farmakologi.

Pengertian ini terlalu luas, karena tidak semua senyawa yang mengandung

nitrogen merupakan alkaloida. Protein, klorofil, asam amino misalnya

bukanlah alkaloida walaupun mengandung nitrogen. Hegnauer memberikan

batasan bahwa alkaloida adalah senyawa bersifat toksik yang bekerja terhadap

sistem syaraf pusat, bersifat basa, mengandung nitrogen heterosiklik, disintesa

dalam tumbuhan dari asam amino atau turunannya dan umumnya tersebar pada

tumbuh-tumbuhan (Farnsworth, 1966).

Klasifikassi alkaloida menurut Hegnauer (Farnsworth, 1966) adalah

1. Alkaloida Sejati

Alkaloida ini dibentuk atau berasal dari asam amino yang umumnya

mempunyai unsur nitrogen yang terikat pada cincin heterosiklik dan

kebanyakan bersifat basa seperti vinkristina dan reserpina, kecuali

kolkisina yang tidak mempunyai cincin heterosiklik dan tidak bersifat basa.

N

Gambar 2.1 Struktur alkaloida vinkristina

N

O

Gambar 2.3 Struktur alkaloida kolkisina

2. Protoalkaloida

Alkaloida ini dibentuk dari asam amino, tetapi unsur nitrogennya tidak

terikat pada cincin heterosiklik dan bersifat basa. Contohnya meskalina dan

3. Pseudoalkaloida

Alkaloid ini merupakan alkaloida bukan turunan asam amino, pada

umumnya mempunyai unsur nitrogen yang terikat pada cincin heterosiklik

dan biasanya bersifat basa. Alkaloida yang penting dari golongan ini adalah

alkaloida golongan purina seperti kafeina.

N

N

N H N

Gambar 2.6 Struktur alkaloida golongan purin

N

N N

N O

O

Gambar 2.7 Struktur alkaloida kafeina

Menurut Evans (2009), pembagian alkaloida berdasarkan letak atom

nitrogen adalah:

A. Non heterosiklik atau atipikal alkaloida, disebut juga protoalkaloida

atau amin biologis misalnya efedrina yang terdapat dalam Ephedra

distachya.

B. Heterosiklik atau tipikal alkaloida yang dibagi kedalam 12 grup

berdasarkan struktur cincinnya, yaitu:

1. Alkaloida golongan pirol dan pirolidina, contohnya higrina pada

H N

Gambar 2.8 Struktur alkaloida golongan pirol

H N

Gambar 2.9 Struktur alkaloida golongan pirolidin

N

CH3

H2

C C CH3

O

Gambar 2.10 Struktur alkaloida higrina

2. Alkaloida golongan pirolizidina, contohnya retronesina pada

Crotalaria retusa.

N

Gambar 2.11 Struktur alkaloida golongan pirolizidina

N HO

OH

H

3. Alkaloida golongan piridina dan piperidina, contohnya nikotin

pada tumbuhan Nicotiana tabaccum dan koniin pada tumbuhan

Conium maculatum. N

Gambar 2.13 Struktur alkaloida golongan piridina

N

N

CH3

Gambar 2.14 Struktur alkaloida nikotina

H N

Gambar 2.15 Struktur alkaloida golongan piperidina

N

H CH₂

H₂ C

CH₃

Gambar 2.16 Struktur alkaloida koniin

4. Alkaloida golongan tropan, contohnya atropin pada tumbuhan

Gambar 2.17 Struktur alkaloida tropan

CH3 N OCCH H3C

HO

O

Gambar 2.18 Struktur alkaloida atropin

5. Alkaloida isokuinolina, contohnya papaverina pada tumbuhan

Papaver somniferum.

N

Gambar 2.19 Struktur alkaloida golongan isokuinolina

N H₃CO

H₃CO

OCH3

OCH₃

6. Alkaloida golongan kuinolizidina, contohnya sitisina pada

tumbuhan Cytisus scoparius.

N

Gambar 2.21 Struktur alkaloida golongan kuinolizidina

N H

H NH

O

Gambar 2.22 Struktur alkaloida sitisina

7. Alkaloida golongan kuinolina, contohnya kuinina pada tumbuhan

Cinchona ledgeriana.

