Hadiah Nobel dan Teknologi Genetika Mole

diterjemahkan bebas (tanpa ijin) oleh D. Lyrawati

untuk membantu peserta Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya

Walaupun DNA t elah dik enal sebagai salah sat u subst rat k im ia heredit as/ ket ur unan sej ak aw al 1940an, penelit ian m engenai st rukt ur dan fungsinya t idak m udah dilak uk an kar ena t idak ada alat / m et ode isolasi dan m anipulasi unt uk ek sper im en. Dit em ukanny a suat u ser i t erobosan t ek nologi pada aw al 1970an t elah m engubah secar a dram at is k em am puan kit a dalam m em pelaj ar i fungsi DNA dalam bidang biologi dan genet ik . Sej ak per t engahan 1970an, delapan hadiah Nobel t elah diber ikan pada penelit ian y ang langsung m aupun t idak langsung t elah m enghasilk an kem aj uan besar dalam m et odologi biologi m olek uler dan genet ik , selain j uga per anny a dalam m enam bah penget ahuan biologi dan kim ia. Sebagai cont oh adalah penem uan enzim reverse

t r ascript ase, enzim rest r ik si, v ekt or k loning plasm id,

sek uensing DNA, PCR dan lain- lain ( Tabel 1- 1) .

Met ode yang ada unt uk k eper luan penelit ian dalam biologi m olek uler dan genet ik t er us ber kem bang dengan cepat . Walaupun banyak t eknik biologi m olek uler y ang kom pleks, penget ahuan dasar m engenai beber apa pr osedur st andar akan cukup m em adai bagi par a um um nya pem baca buku ini. Sekar ang banyak sekali pr ot okol laborat or ium yang dapat dibeli sebagai ‘k it ’ y ang dij ual oleh perusahaan biot eknologi. Kit ini biasanya m encam t um k an inst r uk si prot okol yang cukup det il dan sek aligus k ont rol y ang sesuai. Walaupun reagen k it dem ik ian t er sedia dan r elat if m udah digunak an, penget ahuan biok im ia m engenai r eak si dan prot okol t et ap m erupakan hal yang pent ing agar sukses dapat t ercapai. Beberapa buku m anual biologi m olekuler yang sangat baik t elah dit er bit kan, bany ak diant aranya m enj elask an sat u prot okol sam pai berlem bar halam an ( lihat Pust ak a Anj uran) . Secara um um m et ode dapat dibagi m enj adi enam kelom pok:

1. Manipulasi DNA dan RNA secara k im ia dan enzim at is 2. Met ode unt uk m enghasilk an DNA dan RNA unt uk

berbagai aplik asi

3. Teknik analisis DNA dan RNA 4. Ekspr esi prot ein r ek om binan 5. Penent uan int erak si DNA- prot ein 6. I dent ifik asi int erak si prot ein- prot ein

Re st r ict ion e n don u cle a se ( enzim endonuk lease

rest riksi/ pem ot ong) . Enzim r est rik si ini, biasany a diperoleh dari bakt er i, dapat m engenal DNA unt ai ganda dengan ur ut an basa spesifik dan m em ot ong pada t em pat yang t er t ent u ( sequence- specific m anner) . Secara biologis, enzim ini ber fungsi unt uk m em bat asi m asuk ny a DNA asing dengan cara m em ot ong DNA pada sit us r est r iksi yang t idak t er dapat pada bak t er i hospes. Set iap enzim m engenal, m engikat dan m em ot ong urut an basa ( k ode) t ert ent u. Urut an basa ini biasanya t erdir i dar i 4- 8 pasang basa ( pb) , dan rest rict ion endonuclease hany a m em ot ong DNA yang m em punyai ur ut an basa yang benar - benar per sis dengan kode t er sebut . Sebagai cont oh, urut an basa yang dikenal oleh enzim EcoRI adalah GAATTC. Sem ua sit us yang m em iliki urut an basa

dem ik ian ak an dipot ong oleh enzim t er sebut ( Gam bar 1-1) , nam un sat u basa saj a yang berbeda, m isalny a CAATTC, dapat m encegah digest i DNA yang ber sangk ut an. Kem ungk inan/ probabilit as unt uk m endapat kan sit us rest r ik si yang spesifik pada sepot ong DNA t er gant ung pada j um lah basa dalam kode urut an/ pengenalan. Berdasarkan probabilit as bahw a 4 basa nuk leot ida ( GATC) akan m enghasilk an sit us r est r iksi t er t ent u, enzim pem ot ong 4- basa akan m em ot ong DNA genom ik m anusia set iap 2.5 x 102 _{pb, sedangk an enzim} pem ot ong 8- basa akan m em ot ong rat a- rat a set iap 1.0 x 106 _pb.

Pada dasarny a, enzim r est r iksi dapat m em ot ong DNA dengan salah sat u dari t iga cara ber ik ut : urut an basa yang dikenal dipot ong secar a asim et r is sehingga m enghasilk an uj ung 5’ at au 3’ t erbuka, at au secara sim et r is m eninggalkan uj ung y ang t um pul ( Gam bar 1- 1) . Enzim rest r ik si diberi nam a sesuai dengan bak t er i penghasil ( m isalnya EcoRI ber asal dar i Escherichia coli) . Rat usan j enis enzim endonuk lease sekarang dapat dibeli. Secar a prak t is penggunaan enzim r est rik si adalah dengan m engink ubasi enzim ber sam a- sam a dengan DNA dalam lar ut an bufer y ang sesuai, sehingga akan dihasilk an pot ongan- pot ongan DNA dengan uk uran t ert ent u. Kar ena pem ot onganny a bersifat spesifik unt uk urut an basa t ert ent u ( sequence- specific) , DNA yang ber beda ak an m enghasilk an pola digest i yang khas ( Gam bar 1- 2) . Pola y ang k has ini dapat dikenali set elah fr agm en DNA y ang ber beda- beda ukurannya dipisahkan secara elek t roforesis m enggunakan gel. Pet a rest r iksi dem ik ian m erupakan salah sat u hasil ut am a penggunaan enzim r est r iksi. Penggunaan ut am a kedua adalah unt uk “ cut and past e” DNA unt uk m enghasilkan ur ut an DNA bar u y ang dapat digunak an lebih lanj ut unt uk m anipulasi dengan ber bagai m et ode lain.

D N A liga se DNA ligase adalah enzim yang

m engik at kan ( ligasi) dua pot ong DNA secara k ovalen. Salah sat u enzim yang paling bany ak digunak an adalah T4 DNA ligase. Reaksi t erj adi ant ara gugus 3’OH dar i salah sat u unt ai DNA dengan gugus fosfat dar i unt ai DNA

par t ner. Reaksi ini m enggunakan ATP sebagai energi.

Ligasi DNA hanya dapat t erj adi secara efisien ant ar dua uj ung fragm en DNA y ang ber sesuaian ( kom pat ibel) . Kom pat ibilit as inilah yang digunakan penelit i sehingga dapat m engat ur ligasi beberapa fr agm en DNA yang berbeda sek aligus dalam sat u cam puran reak si. Cara ligasi ini t erut am a digunakan unt uk m eny isipkan sepot ong DNA k e dalam v ekt or k loning.

D N A poly m e r a se . DNA polim erase adalah enzim yang

Ta be l 1 - 1

H a dia h N obe l da n Te k n ologi Ge n e t ik a M ole k u le r

Tahun

Peneliti

Penemuan

Teknik yang dihasilkan

1975

D Baltimore

Interaksi antara virus tumor dan materi genetik

Reverse transcriptase

R

Dulbesso

HM

Temin

1978

W Arber

Enzim restriksi dan aplikasinya untuk genetika molekuler

Enzim restriksi

D Nathans

HO Smith

1980

P Berg

Biokimia asam nukleat

Plasmid

1980

W Gilbert

Penetuan urutan basa dalam asam nukleat

Sekuensing DNA

F Sanger

1984

NJ Jerne

Prinsip pembuatan antibodi monoklonal

Antibodi monoklonal

GJF

Kohler

C

Milstein

1989

JM Bishop

Asal muasal retrovirus secara seluler

Reverse transcriptase

HE Varmus

1993

R Roberts

Gen terbagi menjadi beberapa exon

Struktur gen

P

Sharp

1993

M Smith

PCR dan mutagenesis menggunakan oligonukleotida

PCR

KB Mullis

Site-directed mutagenesis

Ga m ba r 1 - 1 ( at as) Pem ot ongan dengan enzim rest r iksi. Tiga enzim y ang m em ot ong DNA dengan t iga car a yang berbeda. EcoRI , 5’ uj ung m uncul ( overhang) ;

Sm aI , uj ung t um pul ( blunt end) ; KpnI 3’ ov er hang.

Uj ung panah m enunj uk kan t em pat enzim m em ot ong pada ur ut an basa t er t ent u ( sit us rest r iksi) .

Ga m ba r 1 - 3 Reak si ligasi. T4 DNA ligase m engk at alisis penggabungan uj ung- uj ung kom plem en DNA m elalui pengik at an gugus 5’ fosfat dengan gusus 3’ OH k edua unt ai DNA. Reaksi ini m em eluk an ATP dan uj ung- uj ung DNA yang kom pat ibel.

DNA polim er ase m em punyai beber apa kegunaan, diant arany a adalah unt uk m em buat DNA yang dilabel radioak t if, r eaksi rant ai polim erase ( polym erase chain

r eact ion/ PCR) , dan sek uensing DNA.

Re v e r se t r a n scr ipt a se. Rev er se t rancript ase ( RT)

adalah enzim subt ipe DNA polim erase yang m enggunakan RNA sebagai cet ak an unt uk m enm buat DNA. Enzim ini j uga m em er lukan prim er dan m ensint esis dar i arah 5’  3’. RT diisolasi dari ret rov ir us y ang m em iliki k em am puan m enyalin balik genom RNAnya selam a sik lus hidupnya dalam sel m am alia. Penggunaan RT t erut am a unt uk m enyalin m RNA m enj adi DNA, yang disebut DNA kom plem en ( com plem ent ary DNA/ cDNA) . Reak si RT pada sepot ong cet akan RNA m enghasilk an m olekul hibrid RNA- DNA. DNA pada hibr id t ersebut disebut cDNA unt ai per t am a ( first - st rand cDNA) dan dapat digunakan unt uk m em buat salinan kom plem en DNA ber ik ut ny a sehingga m enghasilkan DNA unt ai ganda ( double- st randed

DNA/ dsDNA) . Dengan cara dem ik ian, cDNA digunakan

unt uk m em buat kum pulan ( libraries) gen yang diek spresi pada sat u j ar ingan ( lihat di baw ah) dan sebagai subst rat unt uk PCR unt uk analisis j enis RNA.

