أ
ب
تنواعم یشهوژپ
و يروانف
شرازگ ییاهن
حرط یتاقیقحت
رد نارفعز هللاک زارفسنارت لیزوکیلگ میزنآ هدننک دک ینژ یاهرموزیا گولورته نایب ناکما هعلاطم یرتکاب
حرط يرجم دازآروپ نیسح نیدلارون
،هورگ هدکشناد
يزرواشک هدکشناد ،ییوراد ناهایگ و یهایگ مولع نیگشم
رهش
نیا حرط اب بیوصت و
تیامح یلام
هزوح تنواعم یشهوژپ
هاگشناد ققحم
یلیبدرا ارجا
هدیدرگ .تسا
هامرذآ 1397
ت
هحفص ناونع ..هدیکچ ...
...
8.
و همدقم :لوا لصف ...فده
9..
-1 ...همدقم ...
...
...
10
1-1 - تایلک ...
...
10
ث
1-1-1 -
یسانشهایگ ...
...
...
10
1-1-2 -
تیلوباتم ياه
نارفعز ...
...
...
..
...
10
1-1-3 -
مز هنی
یتاقیقحت ياه
نارفعز ...
..
...
...
...
11
1-1-4 -
زتنس رد یطیحم لماوع رثا
تیلوباتم ياه
...هیوناث ...
11
1-1-5 -
ياهتیلوباتم نویسلایزوکیلگ
هیوناث ...
..
...
. ...
11
1-1-5-1 -
لیزوکیلگ میزنآ ياهمرفوزیا
...زارفسنارت 12
1-1-6 -
هللاک یتیلوباتم تایوتحم
...نارفعز 13
1-1-6-1 -
و نیسورک ياهرموزیا
...نیتسورک 13
ج
1-1-7 -
لیزوکیلگ میزنآ هدننک دک ینژ ياهمرفوزیا
...زارفسنارت 13
1-1-8 -
...فادها ...
14
...اهشور و داوم :مود لصف ...
...
15
-2
و داوم
...اهشور ....
...
16
2-1 - هنومن
ياه
یهایگ ...
..
...
16
2-2 -
نژ يزاس هلوزیا
CsUGT ...
...
...
16
2-2-1 -
جارختسا
و لک RNA
mRNA
...
...
...
..
...
16
2-2-2 -
هتشر تخاس
...cDNA 16
2-2-3 -
...اهرگزاغآ یحارط ...
...
16
ح
2-2-4 -
هریجنز شنکاو طیارش ...زارمیلپ يا
...
17
2-2-4-1 -
لوصحم يزاس صلاخ و یبایزرا
PCR
...
17
2-2-4-2 -
...ییایرتکاب لولس یگتخیرارت شنکاو 18
2-2-4-3 -
...تخیرارت ياهیرتکاب باختنا 18
2-2-4-4 -
...تخیرارت ياهیرتکاب عیام تشک ...
...
...
18
2-2-4-5 -
یلاوت ینژ هعطق یبای ...UGT
18
2-2-4-6 -
ریثکت ياهیلاوت زیلانآ
...هدش ...
19
2-2-5 -
ینژ هعطق گنینولک باس
UGT
...
19
2-2-5-1 -
يرتکاب یگتخیرارت
BL21pGro7 ...
...
20
2-2-5-1-1 -
هتخیرارت ياهیرتکاب عیام تشک
BL21pGro7 ...
20
2-2-5-1-2 -
نیئتورپ جارختسا
ياه
...لولحم 21....
خ
...ثحب و جیاتن :موس لصف ...
22
-3 جیاتن ثحب و ...
...
...
...
...
...
23
3-1 - بیکرتون دیمسلاپ یلاوت pBlue script- UGT
...
23
3-1-1 -
گیتناک باختنا
ياه
...بسانم ...
...
...
...
23
3-1-2 -
زیلانآ ....یکیتنژ ياههاگیاپ رد هلصاح ياهیلاوت ...
...
...
24
3-1-3 -
ینژ یلاوت گنینولک باس زا لصاح جیاتن ...UGT
...
...
...
...
...
