好気性有胞子細菌の分類とその遺伝情報を用いた 同定方法の開発

はじめに

 好気的もしくは通性嫌気的に生育し，胞子という休 眠細胞を栄養細胞の中に形成する細菌（以下好気性有 胞子細菌）は古くから人とのかかわりが深く，納豆 などの発酵食品や有用物質の生産などに有効利用され る半面，人の疾病や食品などの腐敗・劣化に関与す る．いずれの場合でも，その現象に結びつく菌種を同 定，あるいは分類することは学術的にも産業的にも重 要なことであるが，1990 年以降，好気性有胞子細菌 も他の細菌群と同じく，飛躍的に属や種の数が増加し たことにより，形態や生理・生化学的性状による同定

が困難となった．近年，分子生物学の進歩に伴い，特 定の菌種を同定するための簡易法が提供されるように なったが，依然として数多くの菌種に対応した簡易な 同定法は報告されていなかった．このような背景のも と，分類指標の一つであり，様々な長所を備えた 16S  rRNA 遺伝子（以下 16S rDNA）の塩基配列に着目し，

正確で迅速な好気性有胞子細菌の同定法の開発を試み た．

 本総説では，好気性有胞子細菌の分類体系を概説し た後，1997 年より開発を行った 16S rDNA 塩基配列 に基づく好気性有胞子細菌の同定法について

属および 属の事例をもとに紹介する．

あわせて，その手法の応用例と今後の課題について

好気性有胞子細菌の分類とその遺伝情報を用いた 同定方法の開発

（平成 18 年度日本微生物資源学会奨励賞受賞）

後藤慶一

三井農林株式会社 食品総合研究所

〒426‑0133 静岡県藤枝市宮原 223‑1

Classification of aerobic endospore-forming bacteria and development of an  identification method based on DNA sequences

Keiichi Goto

Mitsui Norin Co., Ltd., Food Research Laboratories  223-1 Miyahara, Fujieda, Shizuoka 426-0133, Japan

 Recent large-scale food poisoning related incidents have raised consumer awareness and demand for greater food safe- ty. Food companies have introduced various monitoring and methods of control, and continuous action is being taken to  ensure the safety of food. Against this background, test methods for detection and discrimination of microbes have pro- gressed; however, there has long been a need for a rapid and accurate method to identify various microbes. Thus, since  1997, my colleagues and I have been in the process of developing an identification method for aerobic endospore-forming  bacteria, which is more rapid, accurate, unified, and time-efficient than previous methods.

 For a number of years, contamination and spoilage by aerobic endospore-forming bacteria has been a serious quality  issue in the food industry. However, the taxonomy of the bacteria is very complex, there are many genera and species,  and it is difficult to find differential characteristics among the bacteria for accurate identification. Accordingly, we evalu- ated and developed an identification method based on the 16S rDNA sequence using many strains.

 A description is presented here of the taxonomic transition of the bacteria and some examples of the development of  this identification method.

受 賞 総 説

E-mail: kgoto@mnk.co.jp

属に的を絞って説明する．なお，今 でこそ 16S rDNA の塩基配列に基づく菌種の同定は 一般的な技術であるが，本開発は，16S rDNA 塩基配 列（あるいはその部分配列）が菌種の同定に有効であ るか否かの検証を数多くの菌種・菌株を用いて行った ものである．

好気性有胞子細菌の分類体系

 好気性有胞子細菌は， 門， 綱の

目に分布しており， 属（短桿菌）

や 属（球菌）などの胞子を形成しな

いグラム陽性細菌と同じ系統群に属する（図 1）．表 現形質として，好気性もしくは通性嫌気性で，胞子を 形成する点で共通しているが，それ以外の形質は様々 である．

 1990 年以前，好気性有胞子細菌に相当する細菌と して，Bergeyʼs Manual of Systematic Bacteriology  Volume 2（1986）および Approved Lists of Bacterial  Names（1989）に， 属（34 種），