Pe la be la n de n ga n r a dioa k t if ( r a diola be lin g) . DNA

radioak t if adalah r eagen y ang pent ing dalam biologi m olekuler , k ar ena dapat ber t indak sebagai pr obe unt uk hibr idisasi. Ada dua car a dasar unt uk m engink or poraskan r adioak t if ke dalam DNA: int ernal labeling dan

end-labeling. Pada int er nal labeling, DNA didenat urasi

m enj adi unt ai t unggal dengan pem anasan ( m endidih) , DNA polim erase digunak an unt uk m eny alin unt ai t ersebut ber sam a- sam a dengan nuk leot ida yang dilabel radioak t if ( biasanya 32_{P- dCTP) . Unt ai hasil sint esis akan sangat} radioak t if. Sedangkan unt uk end- labeling digunakan

polinucleot ide kinase. Enzim ini m ent ransfer radiak t if dari

sat u m olekul ATP k e uj ung 5’ sat u DNA unt ai t unggal. Hany a basa y ang t er let ak pada paling uj ung 5’ yang dilabel, t idak ada radioak t if yang diink orporasikan di t engah m olek ul DNA. Beber apa m et ode nonradioak t if j uga dapat digunak an unt uk m elabel DNA. Ant ara lain, dengan pelabelan dengan biot inil yang kem udian dapat didet ek si m enggunakan sit em av idin, dan pelabelan dengan digok sigenin y ang dapat didet eksi dengan uj i enzim ( enzym e- linked assay) .

Ga m ba r 1 - 4 Sint esis DNA oleh DNA poly m erase. DNA polim er ase m enem pelkan nuk leot ida bebas ke pr im er y ang ada dar i uj ung 5’ 3’. Garis put us- put us m enunj uk kan basa kom plem en.

Agar dapat digunakan unt uk m anipulasi, diagnosis, dan t erapeut ik, DNA dan RNA harus diisolasi dalam bent uk dan j um lah y ang sesuai. Met ode t erbaik unt uk isolasi DNA dan RNA dan per bany akannya t ergant ung pada t uj uan penggunaan. Walaupun ham pir sem ua t eknik m elibat kan bany ak kerj a dan m em but uhk an sej um lah besar m at er i aw al, penggunaan k it dar i ber bagai per usahaan biot ek nologi cuk up m eny eder hanak an isolasi DNA dan RNA. I solasi baik secara k lasik m aupun dengan k it m enggunakan pr insip dasar yang sam a sebagai ber ik ut .

I sola si D N A ge n om t ot a l. DNA genom ber upa unt ai

ganda dan dapat diisolasi dar i sel j enis apapun, t er m asuk bakt er i, ragi, t anam an dan binat ang. Hasil isolasi DNA y ang diingink an adalah DNA seut uh m ungk in, t idak rusak dan m em ilik i berat m olekul t inggi. Say angny a proses pur ifikasi DNA sendir i cender ung m em ut us rant ai DNA sehingga m enur unkan berat m olekulnya, nam un t indakan y ang hat i- hat i dapat m engurangi hal ini. Prot ok ol isolasi DNA berv ariasi, t api sebagai langkah aw al sem ua m elibat kan proses lisis sel dan nuk leus ( j ika sel m em ilik i int i) . Suspensi sel- y ang- m engandung- DNA diink ubasi dengan det erj en dan at au enzim yang berfungsi unt uk m elisis sel/ int i. Langkah berikut ny a biasanya adalah m endisosiasi DNA dar i pr ot ein ( m isalnya hist on) m enggunak an enzim yang dapat m endegr adasi prot ein ( prot einase K) . Langkah ini sekaligus j uga unt uk m enginakt iv asi enzim seluler y ang dapat m endegradasi DNA ( nuk lease) . Prot ein yang t erdegradasi sebagian, dihilangk an dari larut an dengan cara ek st rak si fenol/ k lorofor m , presipit asi dengan garam , at au dengan m e lew at kan lar ut an m elalui k olom yang akan m enahan DNA. DNA dipresipit asi dengan et anol. Dengan cara ini biasanya DNA dengan BM t inggi ( m isalny a DNA genom m anusia) ak an m em bent uk t hreads ( rant ai) dan dapat dit ar ik dar i larut an m enggunakan bat ang gelas. DNA k em udian diker ingkan dan dilar ut k an k em bali dalam air dengan buffer t er t ent u ( Tr is- HCl at au Tris- EDTA) dan akan st abil selam a beber apa t ahun.

I sola si RN A se lu le r t ot a l. Beberapa j enis RNA dapat dit em ukan dalam sel, t er m asuk m essenger RNA ( m RNA) ,

r ibosom al RNA ( rRNA) , t ransfer RNA ( t RNA) dan lain- lain.

Kebanyakan st udi ( Nort hern blot , RT- PCR) cuk up

digunak an unt uk langk ah ber ik ut ny a yait u pem isahan RNA dar i DNA genom . Pada t ahap ak hir prosedur, seper t i j uga pada isolasi DNA, RNA y ang dipurifikasi dipr esipit asi dengan et anol. Larut an RNA dalam air harus disim pan dalam keadaan beku.

I sola si m RN A. Unt uk beberapa aplikasi, t ot al RNA seluler t idak cuk up baik digunakan. Dar i t ot al RNA sebagian besar ber upa r RNA, sedangk an m RNA hanya 1-3% . Unt uk m em buat library gen yang diekspr esi at au unt uk m endet ek i m RNA y ang sangat j arang/ sedik it j um lahnya pada Nort hern blot , m engisolasi m RNA

m erupakan langkah aw al t er pent ing. Ham pir sem ua m RNA m engandung adenilat ( poly - adenilat ed/ poly A RNA) , sehingga sifat ini dapat digunakan unt uk m enangkap dan m engisolasi m RNA. Tot al RNA seluler dilew at kan m elalui kolom at au resin poly deoxy t hym ine ( kolom oligodT, poly-dT) y ang t er ik at pada fase padat . RNA y ang t idak t er ikat ak an hilang t er cuci, sedangk an poly ( A) RNA dapat dielusi pada t ahap ber ik ut nya.

Pada m et ode isolasi DNA di at as, genom sel adalah sum ber DNA, oleh karena it u sem ua sek uens DNA yang diper oleh akan sam a j um lahnya seper t i yang t er dapat dalam sel. Ter gant ung pada uk ur an genom organism e, suat u gen t unggal t er t ent u hanya m er upakan bagian yang sangat kecil dar i DNA t ot al dalam sel. Sebagai cont oh, r at a- r at a sat u gen t unggal dalam m anusia ( ~ 100.000 pb) hany a m er upakan 0.003% dar i genom t ot al. Jadi, gen t unggal t er lalu k ecil unt uk dapat digunakan dalam st udi yang m endet il ( m isalny a sek uensing DNA) .

Problem ini dapat dipecahk an dengan k loning DNA, yang m em ungk inkan unt uk m em buat sat u DNA t ert ent u dalam j um lah besar dan m ur ni. Sem ua m et ode k loning DNA m elibat k an ligasi suat u urut an/ sek uens t ert ent u ( m isalnya gen m anusia) ke dalam vekt or k loning. Vek t or kloning adalah urut an DNA yang t erdapat di dalam sat u sel ( dalam hal ini biasanya bakt er i E. coli) t api bukan m erupakan bagian dar i genom sel. Pem bawa k loning ( dan DNA yang dik lon di dalam nya) akan diperbany ak dalam sel hospes, m enghasilk an sej um lah besar DNA dengan urut an spesifik yang kem udian dapat diisolasi unt uk st udi selanj ut nya.

Pla sm id E. coli. Kloning k e dalam plasm id E. coli m asih m er upak an m et ode t er pent ing unt uk m em buat DNA dalam j um lah besar dan m ur ni. Plasm id adalah DNA unt ai ganda sirk uler y ang k ecil ( 2000- 5000 pb) y ang dapat m em per bany ak dir i ( replik asi) di dalam sel bak t er i ( Gam bar 1- 5) . Plasm id m em ilik i origin of replicat ion sendir i dan m am pu m em per bany ak dir i ( propagasi) dengan bant uan m esin- m esin seluler endogen. Plasm id kloning m engandung m ar ka selek si ( select able m arker) , biasany a ber upa gen yang m em bawa r esist ensi t er hadap ant ibiot ika. E. coli y ang m engandung plasm id y ang-dapat - diselek si- dengan- ant ibiot ika ini akan m am pu t um buh dalam m edia y ang m engandung ant im ik roba t ert ent u. Bany ak plasm id yang m em ilik i gen - lact am ase, dapat t um buh dalam am pisilin. Plasm id dapat dibedakan bedasar kan j um lah- salinan ( copy num ber ) : t inggi dan r endah. DNA plasm id m ur ni dapat dipisahkan dar i DNA genom E. coli, k ar ena plasm id DNA j auh lebih k ecil ukuranny a dibanding DNA genom E. coli ( genom E. coli ~ 1x106 _{pb) . Sel E. coli yang m engandung plam id} dit um buhk an dalam sej um lah besar m edia cair yang m engandung ant ibiot ik a t er t ent u. Sel kem udian dibuat pelet dengan car a sent r ifugasi dan lisis m enggunakan alkali at au det erj en. Sem ua m et ode pem buat an plasm id m enggunakan dasar selek si ukuran unt uk m em isahkan ant ara DNA plasm id sir kuler yang k ecil dengan DNA genom yang ber at m olekulnya ( BM) t inggi dan RNA.

Beberapa m g DNA plasm id m ur ni dapat diperoleh dar i 1 L k ult ur sel E. coli yang m engandung plasm id dengan j um lah salinan t inggi.

Plasm id E. coli m oder n t elah dir ekayasa sehingga m em ilik i beberapa sit us rest r ik si ( polylinker sit es) . Ber ik ut adalah prosedur unt uk k loning sat u gen t er t ent u ( Gam bar 1- 5) : DNA plasm id aw al dipot ong dengan enzim rest r iksi, sehingga DNA sir kuler t erbuka dan m enj adi linier . DNA unt ai ganda linier lain, yang diinginkan, dibuat sehingga uj ung- uj ungny a sesuai unt uk diligasikan k e dalam celah sehingga plasm id sirk uler t erbent uk k em bali. Plasm id yang t elah diligasi ini dim asukkan m elalui proses t ransform asi ke dalam E. coli. yang sensit if t er hadap ant ibiot ik m ar ka yang t erk andung dalam plasm id. Tr ansform asi bak t eri dapat t er capai dengan m em anaskan cam puran DNA dan bakt er i pada 42C selam a 1 m enit ( heat shock ) at au dengan m em ber ikan aliran list rik ( elect roporat ion) , sehingga DNA plasm id dapat m elalui dinding bak t er i m asuk ke dalam sel bak t er i. Set elah t ransfor m asi, bak t er i dit um buhkan pada pelat agar yang m engandung ant ibiot ik . Pada kondisi ini hanya sel y ang m em ilik i plasm id sir kuler y ang dapat t um buh dan m em bent uk koloni. Tiap k oloni bak t er i ini disebut k lon, kar ena set iap sel dalam k oloni ident ik secara genet ik . Tiap k lon dapat diper banyak dalam m edia cair unt uk m em buat DNA plasm id dalam j m lah besar. Karena sel bakt er i t idak m at i dan dapat t er us m ener us m em belah t anpa bat as, k lon yang m engandung plasm id ini m erupakan sum ber DNA yang perm anen. Sel dapat disim pan beku selam anya, dan k lon dapat diposkan dan dipakai bersam a dengan laborat orium yang lain.