25
3-1-4 -
ینژ ياهیلاوت هزادنا
هلصاح ...
...
...
26
3-1-5 -
ياه هبعج لحم ...PSPG
...
...
...
...
26
3-1-6 -
یلوکلوم ياهنورپاچ ...
...
...
...
...
27
3-2 - ثحب ...
...
...
...
28
3-2-1 -
اب طبترم ياهیلاوت رد یگدرتسگ ...UGT
...
...
28
3-2-2 -
میزنآ فلتخم ياهدرکلمع ...UGT
29
:مراهچ لصف هدافتسا دروم عبانم
...
...
...
..
...
...
32
ف یسیلگنا هدیکچ :مجنپ لص ...
...
...
37
د
هدیکچ حرط
مرفوزیا دوجو تیلوباتم زا فلتخم یاهرموزیا داجیا هب رجنم ناهایگ رد فلتخم ینژ یاه
هب اه
تیلوباتم دننام یم هدش هلیزوکیلگ یاه
مرفوزیا گولورته نایب و ییاسانش هب رضاح قیقحت رد .دندرگ
هللاک زارفسنارت لیزوکیلگ میزنآ هدننکدک ینژ .دش هتخادرپ یناشفا هدرگ هلحرم رد نارفعز هایگ
9
یلاوت زا لصاح جیاتن زیلانآ و یبای
اب نارفعز هایگ مونژ زا هدش ادج ینژ یلاوت یکیتامروفناویب یاه
لیزوگیلگ ینیئتورپ هداوناخ هب قلعتم ینژ یلاوت نیا هک داد ناشن درگزره یاهرگزاغآ زا هدافتسا پآ تروصب هک هدوب اهزارفسنارت و
یم حشرت لولس رد یتسلاپ ادتبا ،یمیزنآ درکلمع یسررب تهج .ددرگ
کینکت اب هدش هلوزیا ینژ لماک یلاوت Gibson Assembly
ینایب روتکو رد pThio-UGT
تحت
باس ،زونیبارآ ییاقلا رتومورپ ییایرتکاب هیوس رد نویساروپورتکلا شور اب و هدش نولک
BL21-pGro
نیئتورپ هدننک نایب هک اه
یاهدحاوریز اب ینورپاچ ی و EL
نیئتورپ .دیدرگ تخیررارت دوب ES یاه
رد یرتکاب بوسر یزاس نویسناپسوس و توصارف شور اب یرتکاب هراوید بیرخت لابند هب ینایب لولحم نیئتورپ یزاسادج ًاتیاهن .دش جارختسا ندیناشوج شور هب ،PBS
یراذگراب اب بیکرتون یاه
لژ یور
%10 SDS-PAGE ییات
هدننک د زارفسنارت لیزوکیلگ میزنآ ینژ مرفوزیا گولورته نایب
دوب یم هژورپ نیا زا لصاح جیاتن . یژتارتسا نییعت رد دناوت
یفیک تافص دوبهب یارب یداژن حلاصا یاه
هب نارفعز هایگ رد رطع و گنر دننام یمک و .دنوش هتفرگ راک
تاملک ای
هژاو ياه يدیلک : یرتکاب ،نیسورک ،زارفسنارت لیزوکیلگ ،بیکرتون نایب
10
لصف لوا
: همدقم و
فده
-1 همدقم
1-1 - تایلک نارفعز تارداص و نارفعز یناهج دیلوت زا ناریا مهس .تسا ناریا یدربهار تلاوصحم زا یکی 1
ًابیرقت نآ دودح نارفعز .تسا دصرد 93.7
تارداص زا دصرد 13.5 یم لیکشت ار ناریا یتفنریغ
1Crocus sativus
11
،نارفعز دیلوت یارب زاین دروم راک یورین .دهد هک دنچره .تسا زور رد راتکه ره یازا هب رفن 200
تسا رتشیب رایسب یبایرازاب و یروارف شخب رد مقر نیا .