属（1 種）および 属（1 種）の

3 属 36 種が紹介されていた．1992 年には，新たに 34

種が 属（総計 68 種），1 種が 属

（総計 2 種）に追加され，数年のうちに菌種の数が約 2 倍となった．しかしながら，好気性もしくは通性嫌

気性で胞子を形成する条件を満たせば 属に

分類されたため，好熱性，好冷性，好アルカリ性，好

酸性，形態も様々な菌種が 属に分類されて

いた．また，これらの分類は主に形態や生理・生化 学的性状，菌体成分の違いに基づいて行われたため に，同定対象菌株の帰属が難しかった場合でも，往々 にして既知菌種に同定され，結果として，個々の菌種 が非常に多様な性状を有する菌株の集団となった（特 に や など）（Nakamura, 1993; 

Takagi  ., 1993; Shida  ., 1995）．ほぼ時を同じ

くして， 属が非常に不均質な集団であること

が GC 含量の分析結果および 16S rRNA の塩基配列に 基づく分子系統解析の結果により指摘された（Fox 

., 1977; Ash  ., 1991; Farrow  ., 1994）．この

ような背景のもと， 属は周辺の属を含めて分

子系統分類学的に再分類されることとなった．

 まず初めに， ，

および が 16S rDNA に基づく系

統樹でひとつの系統をなし，非常に特徴的なω-環 状脂肪酸を主要菌体脂肪酸成分として有することか

ら，これら 3 種が 属から分割され，新たに

属としてまとめられた（Wisotzkey 

., 1992）． 続 い て， ， ，

などの菌種が，16S rDNA に基づく解析結

果に基づき，新たに 属としてまとめら

れた（Ash  ., 1993; Shida  ., 1997）．そして最

も不均質な集団であった や の

分類学的な整理が行われ，新たに 属お

よび 属としてまとめられることと

なった（以前 や と同定されて

いた菌株の多くがこれらの属に移行した）（Shida  ., 1996; Heyndrickx  ., 1997）．その後も，好熱性 の菌種からなる 属（Nazina  ., 2001），

好・耐アルカリ性の菌種からなる 属

（Heyndrickx  ., 1998）などが次々に 属か ら分割された．このような再分類の結果，好気性有胞 子細菌は以前に比べて整理され，2006 年 8 月現在 40 属 342 種が本細菌として認められている．しかしなが ら，再分類の過程で対象に含められなかった菌種が系 統間に散在し，系統ごとに検討度合いが様々で，また 属の基準が各々で異なることなどから，好気性有胞子

図

1

 

 16S rDNA

塩基配列に基づく 門の分子

系統樹

（矢印は好気性有胞子細菌の分布位置を示

す．）

Thermotoga Thermodesulfobium

Halanaerobium Halobacteroides Thermoanaerobacterium

Syntrophomonas Peptococcus Acidaminococcus Heriobacterium

Lachnospira Eubacterium

Clostridium Peptostreptococcus

Anaeroplasma Acholeplasma Spiroplasma Entomoplasma Mycoplasma Alicyclobacillus Thermoactinomyces

Paenibacillus Sporolactobacillus Bacillus

Staphylococcus Listeria Planococcus Caryophanon

Tunicibacter Leuconostoc Lactobacillus Aerococcus

Streptococcus Carnobacterium Enterococcus

Bacilli Mollicutes Clostridia

Lactobacillales

Bacillales

Clostridiales

Halanaerobiales Mycoplasmatales

Anaeroplasmatales

Acholeplasmatales

Anaeroplasmatales

細菌の分類は依然として一部雑然としている感がある

（図 2）．すなわち，形態や生理・生化学的性状と分子 系統との間には関連があるものの，人為的な要因によ りまとまりに欠ける部分が見られ，今後，より高次の 分類群も視野に入れた検討が必要と考えられる．

属の 16S rDNA 高度可変領域（HV 領域）に 基づく同定法の開発

 すでに述べたとおり，表現形質に基づく好気性有胞 子細菌の同定は困難を伴う．そこで，近年，飛躍的 な進歩を遂げた分子生物学的手法，中でも DNA 塩基 配列解析を本細菌の同定に応用することを思案した．

