LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM BIOANALISIS LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM BIOANALISIS
P1 P1
PENETAPAN KADAR KREATININ DALAM DARAH DAN URIN PENETAPAN KADAR KREATININ DALAM DARAH DAN URIN
Disusun oleh: Disusun oleh: Rika
Rika Triyanapuri Triyanapuri G1F009009G1F009009 Rizky
Rizky Ramdhania Ramdhania G1F009010G1F009010 Harisa
Harisa Nida Nida K. K. G1F009011G1F009011 Resti
Resti Mahlifati Mahlifati A. A. G1F009012G1F009012
Hari/Tanggal
Hari/Tanggal : Se: Senin, nin, 11 11 Juni Juni 20122012
KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN
JURUSAN FARMASI JURUSAN FARMASI PURWOKERTO PURWOKERTO 2012 2012
I. TUJUAN
Mampu melakukan penetapan kadar kreatinin dalam plasma darah dan urin menggunakan metode Jaffe tanpa deproteinisasi
II. ALAT DAN BAHAN
Alat yang digunakan adalah pipet volume 1 ml, pipet volume 2 ml, tabung reaksi, eppendorf, spektrofotometri, tabung sentrifugasi, pipa kapiler, alat sentrifugasi.
Bahan yang digunakan adalah plasma darah, Reagen 1, reagen 2, standar kreatinin dan aquadest.
III. DATA PENGAMATAN
Blonko : 100 µL aquades
Standar : 100 µL standar kreatinin Konsentrasi standar = 2mg/dL
Absorbansi standar = A1 =0,395 dan A2 = 0,488
λ max standar = 492 nm
Kelompok Absorbansi I Absorbansi II Kadar mg/Dl
1 0,514 0,516 0,04 2 0,407 0,498 1,96 3 0,511 0,576 0,104 4 0,479 0,523 0,95 IV. PERHITUNGAN Kadar =
() ()
() ()
Sampel I =
= 0,04 mg/dL Sampel 2 =
= 1,96 mg/dL Sampel 3 =
= 0,104 mg/dL Sampel 4 =
= 0,95 mg/dL X̅
Ix-̅
I Ix-̅
I2 0,04 0,72 0,5184 1,96 0,76 1,2 1,44 0,104 0,656 0,43 0,95 0,19 0,0361Σ = 2,766 = 2,4245 SD
√
Σ̅
= 0,89CV =
X 100 % =
X 100 % = 117,1 %Kadar kreatinin dalam serum 0,76
0,89 mg/mL.V. PEMBAHASAN
Kreatinin merupakan produk penguraian keratin. Kreatin disintesis di hati dan terdapat dalam hampir semua otot rangka yang berikatan dengan dalam bentuk kreatin fosfat (creatin phosphate, CP), suatu senyawa penyimpan energi. Dalam sintesis ATP ( adenosine triphosphate) dari ADP (adenosine diphosphate), kreatin fosfat diubah menjadi kreatin dengan katalisasi enzim kreatin kinase (creatin kinase, CK ). Seiring dengan pemakaian energi, sejumlah kecil diubah secara ireversibel menjadi kreatinin, yang selanjutnya difiltrasi oleh glomerulus dan diekskresikan dalam urin (Baradero, 2005).
Jumlah kreatinin yang dikeluarkan seseorang setiap hari lebih bergantung pada massa otot total daripada aktivitas otot atau tingkat metabolisme protein, walaupun keduanya juga menimbulkan efek. Pembentukan kreatinin harian umumnya tetap, kecuali jika terjadi cedera fisik yang berat atau penyakit degeneratif yang menyebabkan kerusakan masif pada otot (Baradero, 2005).