N

Gambar 2.23 Struktur alkaloida golongan kuinolina

CH HO

N

CH

OH3C

CH2

8. Alkaloida golongan indol, contohnya reserpina pada tumbuhan

Rauwolfia serpentina.

H N

Gambar 2.25 Struktur alkaloida golongan indol

N H

N

O H₃CO

OCH₃

OCH3

OCH3 H

COOCH3 H

H

OCH3 O

Gambar 2.26 Struktur alkaloida reserpina

9. Alkaloida golongan aporfina, contohnya morfina pada tumbuhan

Papaver somniferum.

N

10.Alkaloida golongan imidazol, contohnya pilokarpina pada

tumbuhan Pilocarpus jaborandi.

H N

N

Gambar 2.28 Struktur alkaloida golongan imidazol

N

Gambar 2.29 Struktur alkaloida pilokarpina

11.Alkaloida golongan purina, contohnya kafeina pada tumbuhan

Coffea arabica.

N

N

N H N

Gambar 2.30 Struktur alkaloida golongan purina

N

N N

N O

O

12.Alkaloida golongan steroida, contohnya solanidina pada tumbuhan

Solanum tuberosum.

Gambar 2.32 Struktur alkaloida golongan steroida

N

HO

CH₃

CH₃ H3C

CH3

Gambar 2.33 Struktur alkaloida solanidina

Fungsi alkaloida dalam tumbuhan belum diketahui secara pasti,

kemungkinan berfungsi sebagai penarik atau penghalau serangga, ataupun

dapat bersifat sebagai zat pengatur tumbuh. Namun dari hasil pengamatan

ternyata sebagian besar tumbuhan dapat melangsungkan kehidupan tanpa

melibatkan alkaloida. Hal ini menunjukkan bahwa alkaloida dalam tumbuhan

tidak begitu penting peranannya dan belum dapat dimengerti jelas (Harborne,

Alkaloida yang telah diisolasi berbentuk kristal dengan titik lebur

tertentu. Beberapa diantaranya berbentuk amorf dan sebagian kecil berbentuk

cair seperti nikotina dan koniina. Kebanyakan alkaloida tidak berwarna, tetapi

alkaloida yang berstruktur kompleks dan mempunyai ikatan rangkap

terkonjugasi kebanyakan berwarna, misalnya: berberina berwarna kuning,

betanina berwarna merah. Alkaloida dalam bentuk basa bebas umumnya larut

dalam pelarut organik (Cordell, 1981).

Sifat alkaloida yang paling umum adalah basa lemah, kebasaan dari

alkaloida ini bergantung pada ketersediaan pasangan elektron sunyi dari

nitrogen (Cordell, 1981). Bila gugus fungsi yang berdekatan dengan nitrogen

bersifat sebagai penolak elektron, seperti gugus alkali, maka ketersediaan

elektron disekitar nitrogen akan bertambah, mengakibatkan alkaloida bersifat

lebih basa. Sebaliknya bila gugus fungsi yang melekat pada nitrogen bersifat

sebagai penarik elektron, seperti gugus karbonil maka ketersediaan elektron

disekitar nitrogen akan berkurang, mengakibatkan alkaloida bersifat netral

bahkan sedikit bersifat asam (Lenny, 2006).

Sifat kebasaan alkaloida sangat berpengaruh terhadap kestabilannya.

Alkaloida dapat terurai oleh pengaruh oksigen, panas dan cahaya. Penguraian

alkaloida selama atau setelah isolasi dapat menjadi masalah yang serius jika

disimpan dalam waktu lama. Pembentukan garam dengan asam organik seperti

tartrat, sitrat atau asam anorganik seperti asam klorida, asam sulfat dapat

2.2.2 Glikosida

Glikosida adalah senyawa organik yang bila dihidrolisis menghasilkan

satu atau lebih gula yang disebut glikon dan bagian bukan gula yang disebut

aglikon. Gula yang paling sering dijumpai dalam glikosida adalah glukosa.

Glikosida dihidrolisis dengan cara pendidihan dalam asam encer. Secara kimia

dan fisiologi, glikosida alam cendrung dibedakan berdasarkan bagian

aglikonnya (Robinson, 1995).