DNA を用いる長所として，① DNA は 4 種類のオリ ゴヌクレオチドからなる物質である，②生物学的な誤 差が生じない，③客観的である，④再現性に優れてい る，⑤情報の共有が可能であることが挙げられる．ま た，対象とする遺伝子として，塩基配列データが蓄積 されている 16S rDNA に着目した．16S rDNA を用 いる長所として，① rRNA 遺伝子は必須遺伝子である，

②塩基配列中に保存されている領域が比較的多く，系 統間で比較することが可能である，③ 16S rDNA は 解析する上で適当なサイズである，④最も豊富にデー タベースに登録されていることが挙げられている．一 方で，16S rDNA 塩基配列は菌種間で極めて類似しす ぎており，種の同一性の指標には適さないとの報告が あった（Fox  ., 1992）．しかしながら，その知見 には未決定塩基や誤った配列が多く含まれる精度が低 い登録データも用いられ，また種内での塩基配列の保 存性も十分に検討されたものではなかった．以上を踏 まえ，精度の高い塩基配列データを用いることにより，

16S rDNA の同定指標としての再評価を 属

（71 種）に着目して行った（実験方法の詳細は Goto  ., 2000 を参照されたい）．その結果，全ての 16S  rDNA 塩基配列は各基準株に特有のものであり，その 比較によりこれらの菌株が区別できることが示された

（図 3A）．しかしながら，塩基配列が非常に類似した 場合もあり，その比較により区別を行うには精度の高 い塩基配列を用いなければならないこともわかった．

 一方，多くの種で 16S rDNA 塩基配列を比較した 結果から，多変位領域 V1 および V2 を含む 70 〜 300 付近の領域が（表 1，図 4），全ての基準株に共通した 最も変異に富んだ領域であることが明らかとなり（以 下この領域を HV 領域と称す），この領域だけでもそ れぞれの基準株を識別することができた（図 3B，ほと んどの菌株間の相同性は 90％以下）．そこで，種内の

HV 領域の塩基配列の保存性を調べたところ，各菌株 は基準株と 100％の相同性で一致した．従って，HV 領域の塩基配列は非常に種特異的であり，その配列の

比較により 属細菌を種レベルで同定，ある

いはグルーピングすることができることが示された．

属への 16S rDNA 高度可変領域（HV 領 域）に基づく同定法の応用

  属で検証した HV 領域による同定法を

属に応用するため，

（Basonym:  ）と名づけられた菌株を中

心に収集し，HV 領域の解析を試みた．その結果，

株のほとんどは 以外の菌種とクラス

図

2

 

 16S rDNA

塩基配列に基づく好気性有胞子細菌（抜 粋）の分子系統樹

（斜線で塗りつぶした系統は複数 の属から構成される系統を示す．）

Thermobacillus

Alicyclobacillus Thermoactinomyces

Sulfobacillus Paenibacillus

Paenibacillus Aneurinibacillus

Brevibacillus Ureibacillus Bacillus

Sporolactobacillus Bacillus

Amphibacillus, Bacillus Filobacillus, Gracilibacillus Parabacillus

Virgibacillus, Oceanobacillus Bacillus

Anoxybacillus Geobacillus Bacillus, Marinibacillus Jeotogalibacillus, Sporosarcina Bacillus

Bacillus

Thermobacillus

Alicyclobacillus Thermoactinomyces

Sulfobacillus Paenibacillus

Paenibacillus Aneurinibacillus

Brevibacillus Ureibacillus Bacillus

Sporolactobacillus Bacillus

Amphibacillus, Bacillus Filobacillus, Gracilibacillus Parabacillus

Virgibacillus, Oceanobacillus Bacillus

Anoxybacillus Geobacillus Bacillus, Marinibacillus Jeotogalibacillus, Sporosarcina Bacillus

Bacillus

図

3

 

16S rDNA

および

HV

領域の塩基配列に基づく分子系統樹

A：  16S  rDNA 塩基配列に基づく系統樹．系統樹は 1,057 塩基の比較に基づき，NJ 法により構築した．アウトグループとして   IFO  15652