-1 -1 -1 یسانشهایگ عافترا اب هقاس نودب ،ایاپ یهایگ نارفعز -10
پ یاه هدغ یاراد و رتم یتناس20 رپوت دننام زای
هنب زا یرتخد یاه هنب قیرط زا ،یمیقع و ندوب دیئولپیرت تلع هب نارفعز ریثکت .تسا هنب مان هب م ماجنا یردام یاه دریگ ی
.
1-1-2 -
تیلوباتم نارفعز ياه
ک هللا انارفاس و نیسورکورکیپ ،نیسورک ندوب اراد تلع هب هایگ نیا ل
،ییوراد عیانص رد ،
غت ذ هی یشیارآ و یا دراد یدایز نارادفرط
. هایگ نیا شزرا اب هلمج زا
ناهج رد فورعم تلاوصحم نیرت
هدنیازفا و وراد ،هیودا ناونع هب نآ هللاک زا هک هدوب یم هدافتسا ییاذغ یاه
نارفعز هللاک تیفیک .دوش
یگژیو .دراد یگتسب اهدیئونلاف و نیسورک نوچ مه ییاهدیئونتوراکوپآ نتشاد هب یتنآ یاه
سکا ینادی
تیلوباتم نیا نآ خلت هزم اب هارمه اه
راذگ ریثأت هیودا یسح لماوع تیفیک رد اه یم
( دنشاب Hansen
et al., 2003 .)
-1 -1 -3 هنیمز نارفعز یتاقیقحت ياه
12
داوم یزتنسویب یاهریسم یور رب یکدنا تاقیقحت ،نارفعز لگ رد هرثوم داوم دوجو مغریلع
هدوب فوطعم هایگ نیا رد هرثوم ماجنا هایگ نیا رد یعارز هب هنیمز رد افرص تاقیقحت رتشیب و تسا
.تسا هتفریذپ -1 -1 -4 تیلوباتم زتنس رد یطیحم لماوع رثا هیوناث ياه
اب لباقتم تارثا هجیتن رد نینچ مه و نآ اب لماعت و یطیحم لماوع هب شنکاو رد ناهایگ
مزیناگرا رگید ناونع تحت ار تابیکرت زا عون نارازه اه
تیلوباتم یم دیلوت هیوناث یاه
.دنیامن
-1 -1 -5 تیلوباتم نویسلایزوکیلگ هیوناث ياه
تیلوباتم عونت و یگدرتسگ نآ یلصا تلکسا رد هیوناث تارییغت لیلد هب هیوناث یاه
یم اه دشاب
تارییغت نیا زا یکی هک یم نویسلایزوکیلگ هیوناث
ای کی لاصتا لماش نویسلایزوکیلگ لمع .دشاب
دنچ نوکیلگ هب لاعف یاهدنق زا دحاو هدننک نیمأت( اه
)هنیمآ یاهدیسا و تاردیهوبرک تاقتشم یاه
یم یدیزوکیلگ یاهدناب مرف هب شنکاو نیا زیلاتاک هک دشاب
میزنآ هدهع رب اه زارفسنارت لیزوکیلگ یاه
UGT( یم ) دشاب میزنآ نیا هدمع شقن اه
و یکیلوباتم یزاتسومه میظنت و هعسوت رد یا دنیارف
مس ( دنراد یلولس ییادز Kumar et al., 2012
.)
-1 -1 -5 -1 مرفوزیا زارفسنارت لیزوکیلگ میزنآ ياه
مرفوزیا یاراد زارفسنارت لیزوکیلگ میزنآ ( نارفعز هایگ رد یفلتخم یاه
Crocus sativus )
لولس هتسه و مسلاپوتیس میزنآ نیا رثا لحم هک هدوب یم یگدام و هللاک یاه
.دشاب نیا نایب زیلانآ
13
یم ناشن نژ هخسن هک دنهد
هنوگ یمامت هللاک رد ًابیرقت زارفسنارت لیزوکیلگ ینژ یاه نارفعز یاه
یم هتفای میزنآ نیا شقن نیرتمهم زا و دوش
لولحم و تیبطق شیازفا هدننک هلیزوکیلگ یاه یریذپ
تیلوباتم یم لولس رد اه
( دشاب Lunken et al., 2006 .)