Berdasarkan hubungan ikatan antara glikon dan aglikonnya, glikosida

dapat dibagi menjadi empat (Farnsworth, 1966) yaitu:

1. O-glikosida, jika ikatan antara glikon dengan aglikon dihubungkan oleh

atom O, contohnya: salisin

CH₂OH

O

C₆H₁₁O₅

Gambar 2.34 Struktur salisin

2. S-glikosida, jika ikatan antara glikon dengan aglikon dihubungkan oleh

atom S, contohnya: sinigrin

CHCH2C

CH

₂

NOSO

₃

K

C

₆

H

₁₁

O

₅

S

3. N-glikosida, jika ikatan antara glikon dengan aglikon dihubungkan oleh

atom N, contohnya: krotonosida

N N

N N NH2

OH

C5H9O4

Gambar 2.36 Struktur kronotosida

4. C-glikosida, jika ikatan antara glikon dengan aglikon dihubungkan oleh

atom C, contohnya: barbaloin

OH

H C6H11O5

CH2OH

OH O

Gambar 2.37 Struktur barbaloin

2.2.3 Saponin

Saponin merupakan senyawa aktif permukaan yang kuat, dapat

menimbulkan busa jika dikocok dalam air, pada konsentrasi rendah sering

menyebabkan hemolisis sel darah merah (Robinson, 1995). Uji saponin yang

sederhana ialah dengan mengocok ekstrak alkohol air dari tumbuhan dalam

tabung reaksi, maka akan terbentuk busa yang bertahan lama pada permukaan

berdasarkan kemampuannya menghemolisis sel darah dan memberikan reaksi

warna yang karakteristik pada uji Liebermann-Burchard (Farnsworth, 1966).

Berdasarkan bagian glikonnya dikenal dua jenis saponin, yaitu saponin

steroida dan saponin triterpenoida (Farnsworth, 1966).

O O

HO

CH₃

CH3

H₃C

CH₃

Gambar 2.38 Struktur sapogenin steroida

HO

COOH

Gambar 2.39 Struktur sapogenin triterpenoida

2.2.4 Triterpenoida/steroida

Triterpenoida adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari

enam satuan isopren dan secara biosintesis dibuat dari senyawa

Gambar 2.40 Struktur skualena

Steroida merupakan triterpen yang mempunyai inti siklopentano

perhidrofenantren (Harborne, 1987). Inti steroida dasar sama dengan inti

kolesterol, tetapi pada posisi 10 dan 13 terdapat gugus metal yang terikat pada

sistem cincin. Pada umumnya steroida tumbuhan berupa alkohol dengan gugus

hidroksil pada C3 sehingga steroida sering juga disebut sterol (Robinson,

1995).

2.2.5 Flavonoida

Flavonoida merupakan salah satu metabolit sekunder. Keberadaannya

dalam daun kemungkinan dipengaruhi oleh adanya proses fotosintesis sehingga

daun muda belum terlalu banyak mengandung flavonoida (Markham, 1988).

Senyawa flavonoida mempunyai struktur C6-C3-C6. Tiap bagian C6

merupakan cincin benzena yang dihubungkan oleh atom C3 yang merupakan

rantai alifatik (Sastrohamidjojo, 1996; Markham, 1988).

Flavonoida umumnya terdapat dalam tumbuhan terikat pada gula

sebagai glikosida. Flavonoida terdapat dalam bentuk bebas maupun terikat

sebagai glikosida. Glikosidanya larut dalam air dan etanol tapi tidak larut

dalam pelarut organik, sedangkan geninnya (aglikon) tidak larut dalam air

tetapi larut dalam pelarut-pelarut organik.