T

を用いた． 枝上のローマ数字はブーツストラップ値を示す．括弧内にアクセッション番号を記した． B：  H V 領域に基づく系統樹．系統樹は 219 塩基の比較に基づき，N J 法により構築した．アウトグループとして  I F O  15652

T

を用いた．枝上のロー マ数字はブーツストラップ値を示す．括弧内に菌株番号を記した． C：  選 抜 し た 系 統 の H V 領 域 に 基 づ く 系 統 樹 ． ク ラ ス タ ー ， ク ラ ス タ ー ， ク ラ ス タ ー お よ び （ 現 ） ク ラ ス タ ー を 示 す ． デ ン ド ロ グ ラ ム は N J 法 に よ り 構 築 し た ． ア ウ ト グ ル ー プ と し て ， そ れ ぞ れ ， ， お よ び を用いた．枝上のローマ数字はブーツストラップ値を示す．括弧内の 数値（％）は基準株に対しての DNA 類似度を示す．矢 印はグルーピングに留まる菌株（ および ）を示す．

!LICYCLOBACILLUSACIDOCALDARIUS)&/4"SCHLEGELII!4##4"TUSCIAE)&/4"THERMOSPHAERICUS$3-4"THERMOGLUCOSIDASIUS!4##4"STEAROTHERMOPHILUS)&/4"KAUSTOPHILUS)!-4"THERMOLEOVORANS!4##4

"MARINUS!4##4"CLAUSII$3-4"INSOLITUS!4##4"PASTEURII.#)-"4"GLOBISPORUS*#-4"PSYCHROPHILUS)!-4"FUSIFORMIS$3-4"SPHAERICUS)&/4

"THERMOAMYLOVORANS#.#-)4"COAGULANS)!-4"BADIUS)!-4"CARBONIPHILUS*#-4"OLERONIUS$3-4"SPOROTHERMODURANS$3-4 "PSYCHROSACCHAROLYTICUS!4##4"FLEXUS)&/4"MEGATERIUM*#-4"SIMPLEX)&/4"LENTUS.#)-"4"SMITHII)&/4"DIPOSAURI$3-4"HALODENITRIFICANS!4##4"SALEXIGENS$3-4"HALOPHILUS$3-4"HORTI*#-4"CHITINOLYTICUS)&/4"EHIMENSIS)&/4"INFERNUS$3-4"METHANOLICUS!4##4"BENZOEVORANS$3-4"FIRMUS)!-4"NIACINI)&/4"CIRCULANS)&/4"PSEUDOFIRMUS$3-4"GIBSONII$3-4"FASTIDIOSUS$3-4"COHNII)&/4"HORIKOSHII$3-4"HALMAPALUS$3-4"HALODURANS!4##4"ALCALOPHILUS)!-4"PSEUDOALCALIPHILUS$3-4"AGARADHAERENS$3-4"VEDDERI$3-4"CLARKII$3-4"HALOALKALIPHILUS$3-4"NAGANOENSIS!4##4 "AZOTOFORMANS)&/4"THERMOCLOACAE$3-4"LAEVOLACTICUS)!-4"ANTHRACIS3TERNE8 "CEREUS*#-4"PSEUDOMYCOIDES.22,"4"THURINGIENSIS)!-4"MYCOIDES!4##4"WEIHENSTEPHANENSIS$3-4"PUMILUS)!-4"SUBTILIS)!-4 "LICHENIFORMIS)!-4"ATROPHAEUS*#-4"MOJAVENSIS)&/4"VALLISMORTIS$3-4"AMYLOLIQUEFACIENS!4##4

"PALLIDUS!4##4

" $

# !LICYCLOBACILLUSACIDOCALDARIUS8 "SCHLEGELII:"TUSCIAE: "EHIMENSIS!" "CHITINOLYTICUS!" "HORTI$"THERMOSPHAERICUS8 "THERMOCLOACAE:"AGARADHAERENS8"CLARKII:"VEDDERI:"NAGANOENSIS!" "LAEVOLACTICUS$"PSEUDOFIRMUS8 "CLAUSII8"GIBSONII8"HALODURANS!" "ALCALOPHILUS8 "PSEUDOALCALIPHILUS8 "HALOALKALIPHILUS8 "DIPOSAURI8 "HALOPHILUS!" "HALODENITRIFICANS!" "SALEXIGENS9"AZOTOFORMANS$"THERMOAMYLOVORANS, "PALLIDUS:"THERMOGLUCOSIDASIUS!" "KAUSTOPHILUS8 "THERMOLEOVORANS:"STEAROTHERMOPHILUS!"