Pemeriksaan urin dan darah untuk mengetahui kadar kreatinin biasanya menggunakan metode Jaffe Kinetik. Metode ini ditemukan pertamna kali oleh Jaffe tahun 1886. Reaksi Jaffe berdasar pada reaksi antara kreatinin dan pikrat pada suasanan basah yang akan membentuk warna merah orannye dan terjadi perubahan absorbsi pada panjang gelombang antara 505 nm dan 520 nm. Penentuan kadar kreatinin ini sangat penting untuk dilakukan untuk menunjukan keadaan fungsi ginjal. Prinsip dasar dari reaksi Jaffe adalah reaksi antara kreatinin dengan pikrat dalam suasana alkali tanpa deproteinasi, membentuk kompleks kreatinin pikrat berwarna jingga dan diukur menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 492 nm (Siangproh et al., 2009).
Metode Jaffe adalah yang paling umum digunakan cara penentuan kreatinin endogen karena diproduksi dalam tubuh manusia dan penetapan dapat dilakukan dengan murah, stabil dan Photometer reagen. Metode ini mempunyai kelebihan yaitu sederhana, murah, mudah, praktis, cepat, dan dapat dibaca pada panjang gelombang yang tinggi tanpa intervensi.
Sedangkan kekurangannya adalah metode ini kurang spesifik, sehingga kadar yang terukur tidak hanya kreatinin saja, tetapi juga kromogen-kromogen lain, seperti asam askorbat, glukosa, aseton, asam-asam keton (misal : asetoasetat dan piruvat), dan obat-obatan (misal : guanidin dan cephalosporin). Untuk meminimalisir pengaruh senyawa-senyawa tersebut, maka dilakukan beberapa modifikasi, antara lain :
1. Presipitasi/ Pengendapan, untuk meminimalisir pengaruh protein.
2. Reaksi pembentukan kompleks dengan borat, untuk meminimalisir pengaruh glukosa dan asam askorbat. 3. On exchange. (Siangproh et al., 2009). A. Monografi Bahan 1. Aquades Rumus molekul :H2O
Berat molekul : 18,02 g/mol
Air murni adalah air yang dimurnikan yang diperoleh dengan destilasi, perlakuan menggunakan penukar ion, osmosis balik atau proses lain yang sesuai. Dibuat dari air yang memenuhi persyaratan air minum dan tidak mengandung zat tambahan lain. Densitas 0,998 g/cm³ dalam fase cairan dan 0,92 g/cm³ dalam fase padatan. Titik leburnya 0 °C (273,15 K) (32 ºF) dan titik didihnya 100 °C (373.15 K) (212 ºF).
Pemeriaan : cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau dengan pH antara 5,0 -7,0.
2. Asam Pikrat
Asam pikrat atau 2,4,6-trinitrophenol (TNP) ialah senyawa trinitroaromatik yang bersifat eksplosif dan mudah terbakar dalam keadaan kering. Dengan logam membentuk logam pikrat. Asam pikrat berwujud kristal kuning pucat tak berbau, sedikit larut dalam air dan sensitif terhadap air dan goncangan. Ketika dibasahi dengan 30% air, asam pikrat berubah warna menjadi padatan kristal orange. Ketika dilarutkan dalam pelarut organik membentuk larutan berwarna kuning cerah. Asam pikrat mudah terbakar bila dibasahi dengan 30% air dan sangat mudah meledak bila kehilangan kelembapan sebesar 30%. Asam pikrat bersifat toksik dan merupakan iritan bagi kulit. Rumus molekulnya C6H3N3O7, kelarutan
dalam air 12.7 g·L−1 dan massa molarnya 229.10 g·mol−1(Anonim, 1995).
3. EDTA
EDTA adalah kependekan dari ethylene diamin tetra acetic. EDTA berupa senyawa kompleks khelat dengan rumus molekul (HO2CCH2)2NCH2CH2N(CH2CO2H)2. Merupakan
suatu senyawa asam amino yang secara luas dipergunakan untuk mengikat ion logam logam bervalensi dua dan tiga. EDTA mengikat logam melalui empat karboksilat dan dua gugus amina. EDTA membentuk kompleks kuat terutama dengan Mn (II), Cu (II), Fe (III), dan Co (III) (Anonim, 1995).
