Anthoni Agustien1, Suci Fauzana1 dan Akmal Djamaan2
1) Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Andalas, Padang 2) Fakultas Farmasi, Universitas Andalas, Padang
e-mail: aagustien@gmail.com
ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian tentang bakteri endofitik dari daun sirih merah penghasil antibiotika. Bakteri endofitik diisolasi dari daun dengan menggunakan medium Nutrien Agar. Pengujian antibiotika dari masing isolat menggunakan metode kertas cakram dengan bakteri uji E. coli dan S. aureus. Hasil penelitian menunjukkan 14 isolat bakteri endofitik yang memiliki kemampuan menghasilkan antibiotika. Delapan isolat bakteri memilikizona hambat terhadap E.coli, 12 isolat memiliki daya hambat terhadap S. aureus dan 6 isolat bakteri terhadap ke dua bakteri uji tersebut. Isolat bakteri PCT-12 memiliki daya hambat tertinggi pada ke dua bakteri uji, yaitu 10 mm pada E.coli dan 11 mm pada S. aureus. Isolat PCT-12 menghasilkan dua jenis antibiotika yang dihasilkan pada 36 dan 42 jam fermentasi.
Kata kunci: endofitik, antibiotika, sirih merah, zona hambat, isolat
PENDAHULUAN
Antibiotika merupakan senyawa organik dengan berat molekul rendah yang dihasilkan mikroorganisme pada konsentrasi rendah memiliki aktivitas menghambat pertumbuhan ataupun membunuh mikroorganisme (Demain, 1981). Peningkatan populasi penduduk dunia yang signifikan dan perkembangan berbagai penyakit infeksi yang timbul semakin meluas, berkorelasi positip akan kebutuhan obat berupa antibiotika untuk itu eksplorasi senyawa anti mikroba yang baru dari berbagai sumber masih intensif dilakukan disamping itu, dewasa ini semakin banyaknya mikroorganisme patogen yang memiliki tingkat resistensi yang tinggi terhadap antibiotika.
Salah satu sumber antibiotika adalah mikroba yang hidup pada jaringan tumbuhan atau lebih dikenal dengan mikroba endofitik (Radji, 2005), Mikroorganisme endofitik dari berbagai tumbuhan dapat menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki karakter sebagai anti mikroba patogen yang mencakup bakteri, jamur dan virus, bioaktif mengobati kanker, senyawa artemisinin sebagai obat malaria, zat aktif yang bekerja seperti insulin, antioksidan, senyawa imunosupresif, bioinsektisida dansenyawa biokatalis berupa enzim (Strobel dan Daisy, 2003; Wiyakruttaet al., 2004).
Bakteri endofitik yang diisolasi dari tanaman memliki keanekaragaman yang yang besar, terdiri dari kelompok bakteri α-proteobakteria, β-proteobakteria,γ-proteobakteria, firmicutes, bakteriodes dan aktinobacteria (Rosenblueth dan Romero, 2006). Populasi bakteri endofitik dipengaruhi jenis bakteri, genotip inang, tingkat perkembangan inang, dosis inokulum dan kondisi lingkungan (Pillay and Nowak, 1997; Tan et al., 2003).
Tumbuhan obat merupakan sumber yang potensi keberadaan mikroba endofitik penghasil antibiotika, mengingat jenis metabolit sekunder yang dihasilkan oleh inang secara empiris, juga dapat dihasilkan oleh bakteri endofitik. Isolat bakteri endofitik penghasil antibiotika dari tumbuhan obat telah dilaporkan seperti dari tumbuhan surian (Djamaan et al., 2012).Sirih merah merupakan salah satu tanaman obatpotensial yang diketahuisecara empirismemiliki khasiat untuk menyembuhkanberbagai jenis penyakit (Robinson, 1991).
Berdasarkan uraian di atas dilakukan penelitian yang bertujuan untuk mengetahui potensi isolat bakteri endofitik dari daun sirih merah.
.