Klasifikasi flavonoida dalam tumbuhan berdasarkan sifat kelarutannya

dan reaksi-reaksi warnanya, kemudian dilanjutkan dengan kromatografi kertas

satu dimensi dari ekstrak terhidrolisis dan dua dimensi dari ekstrak alkohol

langsung. Kerangka dan skema pemberian nomor dan tipe-tipe flavonoiida

adalah sebagai berikut:

O

O

OH

Gambar 2.43 Struktur flavonoida golongan flavonol

O

O

Gambar 2.44 Struktur flavonoida golongan isoflavon

O

O

Gambar 2.45 Struktur flavonoida golongan flavonon

O

O

OH

O

O

CH

Gambar 2.47 Struktur flavonoida golongan auron

O

Gambar 2.48 Struktur flavonoida golongan khalkon

O

OH OH

OH

OH HO

Gambar 2.49 Struktur flavonoida golongan katekin

O

HO OH

OH

O+

OH

Gambar 2.51 Struktur flavonoida golongan antosianidin

2.2.6 Tanin

Tanin terdapat luas pada tumbuhan berpembuluh, dalam Angiospermae

terdapat khusus di jaringan kayu. Tanin dapat bereaksi dengan protein

membentuk kopolimer mantap yang tidak larut dalam air. Dalam industri, tanin

adalah senyawa yang berasal dari tumbuhan, yang mampu mengubah kulit

hewan yang mentah menjadi kulit siap pakai karena kemampuannya

menyambung silang protein (Harbone, 1987).

Secara kimia terdapat dua jenis utama tanin (Harborne, 1987) yaitu :

1. Tanin terkondensasi

Tanin terkondensasi terbentuk dengan cara kondensasi katekin tunggal

(galokatekin) yang membentuk senyawa dimer dan oligomer yang lebih

tinggi. Ikatan karbon-karbon menghubungkan satu satuan flavon dengan

satuan berikutnya melalui ikatan 4-8 atau 6-8. Kebanyakan flavolan

mempunyai 2-20 satuan flavon. Tanin terkondensasi disebut juga dengan

proantosianidin karena bila direaksikan dengan asam panas, beberapa ikatan

karbon-karbon penghubung satuan terputus dan dibebaskanlah monomer

antosianidin.

2. Tanin terhidrolisis

a. Depsida galoil glukosa

Pada senyawa ini, inti yang berupa glukosa dikelilingi oleh lima gugus

ester galoil atau lebih.

b. Dimer asam galat

Inti molekul berupa senyawa dimer asam galat, yaitu asam

heksahidroksidifenat yang berikatan dengan glukosa. Tanin terhidrolisis

disebut juga elagitanin yang pada hidrolisis menghasilkan asam galat.

2.3 Ekstraksi

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisah dari bahan yang tidak larut dengan pelarut cair. Senyawa

aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkann ke dalam

golongan minyak atsiri, alkaloida, flavonoida dan lain-lain. Dengan

diketahuinya senyawa aktif yang dikandung simplisia akan mempermudah

pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat (Depkes, 2000).

Metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut ada beberapa cara, yaitu

(Depkes, 2000):

1. Cara dingin

a. Maserasi

Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan

menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan

adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam dan diluar

sel maka larutan terpekat didesak keluar. Proses ini berulang sehingga

terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di dalam dan di luar sel.

Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung

zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Cairan penyari yang

digunakan dapat berupa air, etanol, metanol, etanol-air atau pelarut lainnya.

Maserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah

dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya. Keuntungan cara

penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang

digunakan sederhana dan mudah diusahakan.

b. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai

sempurna pada suhu kamar. Proses perkolasi terdiri tahapan pengembangan

bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya, terus menerus

sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahan.

2. Cara panas

a. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur yang

mencapai titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut yang

relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

b. Sokletasi

Sokletasi adalah ekstraksi dengan menggunakan pelarut yang selalu

ekstraksi berulang-ulang dan jumlah pelarut yang relatif konstan dengan

adanya pendingin balik.

c. Digesti

Digesti adalah maserasi dengan pengadukan yang berulang-ulang

pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan, yaitu secara

umum dilakukan pada temperatur 40-50°C.

d. Infundasi

Infundasi adalah ekstraksi dengan pelarut air, dilakukan pada suhu

96-98°C selama 15 - 20 menit.

e. Dekoktasi

Dekoktasi adalah infus pada waktu yang lebih lama dan temperatur

sampai titik didih air.

2.4 Kromatografi

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan berdasarkan proses

migrasi dari komponen-komponen senyawa diantara dua fase, yaitu fase diam

dan fase gerak. Fase gerak membawa zat terlarut melalui media sehingga

terpisah dari zat terlarut lainnya yang terelusi lebih awal atau lebih akhir.

Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh aliran suatu

pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut eluen. Fase diam dapat

bertindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan

Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari

fase diam, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fase diam berupa zat

padat disebut kromatografi serapan; jika berupa zat cair disebut kromatografi

partisi. Karena fase gerak dapat berupa zat cair atau gas maka terdapat empat

macam sistem kromatografi, yaitu:

1. Fase gerak cair-fase diam padat (kromatografi serapan):

− kromatografi lapis tipis

− kromatografi kolom

2. Fase gerak gas-fase diam padat:

− kromatografi gas padat

3. Fase gerak cair-fase diam cair (kromatografi partisi):

− kromatografi kertas

4. Fase gerak gas –fase diam cair:

− kromatografi gas-cair

Pemisahan dengan kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa

senyawa-senyawa yang dipisahkan terdistribusi diantara fase gerak dan fase

diam dalam perbandingan yang sangat berbeda-beda dari satu senyawa

terhadap senyawa yang lain (Sastrohamidjojo, 1991).

2.4.1 Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis tipis termasuk kromatografi adsorpsi (serapan),

dimana sebagai fase diam digunakan zat padat yang disebut adsorben

(penyerap) dan fase gerak adalah zat cair yang disebut dengan larutan

Kromatografi lapis tipis dapat dipakai untuk dua tujuan (Gritter, dkk.,

1991) yaitu:

1. Sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif (analitik) dan kuantitatif

(preparatif).

2. Untuk mencari sistem pelarut yang akan dipakai dalam kromatografi kolom.

Pada kromatografi lapis tipis, fase diam berupa lapisan tipis yang terdiri

atas bahan padat yang dilapiskan pada permukaan penyangga datar yang

terbuat dari kaca atau logam. Lapisan melekat pada permukaan dengan bantuan

bahan pengikat. Beberapa contoh fase diam yang digunakan untuk pemisahan

dalam kromatografi lapis tipis yaitu silika gel, alumina, kieselguhr dan selulosa

(Gritter, dkk., 1991).

Pada kromatografi lapis tipis lapisan fase diam harus sesedikit mungkin

mengandung air, karena air akan menempati semua titik penyerapan sehingga

tidak akan ada senyawa yang melekat. Oleh karena itu, sebelum digunakan plat

kromatografi lapis tipis perlu diaktifkan dengan pemanasan pada 1100C selama

30 menit (Gritter, dkk., 1991; Stahl, 1985)

Fase gerak terdiri dari satu atau beberapa pelarut dan bila diperlukan

dapat menggunakan sistem pelarut multi komponen, berupa suatu campuran

sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen. Pada

pemisahan senyawa organik selalu menggunakan pelarut campuran, tujuannya

untuk memperoleh polaritasnya yang tepat sehingga diperoleh pemisahan

masing-Rf = jarak titik pusat bercak dari titik awal

jarak garis depan fase gerak dari titik awal

masing pelarut sehingga dengan demikian akan diperoleh sistem pengembang

yang cocok (Stahl, 1985).

Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan

dengan harga Rf (Stahl, 1985).

Jarak yang ditempuh oleh tiap bercak dari titik penotolan diukur dari

pusat bercak. Harga Rf berada antara 0,00 – 1,00. Harga Rf ini sangat berguna

untuk mengindentifikasi suatu senyawa (Eaton, 1989).

Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf adalah sebagai berikut

(Sastrohamidjojo, 1991):

1. Struktur kimia senyawa yang dipisahkan

2. Sifat penyerap

3. Tebal dan kerataan lapisan penyerap

4. Pelarut dan derajat kemurniannya

5. Derajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana

6. Teknik percobaan

7. Jumlah cuplikan yang digunakan

8. Suhu

2.4.2 KLT Preparatif

Salah satu metode pemisahan senyawa bahan alam yang memakai

peralatan yang paling dasar ialah kromatografi lapis tipis preparatif. KLT

pemakaian hanya dalam jumlah milligram. Ukuran pelat yang biasa digunakan

yaitu 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm. Penjerap yang paling umum ialah silika gel

dan dipakai untuk pemisahan senyawa lipofil maupun campuran senyawa

hidrofil. Cuplikan sampel dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan

pada pelat KLTP dimana konsentrasinya sekitar 5-10%. Penotolan dapat

dilakukan dengan tangan (pipet) ataupun dengan penotol otomatis

(Hostettmann, 1995).