EDTA adalah reagensia yang sangat selektif karena ia kompleks dengan banyak sekali kation di-, tri- dan tetra-valen. Bila suatu larutan yang mengandung dua kation yang berkompleks dengan EDTA, dititrasi tanpa penambahan indikator pembentuk kompleks, dan jika diperoleh titrasi sebesar 0,1%, maka angka banding antara tetapan-tetapan kestabilan dari
kompleks-kompleks EDTA dari dua logam M dan N harus sedemikian, sehingga Km/Kn > 106. Jika dikehendaki tidak mengganggu. Etilendiamintetrasetat atau yang dikenal dengan EDTA, merupakan senyawa yang mudah larut dalam air, serta dapat diperoleh dalam keadaan murni. Tetapi dalam penggunaannya, karena adanya sejumlah tidak tertentu dalam air, sebaiknya distandardisasi terlebih dahulu. Terlihat dari strukturnya bahwa molekul tersebut mengandung baik donor elektron dari atom oksigen maupun donor dari atom nitrogen sehingga dapat menghasilkan khelat bercincin sampai dengan enam secara serempak (Khopkar, 1990).
4. Natrium Hidroksida (NaOH)
Rumus molekul : NaOH Berat molekul : 40,0 g/mol.
NaOH mengandung : tidak kurang dari 95,0% dan tidak lebih dari 100,5% alkali jumlah, dihitung sebagai NaOH, mengandung Na2CO3 tidak lebih dari 3,0%.). NaOH dapat merusak
jaringan dengan cepat.
Pemerian : putih atau praktis putih, massa melebur, berbentuk pellet, serpihan atau batang atau bentuk lain, keras, rapuh dan menunjukkan pecahan hablur. Bila dibiarkan di udara akan cepat menyerap karbon dioksida dan lembap. NaOH mudah larut dalam air dan dalam etanol.
Kelarutan : mudah larut dalm air dan dalam etanol
Wadah dan penyimpanannya : dalam wadah tertutup rapat (Anonim, 1995).
5. Kreatinin
Kreatinin adalah produk katabolisme dari keratin fosfat yang ada di dalam otot. Hasil katabolisme tersebut memiliki nilai yang konstan dalam tiap individu setiap harinya. Kreatinin sangat bergantung dari massa otot. Secara kimiawi, kreatinin merupakan derivat dari kreatin. Biosintesis kreatin sendiri juga berasal dari glisin, arginin, danmetionin.
Pemindahan gugus guanidino dari arginin kepada glisin, yang membentuk senyawa guanidoasetat (glikosiamina), berlangsung di dalam ginjal dan tidak terjadi di hati atau otot jantung. Sintesis kreatin diselesaikan lewat reaksi metilasi guanidoasetat oleh senyawa
S-adenosilmetionin di hati.
B. Cara Kerja
Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan mencit sebagai hewan uji. Mencit tersebut diambil sampel darahnya. Pengambilan sampel darah pada mencit dilakukan dengan cara menyayat ekor mencit (pada bagian yang terlihat pembuluh darah). Jika dari ekor sulit didapatkan, sampel darah dapat diambil melalui mata mencit menggunakan pipa kapiler.
Sampel darah yang didapat kemudian dimasukkan ke dalam efendorf yang sebelumnya telah ditetesi dengan 1 mg EDTA. EDTA digunakan sebagai antikoagulan agar sampel darah tidak membeku agar darah mudah untuk disentrifugasi. Kemudian sampel darah disentrifugasi selama 10 menit. Sentrifugasi dilakukan untuk mengendapkan protein dalam darah agar didapat plasma darah yang akan digunakan pada pengukuran kadar kreatinin.