BAHAN DAN METODE
2.1. Pengoleksiansampel daun sirih merah
Sampel berupa daun sirih merah dilakukan dengan cara memetik daun yang ukurannya lebar sebanyak 5 helai, kemudian dimasukkan ke dalam kantong kertas steril.Daun yang masih dalam keadaan segar dicuci dengan air mengalir dan direndam selama 1 menit di dalam alkohol 70%. Selanjutnya
2.2.Isolasi bakteri endofitik
Bahagian dari daun secara aseptis diletakan pada cawan petri yang berisikan medium Nutrien Agar, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu kamar selama 2–4 hari. Dilakukan pemurnian secara bertahap pada bakteri yang tumbuh dan diberi kode pada biakan miring sebagai stok biakan.
2.3.Peremajaan bakteri
Peremajaan bakteri dilakukan dengan cara menginokulasikan 1 ose dari masing-masingbiakan miring bakteri secara ”streak plate” pada medium NA. Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Koloni tunggal bakteri digunakan untuk tahapan selanjutnya.
2.4.Pembuatan inokulum
Disiapkan medium produksi antibiotika dengan komposisi per liter terdiri dari 30 ml air rendaman jagung, 30 g sukrosa, 5 g CaCO3, 1 g FeSO4, 2 g MgCl2 dan 0,1 g ZnSO4. pH medium diatur pada 7,4.
Masing-masing isolat bakteri diinokulasikan pada Erlenmeyer 50 mlyang berisikan 10 ml medium produksi. Kultur diinkubasi di shaker inkubator pada suhu kamar dengan pengocokan 150 rpm selama 24 jam.
2.5.Produksi antibiotika dari masing-masing isolat
Diinokulasikan masing-masing inokulum (105 sel/ml) sebanyak 5% pada Erlenmeyer yang berisikan medium produksi. Kultur diinkubasi di shaker inkubator pada suhu kamar dengan pengocokan 150 rpm selama 48 jam. Dilakukan pencuplikan kultur pada waktu 24, 30, 36, 42 dan 48 jam inkubasi. Kultur bakteri disentrifugasi pada 5000 rpm, suhu kamar selama 15 menit. Selanjutnnya dipipetkan supernatan yang berupa ekstrak kasar antibiotika pada tabung reaksi kemudian disimpan pada 4 0C. 2.6. Determinasi potensi antibiotika
Pengujian potensi antibiotika dari masing-masing bakteri dilakukan menggunakan metode kertas cakram. Kertas cakram dibuat dengan merekatkan 3 lapis kertas saring Whatman no.42, lalu dilubangi dengan pelubang kertas sehingga didapatkan cakram berdiameter 6 mm. Kertas cakram steril dicelupkan pada masing-masing tabung reaksi yang berisikan ekstrak kasar antibiotika. Selanjutnya secara aseptis diletakan pada wadah steril untuk pengeringan. Kertas cakram yang mengandung ekstrak kasar antibiotika diletakan secara hati-hati dan aseptis pada medium NA yang telah dioles dengan masing-masing bakteri ujiStaphylococcus aureusdanEscherichia coli. Biakan diinkubasi pada inkubator dengansuhu kamar selama 24-48 jam. Zona bening yang terbentuk yang merupakan zona hambat, diukur diameternya.
2.7.Profil penghasilan antibiotika dari isolat yang paling potensi
Profil penghasilan antibiotika hanya dilakukan pada isolat yang memiliki daya hambat yang tertinggi. Pengerjaannya seperti pada langkah kerja 2.6 dan 2.7.