Plasm id m oder n dengan j um lah salinan t inggi ber uk uran ~ 3 kb dapat m ener im a DNA sisipan sam pai 15 k b. Nam un, kebanyakan DNA yang dik lon ke dalam plasm id beruk uran < 10 k b, uk uran y ang lebih besar biasanya t idak st abil. Sehingga hanya DNA dengan uk uran relat if kecil yang dapat dik lon k e dalam vekt or plasm id. Oleh k arena it u, dikem bangk an v ek t or k loning y ang dapat m em baw a DNA dengan ukuran bear, ant ara lain v ek t or kloning faga ( phage) , kosm id, bact er ial

art ificial chrom osom es ( BAC) dan y east ar t ificial chr om osom es ( YAC) .

Libr a r y . Vek t or k loning di at as dapat digunakan unt uk m em perbanyak DNA t er t ent u dalam j um lah besar dan m urni. Tet api bagaim ana gen DNA t ersebut dapat dit em ukan pert am a kali? Proses isolasi suat u gen t ert ent u dar i cam puran DNA y ang k om pleks dapat dij elaskan secar a singkat sebagai ber ik ut .

Kebanyak an st rat egi isolasi gen secara t radit ional m elibat kan pem buat an library DNA at au RNA. Mat er i awal library adalah cam puran DNA k om pleks yang dik et ahui m engandung ur ut an DNA yang diinginkan. Sebagai cont oh, m at er i awal unt uk m engisolasi gen m anusia t ent unya adalah DNA genom y ang diisolasi dar i sel m anusia. DNA ini k em udian dipot ong- pot ong m enj adi beber apa fragm en dengan uk uran t er t ent u secara m ekanis at au didigest i m enggunak an enzim r est r iksi endonuk lease. Ukuran fragm en t ergant ung pada vekt or k loning y ang digunak an. Unt uk library phage, uk uran fragm en r at a- rat a ~ 8- 25 kb. Cam pur an fr agm en DNA ini diligasikan k e dalam vek t or k loning dan r eak si ligasi digunakan unt uk m ent r ansfor m asi bak t er i E. coli. Sifat biologi vekt or k loning m enj am in bahw a set iap indiv idu bakt er i hanya m engandung sat u sisipan ( insert ) . Dengan dem ik ian, prosedur ini m em bagi cam puran awal DNA y ang kom plek s m enj adi j ut aan k lon t unggal, t iap k lon hanya m engandung sat u j enis DNA, sat u library. Library dapat dibuat dari berm acam - m acam sum ber DNA unt ai ganda.

Ga m ba r 1 - 5 Subk loning pada bak t er i. Vekt or k loning pUC19 digunakan unt uk m em per bany ak cDNA. Plasm id m em ilik i origin of replicat ion bakt er i ( ORI ) , gen resist en unt uk seleksi dalam m edia ant ibiot ik ( Am p) , dan gen yang dapat digunakan unt uk m endet eksi peny isipan cDNA ( lacZ) . Set elah plasm id dibuka dan cDNA disisipkan dengan bant uan enzim rest r ik si dan ligasi, k onst ruk si DNA ini dim asukk an ke dalam bakt er i E. coli dengan car a syok panas ( heat shock) at au elek t ropor asi. Set elah t r ansform asi, bakt eri dit anam pada m edia yang m engandung ant ibiot ik , hany a bak t eri y ang t elah m em ilik i plasm id yang m engandung gen r esist ensi ant ibit ika yang dapat t um buh. Bakt er i dit um buhkan dalam m edia yang j uga m engandung X- gal, subst rat unt uk  galakt osidase, klon yang m engandung sisipan ( insert ) pada gen lacZ ( inser t akan m er usak reading fram e) , t idak ak an sanggup lagi m em et abolism e X- gal dan ak an nam pak sebagai koloni put ih pada pelat agar. Sedangk an k oloni yang t er ligasi dan m em ilik i gen lacZ yang fungsional akan m em et abolism e X- gal sehingga akan nam pak sebagai koloni ber warna biru.

Unt uk m engident ifikasi bagian yang m eny andi prot ein pada suat u gen, diper lukan libr ar y dar i sekuens DNA yang t erek spresi. Library ini dikenal sebagai cDNA library dan sebagai m at er i awal digunak an m RNA ( Gam bar 1- 6) . Unt uk m engisolasi gen yang m enyandi enzim m et abolism e di hat i, m ak a digunak an m RNA yang dipur ifikasi dari hom ogenat hat i. Mat er i ini akan m engandung sem ua m RNA y ang ada dalam hat i. Beber apa m RNA berj um lah sangat banyak , j ik a m RNA ini m enyandi prot ein yang j um lahnya bany ak dalam hat i, sedangkan beberapa t ransk r ip lain ber j um lah sedik it . RT kem udian digunakan unt uk m enyalin cam pur an m RNA ini m enj adi fir st - st rand cDNA. cDNA ini kem udian dikonv er si m enj adi dsDNA dan diligasikan ke dalam vek t or k loning m enghasilkan cDNA library . Pat ut diingat bahwa cDNA

library ber sifat khas unt uk t iap j ar ingan ( t issue- specific) ,

karena set iap j ar ingan m engekspr esikan sekelom pok gen

y ang berbeda. cDNA library j uga ber sifat spesifik unt uk t iap t ahap per k em bangan or ganism e.

Ga m ba r 1 - 6 Pem buat an cDNA library . m RNA diisolasi dan dit erj em ahkan balik dengan RT. Unt ai RNA didigest i habis, DNA unt ai t unggal ( single st r andedDNA/ ssDNA) y ang t ersisa kem udian dit am bah pr im er oligodT dan DNA polim er ase. Pr im er akan m enem pel pada uj ung/ ek or poli( A) cDNA dan k em udian diperpanj ang ( ekst ensi) oleh DNA polim erase. cDNA unt ai ganda diligasik an ke lengan  phage yang selanj ut nya diinfeksikan k e bakt er i. Filt er

lift dilakukan pada bakt er i y ang t elah dilisis k em udian

dihibr idisasi m enggunakan probe y ang sesuai. Set elah aut oradiografi, plak y ang sesuai diisolasi, phage dipur ifikasi dan dikarak t er isasi.

Jika library sudah diper oleh, t ahap ber ikut nya adalah bagaim ana m enem ukan sat u k lon spesifik y ang m engandung gen t er t ent u di ant ara j ut aan k lon. Hal ini dapat t er capai dengan car a m enapis ( screening) library . Bakt eri y ang m engandung library ini disebar pada pelat -agar dengan densit as yang cukup rendah sehingga m em ungk inkan unt uk m engam bil sat u klon t unggal. Sebagai cont oh, suat u phage library yang dibuat dar i DNA genom m anusia, dit anam dengan ker apat an 50.000 plak per pelat . Pada densit as ini, 20 pelat ber ar t i m engandung 1.000.000 k lon. Sebagian dar i k oloni/ plak pada pelat dit ransfer , sebagai salinan persis, k e filt er nit roselulosa at au nilon m enggunak an prosedur” filt er lift ” ( diangk at dengan filt er) . Filt er ini k em udian dipr oses suapaya m engikat secara kov alen DNA at au prot ein yang diekspresikan oleh plak/ koloni yang dit ransfer . Filt er k em udian diinkubasi dengan probe DNA y ang dilabel radioakt if at au ant ibodi spesifik, yang akan m enem pel pada filt er pada posisi k lon y ang m engandung DNA at au pr ot ein yang dicar i. Klon yang sesuai t er sebut kem udian diam bil dar i pelat agar aslinya ber dasarkan posisi pada filt er yang t elah dit andai. DNA dalam klon kem udian dapat diam plifik asi ( diperbanyak) dan diisolasi seper t i y ang t elah dit er angk an sebelum nya, yait u dengan cara subk loning ke dalam vek t or plasm id.

Selain dengan car a per bany akan m enggunak an vekt or k loning dalam sel hidup, DNA unt ai ganda dapat diperoleh dalam j um lah besar dan m ur ni secar a k im ia dengan cara poly m er ase chain react ion ( PCR) . Sej um lah kecil DNA unt ai t unggal dapat disint esis dari nuk leot ida t unggal dengan bant uan oligonuk leot ida.

Oligon u k le ot ida. Salah sat u aw al k em aj uan yang

digunak an adalah k em am puan unt uk m ensint esis secar a kim ia sepot ong kecil DNA dengan urut an basa t ert ent u ( oligonuk leot ida) . Proses ini dim ulai dengan m enem pelk an basa 5’ yang paling uj ung dar i suat u ur ut an DNA k e polim er padat penduk ung. Set iap basa bar u sesuai dengan urut an y ang diingink an dit am bahkan pada gugus 3’ OH basa y ang t elah dit em pelkan pada polim er penduk ung, sat u dem i sat u sam pai seluruh ur ut an DNA t ersint esis. Pada t iap sik lus sint esis hanya sat u basa yang dit am bahkan, yang sekaligus m erupakan langk ah unt uk m engont rol ur ut an basa oligonuk leot ida. Oligonuk leot ida konv ensional m engandung sat u dar i em pat basa DNA pada sat u posisi. Nam un, bisa saj a pr osedur diat ur agar dapat digunakan nuk leot ida yang lain ( m isalny a inosin) , nuk leot ida y ang dim odifik asi ( dit andai dengan fluor escent at au digok sigenin) , at au lebih dar i sat u m acam basa pada sat u posisi ( degener at e

oligonukleot ides) .