Plasma darah yang digunakan untuk pengukuran kadar kreatinin yaitu sebanyak 100 µ l. Kemudian ditambah dengan 2000 µl reagen 1 (sodium hidroksida) dan didiamkan selama 5 menit. Penambahan sodium hidroksida digunakan sebagai buffer untuk menciptakan pH alkali atau basa. Pendiaman selama 5 menit dimaksudkan agar proses reaksi pengalkalian berjalan sempurna. Kemudian ditambah dengan 500 µ l reagen 2 (asam pikrat) dan didiamkan selama 1 menit. Pendiaman dimaksudkan agar reaksi berjalan sempurna sehingga terbentuk kompleks berwarna oranye kemerahan antara kreatinin dengan larutan alkali pikrat. Reaksi yang terjadi antara kreatinin dalam suasana alkali dengan asam pikrat adalah :
(Nanda, dkk, 2010).
Setelah itu dilakukan pengukuran absorbansi menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 492 nm. Kemudian didiamkan lagi selama 120 detik dan diukur kembali
absorbansinya menggunakan spektrofotometer. Metode yang digunakan ini adalah metode Jaffe. Reaksi Jaffe merupakan reaksi secara kolorimetri yang sederhana dan mudah. Metode ini didasarkan pada pembentukan senyawa berwarna merah – oranye yang terjadi antara asam pikrat dengan kreatinin dalam suasana basa (Siangproh et al., 2009).
Standar dan blanko. Masing-masing sebanyak 100 µl ditambah dengan 2000 µl reagen 1 (sodium hidroksida) dan didiamkan selama 5 menit. Penambahan sodium hidroksida digunakan sebagai buffer untuk menciptakan pH alkali atau basa. Pendiaman selama 5 menit dimaksudkan agar proses reaksi pengalkalian berjalan sempurna. K emudian ditambah dengan 500 µl reagen 2 (asam pikrat) dan didiamkan selama 1 menit. Pendiaman dimaksudkan agar reaksi berjalan sempurna sehingga terbentuk kompleks berwarna oranye kemerahan antara kreatinin dengan larutan alkali pikrat. Setelah itu dilakukan pengukuran absorbansi menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 492 nm. Kemudian didiamkan lagi selama 120 detik dan diukur kembali absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 492 nm. Kadar kreatinin yang didapat adalah sebesar 0,76
0,89 mg/mL. Malole dan Pramono (1989), menyatakan bahwa kadar normal kreatinin plasma darah pada tikus adalah 0,2-0,8 mg/dL. Sehingga kadar kreatinin tikus percobaan masih dalam rentang normal.VI. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan beberapa hal, yaitu:
1. Metode Jaffe tanpa deproteinisasi dapat digunakan untuk mengukur kadar kreatinin dalam plasma darah.
2. Prinsip dasar dari reaksi Jaffe adalah reaksi antara kreatinin dengan pikrat dalam suasana alkali tanpa deproteinasi, membentuk kompleks kreatinin pikrat berwarna jingga dan diukur menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 492 nm.
3. Kadar kreatinin yang didapat adalah sebesar 0,76
0,89 mg/mL, kadar ini masih dalam rentang normal.DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 1995. Farmakope Indonesia Ed. IV . Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Baradero, Mary, et al. 2005. Klien Gangguan Ginjal. Jakarta : EGC. Khopkar, S. M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press.
Malole, M.B.M., dan Pramono, C.S.U. 1989. Pengantar Hewan-hewan Percobaan di Laboratorium. Bogor: Pusat Antara Universitas Bioteknologi IPB.
Nanda, dkk. 2010. Laporan Resmi Praktikum Analisis Klinik Penetapan Kadar Kreatinin. http://analisisklinikfarmasiugm.files.wordpress.com/2010/03/anklin-laporan-p1-gol-1-2-maret-2010.pdf. diakses tanggal 10 Juni 2012
Riswanto. 2010. Kreatinin dara (Serum).http://labkesehatan.blogspot.com/2010/03/kreatinin-darah-serum.html. diakses tanggal 10 Juni 2012
Siangproh,W., N. Teshima, T. Sakai, S. Katoh, O. Chailapakul, 2009, Alternative Method for Measurement of Albumin/Creatinine Ratio Using Spectrophotometric Sequential Injection Analysis,Talanta, 79:1111-1117