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1.Pengujian potensi antibiotika dari masing-masing isolat bakteri endofitik
Pengujian dari masing-masing bakteri endofitik isolat daun sirih merah, diperoleh 14 isolat bakteri yang memiliki kemampuan untuk menghasilkan antibiotika dan satu isolat tidak mempunyai kemampuan untuk menghasilkan antibiotika. Tabel 1 menunjukkan bahwa dari 14 bakteri endofitik penghasil antibiotika, 6 isolat menghasilkan antibiotika yang memberikan zona hambat terhadap kedua bakteri ujiyakni isolat PCM-2 dengan diameter hambatan 7 dan 8 mm, isolat PCM-11 dengan diameter sama-sama 10 mm, isolat PCT-2 dengan diameter hambatan 10 mm dan 9 mm, isolat PCT-3 dengan diameter hambatan sama-sama 7 mm, isolat PCT-9 dengan diameter hambatan 7 dan 8 mm dan isolat PCT-12 dengan diameter hambatan 11 dan 12 mm. Dua isolat bakteri menghasilkan antibiotika yang memberikan zona hambat terhadap hanya bakteri ujiE. coli tidak pada S.aureus yakni isolat PCM-4 dan PCT-7. Ekstrak kasar antibiotika dari 5 isolat hanya menghasilkan zona hambat pada S. aureus tidak pada E. coli yakni PCM 6, PCM 9, PCM 10, PCT 10 dan PCT 11. Bakteri endofitik isolat daun pohon surian yang menghasilkan antibiotika ada 14 isolat (Djamaan et al., 2012). Terbentuknya zona bening yang merupakan daerah hambat di sekitar kertas cakram akibat adanya aktivitas dari ekstrak kasar antibiotika yang dihasilkan mikroba memiliki aktivitas sebagai anti bakteri (Ardiansyah, 2009). Daerah hambat bakteri terjadi akibat dari terhambatnya pertumbuhan dari
bakteri uji (Dharma, 1985). Mikroorganisme dapat menghasilkan antibiotika jika mikroorganisme tersebut mengandung gen-gen yang mengkode antibiotika dan terekspresikan serta adanya induser sebagai penginduksi dalam biosintesis antibiotika dalam sel mikroba(Crueger dan Crueger 1984).Tabel 1 juga menunjukkan bahwa masing-masing isolat bakteri memiliki aktivitas antibiotika yang berbeda antara satu sama lainnya, hal ini disebabkan jenis antibiotika yang dihasilkan dari masing-masing isolat bakteri adalah berbeda, atau jenis antibiotikanya sama tetapi konsentrasi antibiotika yang dihasilkan tidak sama, sehingga memberi efek terhadap aktivitas antibiotika tersebut. Tabel 1. Rata-rata daerah hambat bakteri dari masing-masing isolat bakteri endofitik
No Kode Isolat
Diameter zona hambat (mm)
Escherichia coli Staphylococcus aureus
1 PCM-2 7 8 2 PCM-4 7 - 3 PCM-6 - 9 4 PCM-9 - 7 5 PCM-10 - 7 6 PCM-11 10 10 7 PCT-2 10 9 8 PCT-3 7 7 9 PCT-5 - - 10 PCT-6 - 11 11 PCT-7 8 - 12 PCT-9 7 8 13 PCT-10 - 10 14 PCT-11 - 9 15 PCT-12 11 12
Keterangan : (-) : tidak menghasilkan daerah hambat bakteri
A b
Gambar 1 : Efek ekstrak kasar antibotika dari bakteri endofitik terhadap bakteri uji S.aureus (a); terhadap E.coli (b)
Menurut Madigan et al. (2000), jenis dan konsentrasi antibiotika merupakan faktor penentu pada aktivitas antibiotika terhadap mikroorganisme.
Pada Tabel 1 juga dapat dilihat bahwa adanya isolat bakteri endofitik yang menghasilkan ekstrak kasar antibiotika yang memiliki daya hambat terhadap kedua bakteri uji ada yang hanya mempunyai
hambat, semakin besar daya hambat terhadap bakteri maka antibiotika tersebut memiliki aktivitas yang semakin baik (Ardiansyah, 2009).
3.2 Profil penghasilan antibiotika dari isolat PCT- 12
Profil penghasilan antibiotika dari bakteri endofitik PCT-12 disajikan pada Gambar 2.
Gambar 2 : Profilaktivitas antibiotika isolat PCT-12 terhadap bakteri uji Keterangan :
Gambar 2, menunjukkan adanya dua kurva aktivitas antibiotika dari isolat PCT-12, dimana antibiotika yang dihasilkan pada 36 jam memiliki daya hambat yang paling tinggi (10 mm) terhadap E. coli dan satunya lagi aktivitas antibiotika paling tinggi daya hambatnya (11 mm) terhadap S. aeureus pada 42 jam fermentasi.Hal ini menunjukkan bahwa Isolat PCT-12 bakteri endofitik yang diisolasi dari daun sirih, mempunyai dua jenis antibiotika yang berbeda. Mikroorganisme endofitik ada yang memiliki kemampuan menghasilkan lebih dari satu jenis antibiotika (Strobel dan Daisy, 2003).