Poly m e r a se ch a in r e a ct ion ( PCR) . Dar i suat u cam puran DNA yang k om pleks, PCR m em ungk inkan penelit i unt uk m em buat sej um lah besar DNA dengan ur ut an basa t ert ent u dalam wak t u yang singkat dan t anpa kloning. Prosedur ini m enggunakan DNA polim erase yang t ahan panas ( t herm ost able) dan dua prim er oligonuk leot ida sint et ik ( Gam bar 1- 7) . Urut an DNA gen yang akan diam plifikasi ( diperbanyak ) har us diket ahui sebagian, agar pr im er yang m em bat asi uj ung DNA t arget dapat disint esis. Prosedur PCR dapat t erdir i dar i 3 t ahap: ( 1) denat urasi DNA unt ai ganda, ( 2) m enem pelkan prim er ke DNA ( annealing) , dan ( 3) m em perpanj ang prim er ( ex t ension) . Selam a denat urasi, pem anasan ( 94- 98C) digunak an unt uk m em isahk an kedua unt ai DNA t ar get m enj adi unt ai t unggal. Unt ai t unggal ini k em udian siap dihibridisasikan dengan oligonuk leot ida y ang sesuai pada proses annealing j ik a t em perat ur dit urunk an sam pai di baw ah t it ik leleh hibrid oligonuk leot ida- DNA ( biasany a sek it ar 50- 68C) . Set elah prim er m enem pel, DNA polim erase ( Taq polim erase dar i bak t er i Therm ophilus

aquat icus) dapat m enyalin ur ut an DNA unt ai t unggal pada

72C, j ik a t ersedia deok sinuk leot ida t r ifosfat ( dNTP) . Set iap unt ai DNA t arget yang t elah ada sej ak aw al akan disalin dan j um lah DNA ak an m enj adi dua kali lipat pada ak hir t iap sik lus. Jadi, set elah 25- 30 sik lus, urut an DNA yang diingink an dapat diperbanyak sam pai j ut aan kali lipat . DNA sej um lah ini m em ungk inkan unt uk dilihat ( v isualisasi) langsung sebagai pit a ( band) pada gel agarose, dan lebih dar i cukup unt uk m elak ukan k loning at au sek uensing DNA. Per ubahan t em perat ur bert ur ut -t ur u-t yang diper luk an un-t uk m elak ukan PCR ini dilak ukan pada m esin t herm ocycler. Sat u PCR biasanya selesai dalam wakt u 1- 3 j am , dan oleh k ar ena it u m erupakan m et ode t er cepat unt uk m em buat DNA t er t ent u unt uk st udi lebih lanj ut . Ket er bat asan PCR ant ar a lain adalah m isinkorporasi ( salah m enam bahk an) nuk leot ida oleh enzim Taq polim er ase ( Taq er ror) dan ket idakm am puan unt uk m engam plifikasi fr agm en DNA y ang besar ( Taq generasi bar u m am pu m engam plifikasi ~ 20 k b) . Modifikasi Taq dengan t ingkat fidelit as t inggi akan m engurangi kesalahan PCR dan m eningk at kan kem am puan am plifikasi.

Aplikasi PCR berm acam - m acam , ant ara lain: ( 1) unt uk m engam plifikasi DNA pada daer ah t er t ent u sebagai st rat egi r ekay asa genet ik y ang t idak t er gant ung pada enzim rest r ik si, ( 2) m em perbany ak DNA genom unt uk keper luan diagnost ik, ( 3) m em per banyak DNA unt uk sek uensing, ( 4) unt uk m em ny isipkan/ m em buat m ut asi ( sit e dir ect ed m ut agenesis) , ( 5) dik om binasi dengan RT, unt uk m engk uant ifikasi j um lah m RNA aw al ( RT- PCR) .

Ga m ba r 1 - 7 Reak si PCR. Cet ak an DNA, pr im er A dan B, dan DNA polim er ase ( Taq) dik om binasi dalam r eak si sik lus berulang m engikut i t em perat ur denat

urasi-annealing- ekst ensi, y ang m engam plifik asi DNA pada

daer ah yang dibat asi oleh pasangan pr im er A dan B.

Sit e - dir e ct e d m u t a ge n e sis. PCR t elah sangat

m em udahkan sit e- direct ed m ut agenesis ( walaupun ada j uga pr osedur lain unt uk m em buat m ut asi/ m ut agenesis) .

Sit e- direct ed m ut at ions ( m ut asi y ang dibuat pada t em pat

y ang dit ent ukan) m em puny ai banyak aplikasi, t er m asuk unt uk st udi st ruk t ur- fungsi resept or , t r anscr ipt ion fact ors, enzim , dan fakt or t ransk r ipsi lainnya. Sit e- direct ed

m ut at ions j uga dapat dilakuk an t er hadap elem en r egulasi

suat u gen unt uk m engubah t em pat pengikat an

t r anscript ion fact or dan m enguj i pengaruhnya t er hadap

fungsi prom ot or. Sit e- direct ed m ut at ions j uga m em bant u r ek ayasa genet ik karena m em ungk inkan unt uk m encipt akan sit us rest r iksi baru.

m engandung m ut asi) digunak an unt uk m em ulai PCR kedua ber sam a- sam a dengan pr im er oligonuk leot ida yang bar u. Set elah beber apa sik lus PCR akan diper oleh cet ak an m ut an yang panj ang y ang dapat diper bany ak dengan PCR t r adisinal. Beber apa var iasi st r at egi ini dibicar akan pada pust aka yang t er cant um .

Ga m ba r 1 - 8 Sit e- direct ed m ut agenesis. Prim er m ut an ( t anda bint ang) dan pr im er 3’ norm al digunak an unt uk m engam plifikasi cDNA. Hasil reak si digunakan unt uk m engam plifikasi cet akan ber sam - sam a dengan prim er 5’ nor m al. Reak si ini ak an m enghasilkan cDNA t er m ut asi yang dapat diam plifikasi dengan prim er nor m al.

Pe m isa h a n m e n ggu n a k a n ge l ( ge l se pa r a t ion ) .

Pem isahan DNA dan RNA berdasark an ukuran dengan elek t rofor esis pada ber bagai sist em gel m er upakan t ek nik dasar yang pent ing dalam biologi m olekuler . Pada pH net ral, DNA dan RNA ber m uat an negat if dan akan ber m igr asi ke ar ah anoda. Jik a m igrasi dilakuk an pada m at r iks polim er ( gel) , fragm en kecil akan ber ger ak lebih cepat dar ipada fr agm en y ang besar ( Gam bar 1- 2) . Dengan dem ik ian, m igrasi elekt roforet ik m elalui gel akan m em isahkan cam pur an fragm en DNA sehingga nam pak sebagai pit a- pit a yang berbeda ukuranny a. Bany ak m at r iks gel y ang dapat dignakan unt uk pem isakhan asam nuk leat , t api yang paling bany ak digunak an adalah gel agarose dan poliak r ilam id. Gel agarose sesuai unt uk pem isahan fr agm en DNA y ang beruk uran 0.1- 20 kb, sedangkan poliakr ilam id unt uk fr agm en Dna ber ukur an 0.025- 2 k b. Denat uran sepert i ur ea dapat dit am bahkan pada gel poliakr ilam id unt uk dapat m em isahkan fragm en DNA sam pai pada t ingk at resolusi 1 pb ( m isalnya unt uk sek uensing DNA) . Salah sat u j enis elekt roforesis el agarose adalah pulsed field gel elect rophoresis ( PFGE) yang digunakan unt uk m em isahk an fragm en DNA yang sangat besar ( lebih dar i 1000 kb) . Unt uk m elihat fr agm en DNA set elah dipisahk an dengan elekt r oforesis gel digunak an t ek nik lain. Jik a fragm en DNA cuk up bany ak,

gel dapat langsung diw ar nai ( st aining) selam a at au set elah elek t roforesis sehingga DNA dapat langsung dilihat . Et hidium br om ide m engikat DNA dan akan berfluoresensi/ berpendar m erah dibaw ah sinar UV. Jika j um lah DNA t er lalu sedik it unt uk div isualisasi langsung, r adioakt if digunak an unt uk m endet ek si ( lihat hibridisasi) .

H ibr idisa si a sa m n u k le a t. Hibr idisasi asam nuk leat

adalah salah sat u m et ode analisis y ang paling ser ing digunakan. Teknik ini digunakan unt uk Sout her n blot t ing,

Nort hern blot t ing dan unt uk skr ining library. Tuj uan

m et ode ini adalah unt uk m elihat ( v isulisasi) sek uens asam nuk leat t ert ent u ( DNA at au RNA) dalam lingkungan/ lat ar belak ang cam pur an sekuens lain yang k om plek s. Teknik ini m em anfaat kan sifat DNA yait u dua unt ai asam nuk leat yang k om plem en akan salaing m engikat ( hibridisasi) dengan t ingk at spesifisit as yang t inggi. Sebalik nya, sekuens asam nuk leat yang nonkom plem en t idak ber ik at an secar a spesifik , m ism at ch nuk leot ida m enur unkan t em perat ur/ t it ik leleh. Unt uk m endet ek si DNA at au RNA t er t ent u dalam suat u cam puran y ang k om plek s, isi cam puran har us diim obilisasi pada m em br an dan diubah m enj adi bent uk unt ai t unggal ( lihat Sout her n dan Nor t hern blot t ing) . Lar ut an hibridisasi yang m engandung probe unt ai t unggal y ang dilabel r adioakt if dit am bahkan agar t erj adi hibr idisasi pada kondisi t ert ent u. Tem perat ur dan k onsent r asi gar am pada lar ut an hibridisasi m enent ukan k espesifikan pengikat an. Pada t em perat ur t inggi dan k onsent r asi gar am r endah, probe hanya akan m engik at sekuens t arget yang benar- benar cocok. Set elah hibr idisasi, kelebihan probe y ang t idak t erikat dicuci, sinyal radioak t if ak an t erdet eksi pada lokasi di m ana sekuens t arget t erlet ak. Siny al radioak t if div isualisasi dengan m engeksposk an pada fim X- r ay m enghasilkan t it ik at au pit a hit am pada t em pat radioakt if.

Sou t h e r n blot t in g. Ket ika DNA genom didigest i dengan endonuk lease rest r ik si dan dipisahk an dengan elek t rofor esis gel, fragm en indiv idual t idak akan dapat dilihat , bahkan j ik a digunak an DNA dalam j um lah besar . Kar ena kom pleksny a DNA genom , digest i dengan enzim rest r iksi y ang div isualisasi dengan et hidium brom ide akan m enghasilkan pola ‘sm ear’ yang t ercipt a dar i r ibuan fragm en DNA. Unt uk m endet ek si fragm en t ert ent u pada ‘sm ear ’ t ersebut digunak an t ek nik hibr idisasi dengan pr obe r adioak t if yang lazim dikenal sebagai Sout her n

blot t ing ( diam bil dar i nam a penem unya Ed Sout hern)

( Gam bar 1- 9) . Sout hern blot t ing dim ulai dengan pem isahan elekt r oforesis gel fragm en DNA y ang t elah didigest i dengan enzim pem ot ong. DNA kem udian didenat urasi ( dipisahkan m enj adi 2 unt ai t unggal) dengan per lak uan alkali, selanj ut ny a unt ai t unggal dit r ansfer ke m em bran m elalui t r ansfer kapilarit as. DNA akan t erik at pada secar a kovalen pada m em bran dan diim obilisasi pada fase padat , m enghasilk an r eplika fragm en pada gel. Fagm en DNA spesifik pada m em br an dapat diident ifik asi dengan hibridisasi m enggunakan probe yang spesifik unt uk fr agm en gen y ang dik ehendak i.