قیرط زا نویسلایزوکیلگ -UDP
لیزوکیلگ میزنآ هب هتسباو تاردیهوبرک یم لصاح زارفسنارت
ددرگ
لوکلوم هب فلتخم یدنق عبانم زا تاردیهوبرک لاقتنا زیلاتاک ثعاب میزنآ نیا نینچمه کچوک یاه
مرف داجیا و هدنریگ یم کیدیزوکیلگ یدناب یاه
ددرگ ( Gosch. et al., 2010; Li et al.,
.)2010
-1 -1 -6 نارفعز هللاک یتیلوباتم تایوتحم هللاک رد نیتسورک خلت هدام هدش هلیزوکلگ مرف )نیسورک( نارفعز گنر نارفعز هایگ یاه
یم .دشاب
-1 -1 -6 -1 نیتسورک و نیسورک ياهرموزیا و نیسورک یاهرموزیا ییاسانش و یزاسادج هب ناراکمه و دازآروپ نیسح یقیقحت رد
رد نیتسورک یفارگوتامورک هاگتسد اب یناشفا هدرگ هلحرم رد نارفعز هللاک یمرفرلک و یلوناتم هراصع
یجنس فیط هب زهجم عیام یمرج
(LC-APCI-MS) دادعت و هتخادرپ
ناونع هب ار بیکرت 7
14
.دندومن ییاسانش نیسورک سنارت و سیس یاهرموزیا مرف
نیسورک هدش ییاسانش فلتخم یاه هک اه
ابیکرت هلمج زا تیلوباتم هورگ یبطق مهم ت
یم نارفعز هللاک رد یدیئونتوراک یاه مرف هب دنشاب
نیتسورک یاهرتسا -
ید لیزوناریپوکولگ ید اتب( زویبویتنج و )لیزوناریپوکولگ ید اتب( زکولگ
دندیدرگ ییاسانش )زکولگ (Hosseinpour Azad et al., 2017)
.
-1 -1 -7 مرفوزیا میزنآ هدننکدک ینژ ياه
زارفسنارت لیزوکلگ
مرفوزیا زا یکی گولورته نایب یسررب هب ناراکمه و ساترومد یرگید قیقحت رد ینژ یاه
( نارفعز هللاک زارفسنارت لیزوکلگ میزنآ هدننکدک CsUGT74AD1
هیوس رد ) یرتکاب فلتخم یاه
نژ زا یهورگ یراشبآ نایب و هتخادرپ یلکایشرشا فعز گنر یزتنسویب ریسم رد لیخد یاه
نار
دندناسر تابثا هب ار نیسورک زتنس ات نتوراکاتب هدام شیپ یمیزنآ تسکش لحم زا ار )نیسورک(
( De Murtas et al., 2018 .)
-1 -1 -8 فادها شقن هب هجوت اب رضاح قیقحت رد ( زارفسنارت لیزوکیلگ میزنآ یساسا یاه
رد )UGT
تیلوباتم یزتنسویب یاهریسم اسمه و ییاسانش هب ،یهایگ یاه
هن یلاوت یزاس میزنآ نیا هدننکدک ینژ
هدرگ نامز رد هتخادرپ یلکایشرشا یرتکاب رد ینژ یلاوت نیا گولورته نایب و نارفعز هللاک یناشفا
هدش .تسا
15
اهشور و داوم :مود لصف
16
-2 اهشور و داوم
-2 -1 هنومن یهایگ ياه
هللاک هدرگ هلحرم رد نارفعز هدش کشخ یاه عمج یناشفا
یامد رد و هدیدرگ یروآ Cº
-80
.دندیدرگ یرادهگن شیامزآ نامز ات -2 -2 يزاس هلوزیا CsUGT نژ
-2 -2 -1 جارختسا و لکRNA
mRNA
نژ یزاسادج و ییاسانش تهج CsUGT
هللاک رد هدش نایب نارفعز هایگ یاه
لک RNA
mRNA و تیک زا هدافتسا اب
Neb magnetic RNA isolation kit تکرش لکتورپ قبط
.دیدرگ جارختسا هدنزاس -2 -2 -2 هتشر تخاس cDNA
17
لوا هتشر تخاس هخسن میزنآ زا هدافتسا اب cDNA
هب اب سوکعم رادرب ادقم یریگراک
2 ر
ورکیم زا مرگ یاهرگزاغآ و هدش جارختسا RNA
وگیلا یدیتوئلکون 18 هدافتسا اب dt
تیک زا
( Qiagen .دیدرگ زتنس لکتورپ قبط )
2-2-3 -
اهرگزاغآ یحارط یاهرگزاغآ یحارط تهج هدش تظافح یصاصتخا یحاون هیاپ رب یژولومه یژتارتسا زا
هلوزیا و بسانم زارفسنارت لیزوکیلگ میزنآ هدننکدک نژ یزاس
UGT( هللاک رد ) هدافتسا نارفعز یاه
دیدرگ ( Woo et al., 2007 سپس .)