Pilihan pelarut ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan

memakai KLT analitik. Karena ukuran partikel penjerap kira-kira sama, pelarut

yang dipakai pada KLT analitik dapat dipakai langsung pada KLTP.

Kebanyakan penjerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yang

membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang

dipisahkan menyerap sinar UV. Untuk senyawa yang tidak menyerap sinar UV,

ada beberapa pilihan :

a. Menyemprot dengan air (misalnya saponin)

b. Menutup pelat dengan sepotong kaca kemudian menyemprot salah satu sisi

dengan pereaksi semprot

c. Menambahkan senyawa pembanding (Hostettmann, 1995).

2.5 Spektrofotometri Sinar Ultraviolet

Spektrofotometer UV pada umumnya digunakan untuk:

2. Menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang

maksimum suatu senyawa.

3. Mampu menganalisis senyawa organic secara kuantitatif dengan

menggunakan hokum Lambert-Beer (Dachriyanus, 2004).

Serapan molekul di dalam daerah ultraviolet bergantung pada struktur

elektronik dari molekul. Apabila suatu molekul menyerap radiasi ultraviolet, di

dalam molekul tersebut terjadi perpindahan tingkat energi elektron-elektron

ikatan pada orbital molekul paling luar dari tingkat energi yang lebih rendah ke

tingkat energi yang paling tinggi (Noerdin, 1985).

Spektrum ultraviolet dari suatu senyawa biasanya diperoleh dengan

melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu (cahaya monokromati)

melalui larutan encer senyawa tersebut. Sistem (gugus atom) yang

menyebabkan terjadinya absorpsi cahaya disebut kromofor. Kromofor yang

menyebabkan terjadinya transisi σ→σ* ialah senyawa yang mempunyai

elektron pada orbital molekul σ, yaitu molekul organik jenuh yang tidak

mempunyai atom dengan pasangan elektron sunyi. Senyawa yang mempunyai

transisi σ→σ* mengabsorpsi cahaya pada panjang gelombang sekitar 150 nm

(Creswell, et al., 1982).

Kromofor yang menyebabkan terjadinya transisi n→σ* ialah senyawa

yang hanya mempunyai orbital molekul n dan σ, yaitu molekul organik jenuh

yang mempunyai satu atau lebih atom dengan pasangan elektron sunyi.

Kromofor yang menyebabkan terjadinya transisi π→π* ialah senyawa yang

transisi n→σ* dan π→π* mengabsorpsi cahaya pada panjang gelombang

sekitar 20 nm (Creswell, et al., 1982).

Kromofor yang menyebabkan transisi n→π* ialah senyawa yang

mempunyai orbital molekul n maupun π yaitu senyawa yang mengandung atom

yang mempunyai pasangan elektron sunyi dan orbital π. Senyawa yang

mempunyai transisi n→π* mengabsorpsi cahaya yang panjang gelombang 200

-400 nm (Creswell, et al., 1982).

Istilah-istilah yang sering digunakan di dalam membicarakan spektra

elektronik yaitu:

Kromofor : Suatu gugus kovalen tidak jenuh yang bertanggung jawab untuk

serapan elektronik.

Auksokrom : Suatu gugus jenuh dengan elektron tidak terikat dimana bila

menempel kepada suatu kromofor dapat mengubah panjang gelombang dan

intensitas serapan.

Pergeseran batokromik : Pergeseran serapan ke panjang gelombang yang lebih

panjang karena sisipan atau pengaruh pelarut (geseran merah).

Pergeseran hipsokromik : Pergeseran serapan ke panjang gelombang yang

lebih pendek disebabkan substitusi atau pengaruh pelarut (geseran biru).

Efek hiperkromik : Kenaikan dalam intensitas serapan.

Efek hipokromik : Penurunan dalam intensitas serapan (Silverstein, 1986).

1. Menentukan gugus fungsi suatu senyawa organik

2. Mengetahui informasi struktur suatu senyawa organik dengan

membandingkan daerah sidik jarinya.