KESIMPULAN DAN SARAN
4.1 Kesimpulan
Dari penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan sebagai berikut :
1. Diperoleh 14 isolat bakteri endofitik yang mampu menghasilkan antibiotika dari daun tanaman sirih merah (Piper crocatumRuiz & Pav), dengan perincian 8 isolat memiliki zona bening terhadap E.coli, 12 isolat memiliki daya hambat terhadap S. aureus dan 6 isolat bakteri terhadap ke dua bakteri uji tersebut.
2. Isolat PCT-12 adalah isolat yang memiliki daya hambat tertinggi pada ke dua bakteri uji. 3. Isolat PCT-12 menghasilkan dua jenis antibiotika, satu jenis antibiotika dihasilkan pada 36
jam dan yang satunya lagi pada 42 jam fermentasi. 4.2 Saran
Perlu penelitian lebih lanjut untuk optimasi dan “scale up” produksi antibiotika dari isolat PCT-12.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih disampaikan kepada Kepala Laboratorium Riset Mikrobiologi dan Ketua Jurusan Biologi FMIPA, Universitas Andalas, Padang, yang telah memberikan fasilitas penelitian.
6,5 8,5 10,5 24 30 36 42 48 D ia m e te r z o n a b e n in g ( m m )
DAFTAR PUSTAKA
Ardiansyah, 2009. Daun Beluntas Sebagai Bahan Antibakteri dan Antioksidan. Artikel Iptek. Bidang Biologi, Pangan dan Kesehatan.
Crueger, W. and A Crueger. 1994. Biotechnology : A Text Book Of Industrial Microbiology. Translate by C. Heasslyang T.D. Brock, Science Tech, Inc, Medison : New York.
Dharma,A.P.1985.Tanaman Obat Tradisional Indonesia. Penerbit Balai Pustaka. Jakarta.
Djamaan, A., A. Agustien dan D. Yuni. 2012. Isolasi bakteri endofitik dari tumbuhan tanaman surian (Toonia sureni Blume Merr.) yang berpotensi sebagai anti bakteri. Jurnal Bahan Alam
Indonesia, 8,1, 37-40.
Demain, A. L.1981. Industrial microbiology. Science,214, 987–994.
Madigan, M., J. Martinko and J. Parker (2000), Biology of Microorganism, 9th ed.,Prentice Hall Inc, New Jersey, 432-438.
Pillay, V. K. and Nowak, J. 1997. Inoculum density, temperature, and genotype effects on in vitro growth promotion and epiphytic and endophytic colonization of tomato
(Lycopersicon esculentum L.) seedlings inoculated with a pseudomonad bacterium.
Canadian Journal Microbiology, 43, 354-361.
Radji, M. 2005. Peranan bioteknologidan mikroba endofitdalam pengembangan obat herbal. Majalah
Ilmu Kefarmasian, 2, 3, 113-126
Rosenblueth, M. dan E.M., Romero, 2006. Bacterial endophytes and their interactions with host.
MPMI, Vol. 19, No. 8, 827–837.
Strobel, G. and B. Daisy. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products.
Journal Microbiology and Molecular Biology Review.67, 4, 491-502
Tan, Z., T. Hurek, and H.B., Reinhold. 2003. Effect of N-fertilization, plant genotype and environmental conditions on nifH gene pools in roots of rice. Journal Environmental
Microbiology, 5, 1009-1015.
Wiyakrutta, S., N. Sriubolmas, W. Panphut, N. Thongon and K. Danwisetkanjana. 2004. Endophytic fungi with anti-microbial, anti-cancer and anti-malarial activities isolated from Thai medicinal plants. World J.Microbiology Biotechnology,20, 265–272.