هیحان ریثکت تهج وگلا ناونع هب هدش زتنس یاه cDNA
هدننک دک ینژ درگزره یاهرمیارپ یریگراکب اب UGT
هب هدش تظافح ینژ یحاون زا هدش یحارط 2
.تفرگ رارق هدافتسا دروم تشگرب و تفر رگزاغآ ناونع 2-2-4 -
طیارش هریجنز شنکاو
زارمیلپ يا
شنکاو مجح ردPCR
زا هدافتسا اب رتیلورکیم20 /5
میزنآ زا دحاو0 ( زارمیلپQ5
،)NEB
،رگزاغآ ره زا لوموکیپ1 /2
یلیم0 رلاوم dNTPs 4 ،
رفاب رتیلورکیم نینچمه و5SQ5
مرگونان50
هتشر زا شنکاو .تفریذپ ماجنا وگلا ناونع هب نارفعز هللاک زا لصاح cDNA
رد PCR هخرچ20
دش ماجنا ییامد تشرساو هلحرم کی لماش هخرچ ره رد زاین دروم نامز و ییامد طیارش هک
یزاس
یامد رد
°c تدم هب 98 یامد رد وگلا هتشر هب رگزاغآ لاصتا ،هیناث 10
°c تدم هب56 و هیناث 30
یلاوت ریثکت یامد رد فده دروم ینژ
° c تدم هب 72 تشرساو هلحرم نینچمه .دوب هقیقد1
یزاس
Degenerate Primer2
18
مد رد هیلوا c یا
98° تدم هب یامد رد ییاهن ریثکت هلحرم نایاپ رد و هیناث 30
°c تدم هب 72 7
.دش ماجنا هقیقد -2 -2 -4 -1 خ و یبایزرا يزاس صلا
لوصحم PCR
لوصحم یبایزرا سپس زراگآ لژ یور رب زروفورتکلا اب هلصاح PCR
و هتفرگ تروص %1
لوصحم یزاس صلاخ ( نیزر یواح نوتس یریگراکب اب PCR
Seohadex G50 صولخ و ماجنا )
لاصتا شنکاو رد هدافتسا تهج پاردونان شور اب هدیدرگ صلاخ لوصحم رادقم و .دیدرگ نییعت3
-2 -2 -4 -2 ییایرتکاب لولس یگتخیرارت شنکاو
لوط هب هدش ادج ینژ هعطق 1368bp
دیمسلاپ رد pBlue script
هزادنا اب 3000bp
هب
هناسمه لقان ناونع شنکاو یط یزاس
میزنآ اب لاصتا ( زاگیلT4
Fermentas هتفرگ رارق )
لوصحم و
یرتکاب هب نویساروپورتکلا شور اب لاصتا شنکاو دعتسم یاه
.دش هداد لاقتنا DH5α
-2 -2 -4 -3 ا يرتکاب باختن تخیرارت ياه
یرتکاب باختنا تهج شنکاو ،تخیرارت یاه
Colony PCR ینلک زا
رب هتفای دشر یاه
یباختنا تشک طیحم یور ( نیلیس یپمآ کیتویب یتنآ یواح LB
یلیم رب مرگورکیم 50 )رتیل
،
(IPTG 100mM
و ) X-gal 2 (
% .دش ماجنا (
-2 -2 -4 -4 اب عیام تشک تخیرارت ياهیرتک
3Ligation
19
دادعت طیحم رد رظن دروم نژ یواح بیکرتون ینلک15
یواح هک عیام LB مرگورکیم 100
یلیم رد یل
یتنآ زا رت یپمآ کیتویب
جارختسا ،هنابش تشک زا سپ و هدیدرگ حیقلت دوب نیلیس
بیکرتون یاهدیمسلاپ pBlue-UGT
جارختسا تیک طسوت Miniprep
تفرگ ماجنا )نژایک(
.