"FLEXUS!" "MEGATERIUM$"SIMPLEX$"FASTIDIOSUS8"COHNII8 "HORIKOSHII"HALMAPALUS8

"PSYCHROSACCHAROLYTICUS!" "PSEUDOMYCOIDES!&"ANTHRACIS8 "CEREUS$"THURINGIENSIS$"MYCOIDES!" "WEIHENSTEPHANENSIS!"

"FIRMUS8"LENTUS!" "BENZOEVORANS$"CIRCULANS$"NIACINI!" "METHANOLICUS8 "INFERNUS5"MARINUS!" "FUSIFORMIS-"SPHAERICUS$"INSOLITUS8 "PASTEURII8 "GLOBISPORUS8"PSYCHROPHILUS$

"BADIUS8 "COAGULANS$"SPOROTHERMODURANS5"OLERONIUS8 "SMITHII:"CARBONIPHILUS!" "PUMILUS8 "LICHENIFORMIS8"AMYLOLIQUEFACIENS8"ATROPHAEUS!" "SUBTILIS8"VALLISMORTIS!""MOJAVENSIS!"

"PSYCHROSACCHAROLYTICUS!4##4"SIMPLEX)&/4

"FLEXUS)&/4 "FLEXUS$3-

"MEGATERIUM$3-"MEGATERIUM$3-"MEGATERIUM$3-"MEGATERIUM)!-"MEGATERIUM)&/"MEGATERIUM$3-"MEGATERIUM*#-4

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"PSEUDALCALIPHILUS$3-4"HALODURANS!4##4"ALCALOPHILUS$3-E

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"

"PALLIDUS!4##4"THERMOGLUCOSIDASIUS!4##4"STEAROTHERMOPHILUS$3-"STEAROTHERMOPHILUS$3-"STEAROTHERMOPHILUS)!-"STEAROTHERMOPHILUS)!-"STEAROTHERMOPHILUS)&/4"THERMOLEVORANS!4##4"KAUSTOPHILUS)!-4

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0.010.010.005 0.005 0.005 0.005

(A) (B) (C)

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(A) (B) (C)

T

ターを形成した（図 5）．そこで，これら の 種の同一性を DNA-DNA 類似度の試験により確かめ たところ，ほとんどの菌株は誤同定されていたもので あることがわかった．過去にこのような誤同定が多 かった理由には，特に表現形質が現れにくい細菌の

同定が難しいこと，また 属細菌の鑑別

性状が乏しいことなどが挙げられる．一連の結果か

ら，HV 領域はそれぞれの種で良く保存されており，

属（同時に 属も）にお

いても非常に有効な同定指標であることが示された

（Goto  ., 2004）．

属への 16S rDNA 高度可変領域（HV 領域）に基づく同定法の実用

  属細菌は好熱性，好酸性の有胞子

細菌で，2000 年以前は 3 種が記載されているのみで あった．直接的な病原性はないものの，一部の菌種

（主として ）は異臭を発生して食品

の腐敗を引き起こすため，食品業界では重要管理菌 として取り扱われている．これまで分離株の同定は 主に糖の資化性をもとに行われてきたが，反応が弱 いために人為的な誤同定が生じたり，また株レベル の性状のばらつきが大きく同定できなかったりした ために（最近になるまで知られていなかった），腐敗 原因の究明や制御法を講じるに当たっての大きな支 表

1

 