N or t h e r n blot t in g. Pem isahan gel dan hibr idisasi asam nuk leat dapat j uga unt uk analisis RNA m enggunak an pr osedur Nort hern blot t ing ( Tabel 1- 2) . Beberapa hal yang m em bedak an dengan Sout her n

blot t ing adalah: ( 1) RNA j auh lebih rent an t erhadap

digunak an unt uk m engik at ( crosslink) RNA pada m em br an sehingga t idak bergerak ( im obilisasi) .

Ga m ba r 1 - 9 Sout hern blot . DNA genom diisolasi dan digest i dengan enzim rest r ik si. DNA kem udian dirun pada gel agarose dan dit ransfer ke m em br an di m ana DNA kem udian diik at kan secara kov alen. DNA selanj ut nya dihibridisasi m enggunakan probe y ang dilabel 32_P. I nt erak si ant ara DNA dan probe y ang dilabel didet ek si dengan cara m em aj ankan DNA- m em bran ke film ot or adiografi.

Penent uan urut an nuk leot ida m erupakan analisis DNA yang paling det il. Ada beber apa t ek nik unt uk sek uensing DNA, t et api m et ode penghent ian rant ai dengan dideok si ( dideoxy chain t er m inat ion) yang dikem bangkan oleh Sanger adalah m et ode yang paling bany ak digunakan ( Gam bar 1- 10) . DNA m ula- m ula har us didenat ur asi dan dipisahkan m enj adi unt ai t unggal dengan cara pem anasan. Sat u prim er oligonuk leot ida yang dilabel radioak t if k em udian dit am bahk an k e dalam reak si dan ak an m enem pel pada sek uens pasangannya pada DNA t ar get . DNA polim erase digunakan unt uk m eny alin DNA unt ai t unggal. dNTP dalam j um lah banyak ( sam pai j enuh) hany a ak an m enghasilkan produk ek st ensi dengan uj ung t er label r adioakt if, t api t idak m enghasilkan infor m asi ur ut an basa. Penam bahan sedik it ddNTP ke dalam cam puran dNTP akan dapat m em ber ikan inform asi urut an basa DNA. Dideoksinuk leot ida akan t er ink or por asi pada uj ung 3’ unt ai DNA y ang bar u disint esis. DNA polim erase t idak dapat m enam bahkan basa bar u pada ddNTP. Dengan dem ikian, inkorporasi ddNTP m engak ibat kan penghent ian sint esis r ant ai DNA. Penam bahan dNTP dan ddNTP dengan rasio yang t epat m em ungkink an unt uk m enghent ikan sint esis rant ai DNA pada t iap posisi nuk leot ida. Sebagai cont oh, j ik a ek t ensi prim er dilak ukan m enggunakan dATP, dTTP, dGTP dann ddCTP, polim er ase

akan m ensint esis unt ai DNA bar u sam pai dia har us m enggunak an ddCTP ( m isalnya ket ika basa k om plem enny a G) . ddCTP akan t er ink or porasi, dan pada t it ik ini DNA polim erase t idak ak an dapat m elanj ut kan ekst ensi. Dengan dem ik ian, panj ang pr oduk hasil ekst ensi yang t er label radioakt if m enent ukan osisi G pert am a y ang disalin. Unt uk m enent uk an posisi G yang lain, bukan hanya G y ang per t am a, r eak si sek uensing y ang sebenar nya dilak uk an dengan m enggunak an cam puran dCTP dan ddCTP dengan perbandingan ~ 200: 1. Pada kondisi ini kem ungk inan t erj adi penghent ian rant ai DNA adalah ~ 1: 200 yang t er j adi k et ika t erdapat G pada DNA y ang disekuensing. Akan diperoleh produk ekst ensi dengan berbagai panj ang, y ang dapat div isualisasi set elah elk t rofor esis pada gel poliak r ilam id. Berdasark an pada panj ang produk, m aka t iap fr agm en akan m enent ukan posisi sat u G. Unt uk m enent ukan posisi keem pat basa, em pat r eaksi sekuensing dilakukan unt uk t iap sam pel. Pada t iap r eaksi dicam purk an dNTP dan ddNTP yang sesuai dikom binasi dengan 3 dNTP lainny a dalam k onsent rasi j enuh. Keem pat reak si kem udian dielek t r oforesis ber sebelahan pada gel ( poliak r ilam id-denat urasi) sek uensing sehingga hasil sekuens DNA dapat langsung dibaca. Secar a t eorit is sekuensing DNA nam pak nya cuk up r um it , t api sebenar nya pada k enyat aannya relat if sangat m udah.

Teknologi m oder n t elah m em ungk inkan unt uk m elakuk an ot om asisasi sek uensing DNA. Unt uk skala besar , r obot dapat digunak an unt uk m eny iapkan reak si sekuensing. Yang lebih pent ing adalah peralat an yang ada saat ini t elah m em ungk inkan k it a unt uk dapat m em baca hasil sekuensing secar a langsung dan sek aligus dapat m eny im pan dat a ke dalam dat abase kom put er . Selain m engur angi ker j a m anusia, ot om asisasi dem ik ian j uga m engurangi fak t or k esalahan yang ser ing t erj adi dalam pem bacaan dan pem ulisan urut an DNA secar a m anual. Kebany akan m esin sekuensing sekarang m enggunak an fluorescent ( cat y ang berfluoresensi)

sebagai penggant i radioakt if. Cat ini dapat diinkorporasik an ke dalam pr im er sek uensing at au ke dalam nuk leot ida. Seper t i pada sekuensing m anual, elek t rofor esis gel ( at au elek t roforesis k apiler) digunakan unt uk m em isahkan fragm en DNA ber dasr k an ukurannya. Hanya saj a pada sek uensing ot om at is det eksi fragm en DNA y ang berfluoresensi dilak ukan dengan bant uan sinar laser dan sinyal diproses oleh kom put er.

Ta be l 1 - 2

Rin gk a sa n Pr ose du r Blot t in g

Prosedur

Sunstansi

yang

dideteksi

Probe

Aplikasi

utama

Southern blot

DNA

Asam

nukleat

Struktur gen

Northern blot

RNA

Asam

nukleat

Ekspresi gen

Western blot

Protein Antibodi Jumlah

protein

Southwestern

blot

Protein

DNA

Interaksi

protein-DNA

Farwestern

blot

Protein Protein Interaksi

Ga m ba r 1 - 1 0 Sekuensing DNA. Cet akan, pr im er dan polim er ase dit am bahkan pada suat u r eak si y ang ber isi dideok si dan deoksinuk leot ida. Em pat r eaksi yang t er pisah yang m asing- m asing m enggunakan ddATP, ddTTP, ddCTP dan ddGTP. Tiap r eak si k em udian dirun ( dielekt r oforesis) pada gel poliakr ilam id. At au sebagai alt er nat if, reaksi sek uensing dilak uk an m enggunakan nukleot ida ( at au prim er) y ang dilabel fluorescent agar dapat didet ek si dengan laser . Sekuens/ urut an DNA kem udian didow nload k e k om put er .

Met ode sek uensing ot om at is lainny a sedang dikem bangk an, t er m asuk penggunaan chips DNA. Pada st rat egi ini sej um lah besar nuk leot ida yang diat ur dan dilekat kan pada chips DNA. Hibr idisasi fragm en DNA pada chips m em ungk inkan det ek si sekuens yang overlap yang dapat diubah m enj adi sekuens DNA y ang t er hubung ( ny am bung) . Tek nologi ini t erut am a akan sangat ber guna unt uk m endet ek si polim orfism e dan m ut asi, karena sek uens yang t elah diket ahui dapat dilek at kan pada chips dengan var iasi t ert ent u pada t iap nuk leot ida.

Polim orfism e ur ut an DNA ber peran pent ing dalam genet ik a m olekuk er. Polim orfism e DNA adalah per ubahan ur ut an DNA dengan fr ekuensi > 1% pada suat u populasi. Ber beda dengan m ut asi, per ubahan urut an ini t idak ber pengar uh bur uk t er hadap fungsi gen. Polim orfism e dapat dianggap sebagai var iasi net ral ur ut an DNA. Polim orfism e pent ing kar ena dapat digunakan unt uk m elacak lokus gen dan m em buat silsilah. Polim or fism e DNA dapat digolongkan m enj adi berbagai kelas dan m et ode det ek sinya pun berm acam - m acam . Beber apa yang sangat pent ing ak an dibahas ber ikut ini...

Re st r ict ion Fr a gm e n t - Le n gt h Poly m or ph ism ( RFLP) . Polim orfir m e DNA y ang paling seder hana adalah

per ubahan sat u basa. Jika basa yang ber ubah t er let ak pada daerah sit us r est r ik si suat u endonuk lease rest rik si, m aka perbedaaan basa ini akan m enghilangkan sit us rest rik si enzim ( Gam bar 1- 11) . At au sebalik ny a, polim or fism e m encipt ak an sit us r est r iksi bar u. Polim orfism e sat u basa dem ik ian akan m engubah uk ur an fragm en DNA yang dihasilk an j ika dilak ukan digest i DNA dengan enzim t ert ent u. Pit a y ang berubah ukuranny a ini

dapat didet eksi set elah elekt r oforesis gel agar ose dan

Sout hern blot t ing. Jika sit us rest r ik si hilang, pit a

polim orfik ak an m enj adi lebih besar , dan sebalikny a j ika t erbent uk sit us rest rik si baru m ak a pit a plim orfik m enj adi lebih k ecil dibanding pit a dar i populasi um um . Polim orfism e sat u- basa diduga t erj adi pada set iap 1 k b pada genom m anusia. Seper enam dar i per ubahan ini dapat didet ek si m enggunakan m et ode RFLP ( polim or fism e panj ang- fr agm en hasil pem ot ongan) . Walaupun RFLP r elat if bany ak pada genom , ket er bat asan penggnaanya adalah kar ena hanya ada 2 alel unt uk t iap polim or fism e y ang berar t i ada at au t idak ada sit is rest r iksi. Selain it u,

Sout hern blot t ing m em er lukan sej um lah besar DNA unt uk

analisis ( 5- 10 µg) .