-2 -2 -4 -5 یلاوت ینژ هعطق یبای UGT
صلاخ لابند هب ( نیزر یواح نوتس اب هدش جارختسا یاهدیمسلاپ یزاس
Sephadex
یلاوت ،)G50 ینژ هعطق یبای
ینژ یلخاد تمسق زا هدش یحارط یاهرگزاغآ زا هدافتسا اب UGT
یلاوت و رظن دروم دیمسلاپ زا نژ اب رواجم یبناج یاه
pBluescript یلاوت هاگتسد زا هدافتسا اب ،
یبای Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer )رگناس( ریجنز یهد نایاپ شور هب
و هدیدرگ ماجنا گیتناک نییعت زا سپ
یلاوت زا لصاح یاه یکیتنژ رازفا مرن اب یبای
3 Aligner ver.
CodonCode تیاس رد ،
تاعطق داد ناشن هلصاح جیاتن هک تفریذپ تروص نژ تسلاب NCBI
یلاوت اب هتفای ریثکت .دنراد یژولومه زارفسنارت لیزوکیلگ میزنآ اب طبترم ینژ
-2 -2 -4 -6 یلاوت زیلانآ اه
ي هدش ریثکت
یلاوت زا رتلااب هباشت اب یاه هنوزفا زا هدافتسا اب و باختنا هتفای ریثکت ینژ یلاوت اب %70
Clustal W رازفا مرن رد
Bioedit ver 7.09 مه
هلصاف هسیاقم و هدش ماجنا هناگدنچ یفیدر
هداد یلوکلوم مرن زا هدافتسا اب اه
رازفا MEGA6 لیلحت و
م اب ،کیتنژولیف یاه تخرد هبساح
یاه
( نیرتربنایم یلوکلوم Maximum Parsimony, MP
) نژ یلاوت یارب و ،ماجنا هعلاطم دروم یاه
هرگ تحص نازیم نومزآ یارب پرتسا توب صخاش زا اه
لیلحت تهج 1000 هجوت اب .دش هدافتسا اه
20
ژ زا یلماک هعطق یواح هک ینلک هس دادعت ًاتیاهن ،یلاوت تسلاب زا لصاح جیاتن هب لیزوکیلگ ن
یرتکاب رد نایب یسررب تهج دوب زارفسنارت BL21-pGro7
.دندیدرگ باختنا
-2 -2 -5 ینژ هعطق گنینولک باس UGT
ینژ هعطق گنینولک باس لمع دیمسلاپ زا UGT
pBlue script ینایب دیمسلاپ هب
pThio-Dan یتنآ هب تمواقم ینژ یلاوت یاراد دوخ هک
( نیسیامونیتکپسا کیتویب اب دوب )Spec
کینکت زا هدافتسا Gibson Assembly
هناسمه دنیارف کینکت نیا دش ماجنا زاین نودب ار یزاس
میزنآ هب یم ریذپناکما یشرب یاه
( دزاس Gibson et al., 2010 ینژ هعطق قاحلا زا سپ .)
UGT
دیمزلاپ رد pThio-Dan
هلصاح ینژ هزاس pThio-UGT
لاقتنا یلاوت تحص زا نانیمطا تهج
ی شهج دوجو مدع رظن زا هتفا هطقن یاه
شخب رد یا ،یروتومورپ یحاون هلمج زا نژ فلتخم یاه
یلاوت لماک روطب دندیدرگ یبای
.