V1

〜

V9

領域の

28

種間における塩基保存性

可変領域 保存性されている塩基数

V1（69‑100：32 塩基）  0 （  0％）

V2（181‑228：48 塩基） 12（25％）

V3（415‑478：93 塩基） 66（71％）

V5（809‑838：30 塩基） 24（80％）

V6（986‑1017：32 塩基） 24（75％）

V7（1099‑1148：50 塩基） 36（72％）

V8（1223‑1279：57 塩基） 32（56％）

V9（1396‑1465：70 塩基） 63（90％）

V1 〜 V9: variable regions (Neefs  ., 1993)

図

4

 

 

属細菌

71

種の基準株由来

16S rDNA

塩基配列の多重配列解析に基づ く共通塩基配列

ベースとなる塩基配列には を用いた．保存されていない部位および

ギャップは ‑ で示した．下線は HV 領域増幅用のプライマー部位を示す．灰色 で塗りつぶした領域が HV 領域に相当．その他の変異領域について，5ʼ および 3ʼ 末 端側領域は登録情報の不足，また 450 〜 490 および 840 〜 920 領域は主として

および の塩基挿入あるいは欠失によるものであり，全てに共通

した変異領域ではない．

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図

5

 

 

属細菌および 属細菌 の

HV

領域の塩基配列に基づく系統樹

系統樹は 239 塩基の比較に基づき，NJ 法により構築した．枝上 には 70％以上のブーツストラップ値を示した．［］は誤同定の 菌株に付記した．

"ACILLUSSUBTILIS

)!-⁴

;

"REVIBACILLUSBREVIS "ACILLUSOLERONIUS

$3-=.#)-"⁴

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=.#)-"

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=.#)-"

"ACILLUSMETHANOLICUS

.#)-"⁴

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=.#)-"

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=.#)-"

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"REVIBACILLUSBREVIS

=.#)-"

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=.#)-"

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=.#)-"

!NEURINIBACILLUSTHERMOAEROPHILUS

$3-⁴

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

"REVIBACILLUS

SP$3-

"REVIBACILLUS

SP$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

"REVIBACILLUS

SP$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=.#)-"

!NEURINIBACILLUSANEURINILYTICUS

$3-⁴

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS !NEURINIBACILLUSMIGULANUS !NEURINIBACILLUSMIGULANUS

=$3-$3-$3-⁴

"REVIBACILLUSCENTROSPORUS "REVIBACILLUSINVOCATUS "REVIBACILLUSBORSTELENSIS "REVIBACILLUSBORSTELENSIS

.#)-"$3-$3-$3-^{4 44}

"REVIBACILLUSTHERMORUBER

$3-⁴

"REVIBACILLUSLATEROSPORUS

$3-⁴

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

"REVIBACILLUSREUSZERI "REVIBACILLUSFORMOSUS

$3-$3-^{4 4}

"REVIBACILLUSBREVIS

$3-

"REVIBACILLUSBREVIS

$3-⁴

"REVIBACILLUSBREVIS

$3-

"REVIBACILLUSCHOSHINENSIS

$3-⁴

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS "REVIBACILLUSPARABREVIS

=$3-)&/⁴

"REVIBACILLUSAGRI

$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

;

"REVIBACILLUSBREVIS

=$3-

"REVIBACILLUSAGRI

$3-⁴

図

6

 

 16S rDNA

塩基配列に基づく 属細菌および関連菌種

の分子系統樹，ならびに分離源

w-C6 は w-cyclohexyl 環状脂肪酸，w-C7 は w-cycloheptyl 環状脂肪酸を示す．

←で示した菌種は筆者らによって報告を行った菌種．

!-C7

!-C6 グアイアコール

産生 製品中で増殖 する可能性あり

B. subtilis B. tusciae A. herbarius A. herbarius A. shizuokaensis

A. kakegawaensis A. kakegawaensis A. cycloheptanicus

A. disulfidooxidans A. pomorum

A. contaminansA. contaminans A. acidiphilus A. fastidiosus A. acidoterrestris A. sacchariA. hesperidum subsp. hesperidum

A. hesperidum subsp.aigle

A. acidocaldarius subsp. acidocaldarius A. acidocaldarius subsp. rittmannii

Alicyclobacillus genomic species 2 A. sendaiensisAlicyclobacillus genomic species 1