V a r ia ble n u m be r t a n de m r e pe a t s ( V N TR). Kelom pok

polim orfism e lain y ang pent ing adalah VNTR ( m inisat elit ) , digunakan unt uk aplikasi for ensik dan t es pat ernit as. VNTR t erdir i dar i ‘repeat s’ ulangan suat u urut an DNA ( 0.1- 10 kb) y ang m uncul/ ber ulang beber apa kali dalam sat u genom . Jum lah repeat s dalam VNTR sangat polim orfik ( bervar iasi ant ar indiv idu dalam sat u populasi) . Unt uk m endet eksi polim orfism e, digunakan enzim rest rik si, y ang m em ot ong di luar r epeat . Fragm en yang diper oleh akan ber var iasi t er gant ung pada j um lah repeat s dan dapat dengan m udah dibedakan dengan elek t rofor esis gel agarose dan Sout her n

blot t ing. Ber beda dengan RFLP, polim orfism e VNTR dapat

m em puny ai bany ak alel ( kadang bisa sam pai 100) , m enghasilkan fr agm en dengan ukuran y ang ber beda- beda. Nam un, VNTR t erm asuk polim orfism e yang j ar ang, dan densit asnya pada genom m anusia t idak cukup unt uk m elakuk an analisis linkage unt uk sem ua kr om osom m anusia.

M icr osa t e llit e. Repeat s m ik rosat elit m ir ip dengan VNTR

Ga m ba r 1 - 1 1 Rest r ict ion Fragm ent Lengt h Polym or phism ( RFLP) . DNA genom diisolasi kem udian dit am bah dengan

pr im er dan DNA polim er ase unt uk m engam plifikasi DNA pada daer ah t ar get y ang diinginkan. Dua alel ber beda pada sit us r est r ik si EcoRI , dim ana sat u alel m em ilik i sit us rest rik si EcoRI ( GAATTC) , sedangk an alel lainnya t idak karena m em ilik i basa C yang m enggant i G pada posisi yang sam a ( CAATTC) . Set elah am plifik asi dan digest i dengan enzim rest r ik si EcoRI , produk kem udian dirun pada gel agar ose bersam a- sam a dengan sam pel yang t idak didigest i ( uncut ) . I ndiv idu 1 hom ozigot unt uk alel per t am a, indiv idu 2 het er ozigot unt uk alel t ersebut , dan indiv idu 3 hom ozigot unt uk alel k edua.

m ult ipel salinan, dan alel dibedakan ber dasark an ukuranny a. Repeat s m ik rosat elit j auh lebih sederhana, yang aping banyak digunakan adalah repeat y ang t er dir i dar i 2 ( dinuk leot ida) , 3 ( t rinuk leot ida) dan 4 ( t et r anuk leot ida) . Repeat s dinuk leot ida cukup bay ank t er dapat pada genom m am alia, t er ut an dinuk leot ida CA. Mik rosat elit dapat didet eksidengan PCR. Dua prim er yang m em bat asi r epeat digunakan unt uk m em per banyak suat u daerah, k em udian hasil PCR dianalisis pada gel poliak rilam id- denat urasi. Jik a repeat dinukleot ida berbeda sat u unit dibanding populasi m ak a hasil PCR akan ber beda sebesar 2 pb. Per bedaan sebesar ini dapat didet ek si pada gel poliak r ilam id. Seper t i j uga VNTR, r epeat s m ik rosat elit biasany a m em punyai banyak alel y ang berbeda ( uk ur an repeat ) . Kar ena det eksi berdasarkan PCR, dan kar ena m ik k rosat elit banyak dij um pai pada genom , polim or fism e j enis ini m enj adi sangat pent ing unt uk st udi pem et aan gen dan analisis linkage.

Mut asi adalah per ubahan urut an DNA yang m em pengaruhi fungsi gen at au pr ot ein y ang disandinya.

Ber bagai m acam per ubahan dapat m engganggu fungsi gen, ant ara lain: gene rearrangem ent s, delesi DNA ( besar dan k ecil) , insersi dan perubahan sat u- basa. Teknik yang opt im al unt uk m ndet eksi m ut asi t er gant ung pada sifat m ut asi ( Tabel 1- 3) . Perubahan besar pada k rom osom ( lar ge chrom osom al r eaar angem ent ) , inser si, delesi ( ber uk ur an m egabasa) , paling baik didet ek si dengan t ek nik sit ogenet ik, t erm asuk fluor escent in sit u hybr idizat ion

( FI SH) . FI SH m enggunakan pr obe y ang dilabel fluor escent

unt uk m enghibr idisasi k rom osom . Pr obe fluorescent t er sedia unt uk pem et aan t iap kr om osom dan det eksi inver si dan delesi. Sout hern blot t ing digunak an unt uk m endet eksi r at usan sam pai r ibuan basa.

Mut asi y ang lebih t idak k elihat an, t rem asuk inser si dan delesi beber apa basa, dan per ubahan sat u- basa, m em er lukan t ek nik k husus unt uk sk r ining dan m engkarak t er isasi m ut asi. Dua m at er i aw al yang bany ak digunakan unt uk analisis m ut asi adalah m RNA dan DNA genom . Dibanding DNA genom ik , salah sat u keunt ungan analisis m RNA adalah seluruh t ransk r ip dapat dianalisis dar i sepot ong fragm en ( int ron t elah dik eluar k an) , sedangkan k ekur anganny a adalah gen yang dipelaj ar i har us diekspresikan pada j aringan yang dapat diam bil/ akses. Sebagai cont oh, gen yang ber t anggung j awab pada gangguan ot ak m ungk in t idak akan diek spr esik an pada k ulit at au sel darah. Tapi sebalik nya, kadang- k adang unt uk m engkarak t er isasi gen yang dom inan diekspr esikan di j ar ingan lain dapat digunakan m RNA yang diekst raksi dar i leukosit ( m isalnya m RNA resept or t hy roid- st im ulat ing

horm one) . Unt uk m enganalisis m ut asi m RNA, digunakan

RT unt uk m em buat cDNA yang kem udian diam plifik asi lebih lanj ut dengan PCR. Prosedur ini dik enal sebagai RT- PCR. Dna genom t er dapat pada sem ua sel, baik yang dit ransk r ipsikan m aupun t idak. Nam un, ur ut an DNA yang m enyandi prot ein t er sebar sebagai beber apa ex on, yang ant ar ex on dapat ber j arak r ibuan basa. Oleh k ar ena it u, unt uk m enganalisis m uat si pada DNA genom , t iap exon diam plifikasi dengan PCR. Met ode unt uk analisis m ut asi m enggunak an hasil PCR baik yang ber asal dar i m RNA m aupun DNA genom ant ar a lain dilakuk an berdasarkan perubahan st ruk t ur sek under DNA yait u dengan cara elek t rofor esis gel m enggunak an gradien denat ur an ( denat ur ing gr adient gel elect rophor esis, DGGE) , polim orfism e konform asi unt ai t unggal ( single- st r anded

confor m at ional polym orphism , SSCP) , dan beber apa t ek nik m ism at ch cleavage. Teknik ini t erut am a berguna unt uk

Ta be l 1 - 3

Te k n ik D e t e k si M u t a si

Metode

Delesi gen Gene rearrangement Loss of heterozigosity (LOH) Linkage Mutasi titik

Sitogenetik (FISH)

+

Southern blot

+

+

RFLP

+

+

VNTR

+

+

PCR +

+

+

+

+

Sekuensing DNA

+

Mismatch cleavage

+

OSH

+

DGGE

+

SSCP

+

PTT

+

FISH, fluorescent in situ hybridization; RFLP, restriction fragment length polymorphism; VNTR, variable number

tandem repeat; PCR, polymerase chain reaction; OSH, oligonucleotide specific hybridization; DGGE, denaturing

gradient gel electrophoresis; SSCP, single stranded conformational polymorphism; PTT, protein truncation test.

Kem am puan unt uk m engekspr esik an pr ot ein r ekom binan dalam j um lah besar adalah salah sat u m anfaat y ang dapat diperoleh dar i k loning cDNA. Bany ak sek ali kegunaan pr akt is dar i prot ein r ekom binan ( Tabel 1-4) . Salah sat uny a adalah sebagai sum ber reagen ( m isalnya enzim rest r ik si) y ang t idak ak an habis dan m erupakan sum ber yang t idak t er nilai unt uk hor m on dan

grow t h fact ors ( m isalnya insulin m anusia dan

er it ropoiet in) yang sulit diper oleh dar i sum ber alam inya. Ket ersediaan prot ein rek om binan dalam j um lah besar j uga sangat m em bant u dalam st udi biofisik dan analisis st ruk t ur dan fungsi prot ein.

Ta b e l 1 - 4

Be b e r a p a Pe n ggu n a a n Pr ot e in Re k om bin a n

Tujuan ekspresi protein

rekombinan

Contoh

Obat aktif secara biologi

dalam jumlah tanpa batas

Hormon pertumbuhan,

insulin, eritropoietin

Sumber enzim murni yang

melimpah

Enzim endonuklease

restriksi, Taq polimerase

Studi struktur protein

Kristalografi X-ray, NMR

Studi struktur-fungsi

Transcription factor, enzim

Skrining obat

Reseptor, enzim

Membuat antibodi

Antigen protein

Deteksi interaksi

protein-protein

Uji 2-hibrid ragi, skrining

farwestern

Tr a n sla si in vit r o ( in vit r o t r a n sla t ion ) pr ot e in r e k om bin a n Ada banyak m et ode dan hospes ( pej am u) unt uk m engek spr esik an prot ein r ek om binan, dan hanya beberapa akan dibahas ber ik ut ini. Car a yang paling seder hana unt uk m engekspr esikan prot ein r ek om binan adalah dengan in vit ro t r anslat ion m enggunak an lisat ret ik ulosit ( r et iculocyt e ly sat es) . Dengan cara ini, m RNA ( biasanya dit ransk r ipsik an secar a in vit ro dar i cDNA yang dik lon dalam plasm id) dit erj em ahk an ( t ranslasi) m enggunakan r ibosom yang ada dalam lisat r et ik ulosit . Walaupun prot einny a t idak ber j um lah banyak, prot ein t ersebut dapat dilabel dengan asam am ino radioakt if

( m isalnya 35_{S- m et ionin) . Prot ein y ang dit ranslasikan} secara in vit ro dapat digunak an sebagai subst r at unt uk enzim - enzim , reaksi kat alisis, im unopresipit asi, uj i int erak si DNA- prot ein, dan lain- lain.