Pengukuran pada spektrum inframerah dilakukan pada daerah cahaya

inframerah tengah (mid-infrared) yaitu pada panjang gelombang 2,5-50 μm

atau bilangan gelombang 4000-200 cmˉ1. Energi yang dihasilkan oleh radiasi

ini akan menyebabkan vibrasi atau getaran pada molekul. Pita absorbsi

inframerah sangat khas dan spesifik untuk setiap tipe ikatan kimia atau gugus

fungsi. Metoda ini sangat berguna untuk mengidentifikasi senyawa organik dan

organometalik.

Jika suatu frekuensi tertentu dari radiasi inframerah dilewatkan pada

sampel suatu senyawa organik maka akan terjadi penyerapan frekuensi oleh

senyawa tersebut. Detektor yang ditempatkan pada sisi lain dar senyawa akan

mendeteksi frekuensi yang dilewatkan pada sampel yang tidak diserap oleh

senyawa. Banyaknya frekkuensi yang melewati senyawa (yang tidak diserap)

akan diukur sebagai persen transmitan (Dachriyanus, 2004).

Daerah inframerah terletak antara spektrum elektromagnetik cahaya

tampak dan spektrum radio, yakni antara 4000-400 cm-1. Penggunaan

spektrofotometri inframerah yang dimaksudkan untuk analisa lebih banyak

ditujukan untuk identifikasi suatu senyawa melalui gugus fungsinya. Spektrum

inframerah senyawa organik bersifat khas, artinya senyawa yang berbeda akan

Penafsiran spektrum inframerah dari suatu senyawa yang belum

diketahui haruslah ditujukan pada penentuan ada atau tidaknya beberapa gugus

fungsional utama seperti C=O, O-H, N-H, C-O, C=C, C≡C, C=N, C≡N, dan

NO2. Langkah-langkah yang umum dilakukan untuk memeriksa pita-pita yang

penting pada hasil spektrum inframerah (Pavia, et al., 1988):

1. Gugus karbonil

Gugus C=O memberikan puncak yang kuat pada daerah 1820-1660 cm-1.

2. Bila gugus C=O ada, periksalah gugus-gugus berikut (jika C=O tidak ada

langsung ke nomor 3).

Asam : periksalah gugus O-H, merupakan serapan melebar di

daerah 3300-2500 cm-1

Amida : periksalah gugus N-H, merupakan serapan medium

didaerah 3500 cm-1, kadang-kadang dengan puncak

rangkap.

Ester : periksalah gugus C-O, merupakan serapan medium

didaerah 1300-1000 cm-1.

Anhidrida : mempunyai dua serapan C=O di daerah 1810 dan 1760

cm-1.

Aldehida : periksalah gugus C-H, merupakan dua serapan lemah

didaerah 2850 dan 2750 cm-1 yaitu disebelah kanan

serapan C-H.

Alkohol atau fenol : periksalah gugus O-H, merupakan serapan melebar

di daerah 3600-3300 cm-1 yang diikuti adanya

serapan C-O di daerah 1300-1000 cm-1.

Amina : periksalah gugus N-H, yaitu serapan medium di

daerah 3500 cm-1.

Eter : periksalah gugus C-O (dan tidak adanya O-H), yaitu

serapan medium di daerah 1300-1000 cm-1.

4. Ikatan rangkap dua atau cincin aromatik

− Serapan lemah C=C di daerah 1650 cm-1.

− Serapan medium sampai kuat pada daerah 1650-1450 cm-1sering

menunjukkan adanya cincin aromatik.

− Buktikan kemungkinan di atas dengan memperhatikan serapan pada

daerah C-H aromatik di sebelah kiri 3000 cm-1, sedangkan C-H alifatis

terjadi di sebelah kanan daerah tersebut.

5. Ikatan rangkap tiga

− Serapan medium dan tajam dari C≡N di daerah 2250 cm-1.

− Serapan medium dan tajam dari C≡C di daerah 2150 cm-1.

6. Gugus nitro

− Dua serapan yang kuat di daerah 1600-1500 cm-1 dan 1390-1300 cm-1.

7. Hidrokarbon

− Apabila keenam serapan di atas tidak ada.

− Serapan yang sangat sederhana di daerah 1450 cm-1 (CH2) dan 1375