A. mali 0.01

1971土壌（アメリカ）

1987土壌+変敗飲料（ドイツ）

1987土壌（ドイツ）

2000土壌（南極付近）

2000土壌（極地付近）

1997輸入果汁（日本）

1998土壌（南極付近）

2002輸入ハーブ（日本）

2002変敗飲料（日本）

2003コンポスト（日本）

2002土壌（日本）

2003輸入変敗飲料（日本）

2005土壌（日本）

2005土壌（日本）

2005土壌（日本）

2005土壌（日本）

2005土壌（日本）

2005土壌（南極付近）

2005輸入飲料原料（日本）

1996土壌（アメリカ）

障となっていた．そこで，HV 領域による同定法を 属細菌へ応用し，食品製造の TPO に 適うか否かを検討した．その結果，他の好気性有胞子

細菌と同様に，HV 領域は 属の同定

指標として非常に有効であることが示された（Goto  ., 2002a, 2002b, 2002c）．また，HV 領域を同定指 標として用いることにより，誤同定が無くなり，ま

た数多くの 属の新種を見出すことが

でき（Goto  ., 2002a, 2002b, 2003, 2007; Matsubara  ., 2002），腐敗性や製品での増殖特性の分布も明 らかとなってきた（図 6）．さらに，同一種内の 16S  rDNA や の塩基配列の多様性（それぞれの遺伝 子に基づく系統は稀に一致しない）と表現形質の多様 性の関連性などが示唆されてきた（Goto  ., 2006）．

これらの分子と表現形質と腐敗特性との相関について はこれからも追求していく予定であるが，HV 領域に

よる 属細菌の同定法は正確性および

迅速性の面で従来の技術を大きくしのぎ，実用面で利 用可能であることが示された．

おわりに

  平 成 8 年 度 よ り，16S rDNA の 塩 基 配 列 の 比 較 に よ る 好 気 性 有 胞 子 細 菌 の 同 定 法 の 開 発 を 行 っ た． 一 連 の 検 討 の 結 果， 属（

属， 属 な ど を 含 む ） を は じ め と

し， 属（ 属 を 含

む）， 属， 属および

属（Goto  ., 2002d）について 16S  rDNA，さらにはその高度可変領域（HV 領域）が同 定指標として有効であることを検証してきた．さらに，

乳酸菌やグラム陽性球菌，さらにはグラム陰性桿菌

（Kato  ., 2006）などにも本手法を応用し，実績を 上げてきていることから，本手法は極めて広範の細菌 の同定に利用可能であることが示唆されている．

 本手法では塩基配列を決定して相同性検索を行う流 れとなるため，汎用性の面で様々な分野へ普及するに は課題が残されているが，様々な種を対象とした同定 の場合，DNA 塩基配列の比較が現時点では最も正確 な手法であり，実際に国内外で利用されている．ア メリカの FDA でも微生物の同定は分子生物学的な手 法により実施することが望ましいとのコメントがプレ スリリースされ，日本でも日本薬局方や衛生試験法で 本手法を包含する形で記載されるようになってきてお り，遺伝子解析の流れはこれからさらに実用面に導入 されていくものと予想される．今後，ハードの面で本

手法がより簡便で迅速な方向に改良されることを期待 し，本総説を締めくくる．

謝 辞

 今回の奨励賞受賞に際し，終始ご指導賜りました東 京大学分子細胞生物学研究所の横田 明博士をはじめ とし，岡山大学の稲垣賢二博士，（株）海洋バイオテク ノロジー研究所の笠井宏朗博士，埼玉大学の定家義 人博士，東京農業大学の山里一英博士，理化学研究所 バイオリソースセンターメンバー各位および東京大学 分子細胞生物学研究所バイオリソーシス研究分野メン バー各位に心より感謝致します．

 また，三井農林（株）の田中裕子氏（旧姓加藤），浅 原未佳氏（現理化学研究所），藤田理英子氏，餅田 薫 氏をはじめ，一連の研究の手助けをして頂いた人々に 深く感謝の意を表します．

文 献

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