Ek spr e si pr ot e in r e k om bin a n da la m E. coli E. coli

adalah salah sat u hospes per t am a yang digunak an dan akan t et ap m enj adi sum ber y ang pent ing unt uk m engek spresik an prot ein rek om binan. E. coli paling baik digunakan unt uk ekspr esi pr ot ein int raseluler y ang relat if k ecil dan t idak m em er luk an m odifik asi pascat ranslasi ( post t raslat ional m odificat ion) yang t er lalu bany ak unt uk dapat ber fungsi. Prot ein diekspr esikan dengan bant uan v ekt or plasm id unt uk ek spresi, yang banyak diant aranya dapat diinduksi dengan pem berian r eagen seper t i I PTG ( yang akan m elepas r epresi prom ot or) unt uk m engasilkan ek spresi dalam j um lah t inggi sebelum k em udian dipur ifikasi. Melekat k an prot ein t ert ent u pada m olek ul lain m isalnya  galakt osidase kadang- k adang dapat lebih m enst abilkan pr ot ein, yang j ik a t idak dilek at kan m ungk in akan t erdegradasi dalam E. coli. Hal um um lain yang j uga dapat dilak ukan adalh dengan m enam bahkan label/ m ark a ( t ag) yang t elah dipur ifikasi kepada prot ein y ang diekspr esikan unt uk m em udahkan m enem ukan/ m engisolasi prot ein set elah diekspr esikan. Mar ka yang banyak digunakan adalah glut at ion- S-t r ansferase ( GST) yang dapaS-t diisolasi m enggunakan k olom glut at ion at au m ark a hist idin unt uk isolasi m enggunak an k olom nik el. Salah sat u keunt ungan sist em ekspr esi pada E. coli adalah m udah unt uk m elakuk an m anipulasi DNA rekom binan ( m ir ip sepert i k loning plasm id) dan pr oses selek si dan ekspr esi yang cepat . . Ker ugiannya adalah ket idak m am puan unt uk m elakuk an prosesing kom pleks seper t i glik osilasi, dan bahwa beber apa pr ot ein ber sifat labil ( at au t ok sik ) pada hospes. Selain it u, prot ein yang besar biasanya t idak diproduk si at au t idak t er lipat ( folding) dengan efisien.

( w alaupun secar a st r ukt ural berbeda dengan sel m am alia) , dan dapat m engek spresik an lebih dar i sat u prot ein ber sam a- sam a sekaligus ( m isalnya im unoglubulin) . Prot ein rek om binan biasany a akan t er lok alisasi seper t i pada sel nor m al ( m isalny a resept or pada m em br an, t r anscript ion fact ors pada nuk leus) , walaupun t ingkat ek spresi y ang t inggi akhir nya dapat m engganggu pola ini. Tingkat ek spr esi y ang t inggi ak an m em udahk an pur ifikasi, kecuali j ika t er j adi agr egasi. Nam un, unt uk m elak ukan selek si dan r ekom binasi sej um lah besar pr ot ein m ut an pada sist em ini m asih agak sulit .

Ekspr esi pada galur sel m am alia. Banyak pr ot ein m em er lukan ekspr esi m em ggunak an sist em sel m am alia. Walaupun sist em ini sangat j ar ang dapat m enpr oduk si prot ein seefisien E. coli at au Baculov ir us, salah sat u kelebihannya adalah m am pu m em pr oses polipept ida kom pleks m enggunak an m esin int raseluler y ang sesuai. Selain segi prosesing pept ida, folding, at au glikosilasi yang dapat dilak ukan dengan t epat , unt uk m engekspr esi pr ot ein t ert ent u ser ingkali diperluk an kondisi yang hanya dapat dicapai dengan m enggunak an sel hom olog at au j ar ingan khusus ( t issue specific) . Sebagai cont oh, unt uk m em pelaj ar i beber apa r esept or at au t ranscr ipt ion fact ors m aka per lu dilakuk an ekspr esi prot ein t er sebut pada sel yang m engandung cofak t or at au t ar get yang sesuai. Unt uk m am m alian cell lines, ek spresi cDNA biasanya diat ur dengan prom ot or yang k uat dar i suat u v ir us. Sebagai alt er nat if, t elah dik em bangk an vekt or ekspr esis y ang dapat diinduksi yang m em ungk ink an unt uk m elak ukan selek si klonal yang kem udian diik ut i dengan induksi prom ot or dengan cara m enam bahk an ( at au m enghilang) reagen t er t ent u ( m isalny a t et rasik lin) yang dapat m em odulasi ak t iv it as pr om ot or . Prot ein y ang m engandung leader

sequence dapat disek resik an ke dalam m edia. Hal ini

m engak ibat k an pengencer an konsent rasi prot ein, nam un kont am inan m edia ekst r aseluler akan j auh lebih sedik it dar ipada int r aseluler sehingga isolasi dan pur ifikasi prot ein yang ber sangk ut an akan lebih m udah.

Ek spr e si m e n ggu n a k a n v e k t or a d e n ov ir u s Bany ak vir us digunak an unt uk ekspr esi pada sel m am alia, m em anfaat kan sifat t ropism e alam i v ir us dan k em am puan vir us unt uk m enginduk si perubahan m esin sint esi int raseluler sehingga m enghasilkan t ingkat ekspresi yang t inggi. Vekt or adenov irus sangat m enarik karena t elah m enginfek si berbagai m acam sel m am alia dan k arena genom adenov ir us t elah dapat diubah m enghasilk an v ir us yang t idak m apu- replik asi dan dapat m em baw a sekuens m anusia. Adenov ir us t elah bnayak digunak an unt uk m engekspr esik an prot ein r ek om binan pada sel dan j ar ingan yang sulit dit ransfek . Penggunaan adenov irus sebagai vekt or unt uk t er api gen j uga m enj adik an sist em ini sangat m enar ik unt uk ekspr esi gen.

Dengan m enghilangk an gen- gen kunci adenov irus, v irus yang dusah dim odifikasi ini dapat ber fungsi sebagai pem baw a gen m am alia. Mem asukk an vekt or v ir us yang m engandung gen yang dik ehendak i ke dalam sel 293 yang m engekspr esik an E1a m em ungk inkan unt uk m engem as dan m em anen vir us ser t a v ir us t idak ber - r eplik asi pada sel lain. Vek t or adenov ir us t elah digunakan unt uk m engekspr esik an gennor m al pada or gan yang defekt if ( m isalnya ekspr esi CFTR pada pender it a cyst ic fibrosis) , unt uk m engek spr esik an gen yang t oksik pada t um or ( m isalnya t im idin k inase pada t um or ot ak ) , dan unt uk m ent arget gen cell- cycle ar rest pada sel vask uler yang sedang berproliferasi. Ket erbat asan adenov ir us ant ar a lain ket idakm am puanny a unt uk m ener im a DNA asing > 10 kb, j angka wak t u ekspr esinya r elat if pendek in vivo ( beberap m inggu sam pai bulan) ,t ok sik t er hadap sel, dan m enginduksi r espon im un. Beber apa sist em pem baw a vir us lain sedang dik em bangkan t er m asuk Adeno-associat ed v ir us, Her pes dan r et rov ir us ( y ang ber int egrasi

k e dalam genom hospes) . Vaksin v ir us j uga digunak an unt uk m engek spr esikan prot ein rekom binan dalam cell lines, m isalny a sel HeLa, sebagai m ekanism e y ang efisien unt uk ekspr esi gen pada galur sel m am alia.

Sist e m la in u n t u k e k spr e si pr ot e in r e k om bin a n Bany ak sist em lain yang digunak an t api t idak akan dibahas di sini, ant ar a lain pr oduk si dalam susu binat ang,

Dr osophila, ragi dan t anam an.

Uj i t ransk ripsi biasany a dilak ukan unt uk m engident ifik asi j alur y ang m enginduksi ekspresi gen pada t ingkat inisiasi t ranskr ipsi. Uj i ini m enam bah inform asi yang diperoleh dar i st udi konsent rasi m RNA pada st eady- st at e levels, yang biasanya dit ent ukan dengan t ek nik Nort hern blot , uj i per lindungan t erhadap RNAse ( RNAse prot ect ion assay) , at au RT- PCR. Dengan m enggunak an gen r epor t er sebagai gam bar an ak t iv it as gen hasil fusi ant ar a pr om ot or - repor t er yang dit ransfek sikan ke dalam sel, m ak a elem en r egulat or DNA pada prom ot or dapat dik et ahui. Sek ilas m engenai

nuclear run- on t ranscript ion assays dan report er gene assays ak an dibahas ber ikut ini.

N u cle a r Ru n - On Assa ys Jik a regulasi m RNA sudah dit unj uk kan dengan uj i Nor t her n blot at au m et ode lainnny a, ser ingkali harus diket ahui apakah per ubahan y ang t er j adi pada konsent rasi m RNa pada st eady- st at e disebabkan oleh per ubahan pada t r ansk r ipsi gen at aukah per ubahan pada st abilit as m RNA. Nuclear ‘r un- on assay ’ adalah pendekat an k lasik ang digunakan unt uk m em pelaj ar i r egulasi t ransk ripsi. Pada prosedur ini, int i sel diisolasi set elah pem berian st im ulasi t ert ent u dan dibiarkan agar t erj adi sint er is m RNA in vit ro, j um lah m RNA pada kondisi ini m enunj ukk an j um lah t ranskr ip y ang t elah dim ulai sebelum init i diisolasi. Transk rip yang t elah dim ulai t er sebut ak an diperpanj ang ( elongat ion) m enggunak an r ibonuk leot ida y ang dilabel r adioak t if yang ada dalam cam puran r eak si in v it ro, k em udian m RNA y ang t er label dihibr idisasik an k e k lon spesifik yang m engandung DNA t erim obilisasi unt uk dik uant ifik asi.

Ek spr e si ge n se m e n t a r a ( t r a n sie n t ) da n ge n r e por t e r. St udi t ransient gene ex pression m er upakan m et ode alt ernat if unt uk m enget ahui kont rol t ransk r ipsi ( Gam bar 1- 12) . Met ode ini j uga dapat digunakan unt uk m em buat m ut asi ur ut an DNA prom ot or sebelum dim asukkan k e dlam sel. Sekuens prom ot or suat u gen difusik an k e gen r epor t er yang dapat diuj i dengan m udah. Gen repor t er yang ser ing digunakan adalah

chloram phenicol acet y lt ransferase ( CAT) dan luciferase

( LUC) . Kedua enzim t er sebut secar a norm al t idak t er dapat pada sel eukary ot ik . Jadi, j ika t idak ada t ransfer gen, m aka akt iv it as enzim t er sebut dapat diabaik an. Saat ini m udah unt uk m endapat k an vekt or kom er sial y ang dapat digunakan unt uk m eny isipkan elem en pr om ot or at au enhancer ke dalam berbagai k onst ruk gen report er .

Uj i CAT m engkat alisis t ransfer gugus aset il dar i aset il-CoA k e subst r at , k loram fenikol, dan dapat dipant au m enggunak an kr om at ogr afi lapis- t ipis ( t hin- lay er

chr om at oggr aphy, TLC) , enzym e- link ed im m unosorbent assay ( ELI SA) , at au dengan det ek t or radiasi ( liquid scint illat ion count ing) .

pr om ot or y ang digunakan. Uj i luciferase 30- 100 kali lebih sensit if dar ipada uj i CAT. Gen repor t er lain yang sering digunak an adalah gen  galak t osidase, hor m on per t um buhan, alkaline fosfat ase, dan gr een flurescent pr ot ein.