-2 -2 -5 -1 یگتخیرارت يرتکاب
BL21 pGro7
ینلک زا یکی بیکرتون دیمسلاپ هب طوبرم یاه
pThio-UGT زا یلماک یلاوت یاراد هک
ینژ هعطق یرتکاب رد گولورته نایب یبایزرا تهج نویساروپورتکلا شور زا هدافتسا اب دوب UGT
BL21 pGro7 یتنآ هب تمواقم ینژ یلاوت یاراد مه هک
( لکینفمآورلک کیتویب تیلباق مه و )Cm
نیئتورپ نایب .دیدرگ تخیرارت تشاد ار ینورپاش یاه
-2 -2 -5 -1 -1 هتخیرارت ياهیرتکاب عیام تشک BL21 pGro7
21
ینلک عیام تشک طیحم رد هلصاح یاه LB(
مجح هب ) یلیم50
کیتویب یتنآ یواح هک رتیل -
( لکینفمارلک یاه ug/ml
( نیسیامونیتکپسا و )20 ug/ml
( )100 LB-Cm-Spec یامد رد دوب )
یتناس هجرد36 تدم هب دارگ
هب ندیسر ات تعاس 16 6 OD
0/ 7- 0/ .دندش هداد دشر
-2 -2 -5 -1 -2 جارختسا نیئتورپ
لولحم ياه
لولس رود رد ژویفیرتناس اب هلصاح یاه 10000
هب 10 تدم و هدیدرگ یروآ عمج هقیقد
هنومن لولحم اب هدش هداد بوسر یاه هب PBS
جارختسا روظنم هب و هدمآ رد نویسناپسوس تروص
نیئتورپ لولس هراوید ،لولحم یاه
هاگتسد زا هدافتسا اب یرتکاب یاه کینوسارتلوا
(Hielscher,
UP50H) ژویفیرتناس .دش بیرخت
هنومن تدم هب اه رد هقیقد 10
12000 رود
یامد و هجرد 4
یتناس تروص دارگ تفریذپ
نیئتورپ یزاسادج تهج نآ ییور زاف و یور رب هدش نایب یاه
لژ SDS-
10 PAGE .دندیدرگ زروفورتکلا و هدش یراذگراب %
22
یسیلگنا هدیکچ :مجنپ لصف
23
Studing on the possibility of Saffron stigma associated Glycosyl teransferase enzyme coding Genes isomers heterologous expression in bacteria
Noraddin Hosseinpour Azad
Abstract: The existence of isoform genes in plants led to the creation of the different types of isomeric metabolites like these glycosylated forms.
This study was conducted to investigate the identification and heterologous expression of Saffron stigmas Glycosyl transferase coding isoform gene during the pollination stage. The results have been obtained by sequencing and bioinformatics analysis of an isolated gene from saffron genomes by degenerate oligo’s revealed that the gene is in1283 bp length and belongs to CsUGT protein family which has Apo- plastic secretion in the cell. to evaluate the enzymatic function, firstly the isolated sequence was sub-cloned under arabinose induce promoter in pThio-UGT expression vector by Gibson assembly technique, then the recombinant vector transformed into BL21-pGro7 bacteria which were able to express chaperon proteins with EL& ES subunits. Followed by destructing the bacteria cell wall via ultrasound, the pellet was suspended by PBS solution and then the soluble proteins were extracted by boiling method.
Finally, the protein electrophoresis by SDS pages10% was showed that the recombinant protein of CsUGT expressed correctly in bacteria with 69/5 kDa molecular weight. The gained results in this project could be
24
applied to determine the breeding's strategies to improve qualitative and quantitative traits such as color and aroma in saffron.
Key words: Recombinant expression, Glycosyl transferase, Crocin, E. coli
25
University of Mohaghegh Ardabili Final Report of Research Project
Title
Studing on the possibility of Saffron stigma associated Glycosyl teransferase enzyme coding Genes isomers heterologous expression in
bacteria By
Noraddin Hosseinpour Azad Department of
Plant Sciences and Medicinal plants Meshkin Shahr Faculty of Agriculture
This Research Project Has Been Financially Supported by the Office of Vice Chancellor for Researc
Date: December 2018