Konst ruk si ( const r uct ) gen fusi ant ar a pr om ot or dan repor t er dim asukk an ke dalam sel m elalui proses t ransfek si. Pr ot ok ol t ransfeksi yang um um digunak an ant ara lain Ca2+_{PO4, DEAE- dext ran, liposom e, dan elek t roporasi. Gen} yang dit ransfeksikan ak ah ak t if dit ransk r ipsi sam pai 24- 72 j am , sehingga analisis fungsi prom ot or dapat seger a dilak uk an. Selain it u, gen yang dit ransfeksikan dapat dim asuk kan ke dan st abil t et ap di dalam sel dengan cara selek si m ark a resist ensi ant ibit ika m isalny a neom isin at au dehidrofolat r eduk t ase. Tuj uan ut am a t ransfek si adalah unt uk m enget ahui urut an DNA y ang m em punyai fungsi sebagai pr om ot or at au y ang dapat ber - r espon t er hadap sinyal ek st raseluler spesifik at au m elalui j alur pem bawa pesan k edua ( second m essenger pat hw ay) . Bany ak m et ode yang sekarang dapat digunak an unt uk m em buat delesi at au m ut asi pada elem en pr om t or ( Gam bar 1- 8) . Pendekat an ini sangat pent ing unt uk m enget ahui urut an DNA y ang m engat ur ekspresi gen yang k has unt uk t iap j ar ingan ( t issue- specific) , akt iv it as prom ot or basal, dan respon t erhadap sinyal int raseluler.

St udi prot ein- DNA biasany a m elibat k an fak t or- fak t or t r ansk r ipsi y ang m engik at elem en regulasi pada pr om ot or gen. Karak t erisasi int erak si dem ik ian dapat dilak ukan dengan uj i foot pr int ing dan m et ode lain yang lebih langsung unt uk m enget ahui pengik at an prot ein pada DNA, sepert i uj i pergeseran m obilit is elekt roforet ik ( elect rophoret ic m obilit y shift assay) . Tuj uan st udi t er ebut adalah unt uk m engident ifikasi daerah pada gen yang m engikat pr ot ein, unt uk m engkarak t er isasi t r anscript ion fact or, dan unt uk m engk orelasikan hasil-hasil t ersebut dengan st udi fungsi regulasi prom ot or.

D N A foot pr in t in g. Tek nik foot print ing didasar kan pada sifat prot ein yang dapat m elindungi DNA t er hadap digest i oleh nuk lease, dengan dem ik ian akan m eninggalkan j ej ak ( foot print ) pada posisi di m ana prot ein t er ikat ( Gam bar 1- 13) . Uj i foot print ing dapat dilak uk an secara in v ivo dan in v it ro, dan pendekat an ini ser ingkali m em berik an hasil y ang berbeda, yang m enunj ukk an bahw a int er ak si ( at au prot ein yang t er libat ) yang t er j adi pada sel ut uh ( int act cell) berbeda dengan yang t er j adi pada DNA saj a ( naked DNA) y ang dicam pur dengan ek st r ak prot ein int i sel.

Pada foot print ing in vit ro, DNA dilabel pada sat u at au kedua unt ainy a dan dicam pur dengan prot ein int i sel. Set elah prot ein t er ikat secara spesifik pada DNA dengan ur ut an basa t ert ent u ( sequence- specific) , DNAse I nuk lease dit am bahk an pada konsent r asi y ang akan m em ot ong DNA secara ( ham pir ) acak . Konsent rasi DNAse I yang dit am bahkan har us m endigest i DNA pada lebih dar i sat u t em pat sehingga akan dihasilkan t angga ( ladder) fr agm en pot ongan y ang t er label. Daerah di m ana pr ot ein t er ikat pada DNA akan t er lindung at au t idak dapat didigest i oleh DNAse I . Sebagai kont r ol, dilak ukan digest i DNA yang sam a t anpa m enam bahk an prot ein int i sel, at au lebih baik lagi j ika digunak an ek st r ak y ang t idak m engandung t ranscr ipt ion fact or t er t ent u. Reaksi digest i kem udian dielekt roforesis pada gel sekuensing DNA. Daerah yang t er lindung oleh prot ein ak an t idak t erdigest i yang j ik a dibandingk an dengan DNA kont r ol nam pak sebagai t em pat yang kosong ( gap) . Foot pr int ing in vivo m ir ip seper t i y ang t elah dit er angkan, hanya saj a sel yang diperm eabilisasi, at au int i sel ut uh, didigest i dengan DNAse I sebelum DNAnya diisolasi. Pola prot eksi dan

digest i dapat dit ent ukan dengan PCR yang dibant u dengan ligasi ( ligat ion- m ediat ed PCR) . Beber apa prosedur foot print ing dilakuk an unt uk m endet ek si apakah suat u m odifik asi k im ia pada gugus t er t ent u ( m isalnya, m et ilasi) dapat m engubah ak ses pada DNA. Sebagai cont oh, sel dapat diper lak uk an dengan dim et il sufat ( DMS) , y ang akan m em et ilasi basa guanin pada posisi N7. DMS dapat m asuk ke dalam sel dengan m udah dan m em et ilasi sat u guanin set iap 50 guanin. Jika prot ein ber ik at an dengan guanin m aka prot ein ini ak an m elindungi guanin t er sebut sehingga t idak t er j adi m et ilasi, dan selaj ut ny a j uga akan m elindungi t edapat pem ot ongan oleh piper idin. Selain it u, per lak uan DMS dan pem ot ongan dengan piper idin dapat dik om binasi dengan

ligat ion- m ediat ed PCR m enggunakan pr im er unt uk gen

t ert ent u unt uk m engam plifikasi suat u gen.

Met ode foot pr int ing ini sangat berguna unt uk

m enget ahu int er ak si prot ein- DNA, nam un m em puny ai beber apa k elem ahan diant ar any a hanya dapat digunakan unt uk m enganalisis 150- 200 pb; daerah y ang t er lindung pada suat u gen dapat dit ent uk an, nam un j enis dan sifat prot ein yang t erikat t idak dapat diident ifik asi; sensit iv it as uj i ini rendah dan hany a m endet ek si prot ein yang berj um lah bany ak dan m em punya afinit as t inggi t er hadap DNA kar ena DNA bebas dalam r eaksi akan m engganggu uj i ini. Resolusi t em pat pengikat an j uga relat if rendah, k ar ena pem ot ongan oleh DNAse I dapat t er j adi beber apa pasangbasa j auh dar i t em pat pengik at an prot ein dan

sequence- specific. Terak hir, agak sulit unt uk m elak uk an

st udi m ut agenesis pada t em pat int erkasi prot ein. Kar ena alasan- alasan t ersebut , m ak a pr osedur sepert i

elect rophoret ic m obilit y shift assay ( EMSA) lebih disukai.

Ga m ba r 1 - 1 3 DNAse I foot pr int ing dan EMSA. Ber m acam - m acam t eknik dapat digunakan unt uk m endet ek si int er aksi DNA- prot ein. ( A) . I lust rasi skem a pengikat an t ranscr ipt ion fact or pada DNA. ( B) Digest i DNAse I DNA y ang t erlabel m enghasilkan suat u t angga fragm en y ang t er label. Prot ein yang m engikat DNA akan m elindungi DNA pada daerah t ersebut t erhadap digest i DNAse I , m enghasilkan penam pakan seper t i foot pr int . ( C) . EMSA adalah per lam bat an m igrasi DNA t erlabel y ang disebabk an oleh pengik at an prot ein pada DNA. Pergeseran m obilit as DNA t er label yang disebabkan oleh adany a prot ein dit unj uk k an pada laj ur 2. Penam bahan DNA kom pet it or ak an m elepas prot ein y ang t erikat pada DNA ( laj ur 3) . Penam bahan ant ibodi ( Ab) t er hadap prot ein akan m engakibat k an super shift kom plek s ( laj ur 4) .

.

Ele ct r oph or e t ic M obilit y Sh ift Assa y ( EM SA) . EMSA ber dasar k an pada sifat bahw a pr ot ein yang m engikat DNA akan m enggeser m obilit as selam a elek t rofor esis, m em bent uk konpleks bar u yang m obilit asny a r endah ( Gam bar 1- 14) . Analisis foot pr int ing m em ber ikan inform asi k asar daerah int eraksi ( 150- 200 pb) , sedangkan pada EMSA DNA t erlabel y ang digunakan berk isar 10- 50 pb. EMSA sangat sensit if dan, karena oligonuk leot ida m ut an dapat dibuat dengan m udah, uj i ini sangat berguna unt uk m enent uk an nukleot ida yang benar- benar ber per an pada pengikat an pr ot ein. Perubahan m obilit as k om plek s DNA- prot ein sebanding dengan ber at m olekul k om plek s prot ein. Dengan alasan ini, EMSA dapat digunakan unt uk st udi dim er isasi prot ein dan unt uk m enget ahui kom pleks prot ein oligom er . EMSA j uga dapat digunakan unt uk m engkarak t er isasi lebih j auh pr ot ein t ert ent u dengan m elakuk an st udi kom pet isi dengan oligonuk leot ida yang t idak dilabel dan dengan m enggunakan ant ibodi unt uk lebih m enggeser ( supershift ) pr ot ein.

Uj i dilak ukan dengan m elabel oligonuk leot ida dengan 32_{P dan diink ubasi dengan prot ein dalam ekst rak int i sel} at au seluruh sel. Biasany a diper lukan oligonuk leot ida nonspesifik at au pem baw a DNA unt uk m engurangi pengik at an t idak spesifik t erhadap probe yang dilabel. Hasil r eak si k em udian dielekt roforesis pada gel poliak rolam id nondenat ur an dan dipaj ankan pada film aut or adiogr afi. DNA y ang t idak t er ikat dan kom plek s DNA- prot ein akan nam pak sebagai pit a- pit a, m enggam bark an m obilit as asliny a pada gel. Kelebihan

oligonuk leot ida y ang t idak t er label dapat digunakan sebagai kom pet it or unt uk m enent ukan spesifisit as pengik at an pada pr obe yang dilabel. Dengan m enggunak an sekuens oligonuk leot ida yang t elah dik et ahui dapat m engikat pr ot ein t er t ent u, m aka uj i ini dapat digunak an sebagai bukt i unt uk m enj elaskan sifat pr ot ein y ang t er ikat . Seper t i t elah dik em ukan sebelum nya, ident it as prot ein dapat dit ent ukan dengan m enggunak an ant ibodi t er hadap prot ein kandidat . Ant ibodi dapat m em ber ikan 2 m acam hasil, j ik a ant ibbodi m engenali prot ein sedem ik ian r upa sehingga m engubah pengik at an DNA ( m isalnya ant ibodi m engenal prot ein pada daer ah/ dom ain y ang m engik at DNA) ,