i SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Robertus Satrio Wibisono NIM : 068114046
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
ii
PENETAPAN KADAR ASAM URSOLAT DALAM EKSTRAK DAUN
BINAHONG (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) DENGAN METODE
iv
HALAM AN PERSEM BAHAN
There’s no elevator to success, you have to take stairs
K ita hidup di dunia yang penuh keindahan, pesona serta petualangan.
D an semua itu tidak akan pernah berakhir selama kita mencarinya
dengan mata terbuka.
( J awaharlal N ehru )
Kupersembahkan Karya ini untuk:
Bapak dan Ibuku untuk segala doa, cinta dan perhatiannya.
Vincentia Octavianna, S.Farm. yang selalu ada untukku
v
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma: Nama : Robertus Satrio Wibisono
Nomor Mahasiswa : 068114046
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
“PENETAPAN KADAR ASAM URSOLAT DALAM EKSTRAK DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK” beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Yogyakarta, 8 Juni 2010
vi PENGANTAR
Segala pujian dan syukur senantiasa penulis haturkan kepada Tuhan Yesus Kristus karena hanya dengan anugerah, berkat, kasih, dan pertolongan-Nya, penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul ”Penetapan Kadar Asam Ursolat dalam Ekstrak Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik ”. Skripsi ini disusun guna memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm).
Terselesaikannya penulisan laporan akhir ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak yang telah membantu penulis, oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta
2. Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. selaku dosen pembimbing yang telah memberikan petunjuk, saran, arahan, dan bimbingan kepada penulis dalam proses penyusunan skripsi ini.
3. Dra. M.M. Yetty Tjandrawati, M.Si. dan Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji skripsi yang telah memberikan saran dan masukan demi kesempurnaan skripsi ini.
vii
6. Gayatri Kusuma Wardani teman seperjuangkanku yang telah bersama-sama melalui segala sesuatunya dengan keberbersama-samaan, suka duka, dan canda tawa dalam proses berjalannya penelitian
7. Seluruh teman-teman farmasi, khususnya kelas A angkatan 2006 dan FST A 2006 yang telah banyak berbagi keceriaan dan kesedihan 8. Para teman dan sahabat : Boim, Adit, ChoCho, Boris, Utz, Nyakpeng,
Nika, Reno, Tomplink, Celenk, Rudex, Tony, Pius, Nee, Lul, Mewry, Lilis, Dotie, Vica, Dissa, Adi, Ius, Willy, Yusri, Kelink, Nita, Sionk, Simbah terima kasih atas semua canda, tawa, kesedihan, dan kenakalan yang sangat berkesan bagi penulis
9. Serta semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu-per satu.
Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan dan kelemahan karena keterbatasan pikiran, tenaga, dan waktu penulis. Untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir kata semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi pembaca semua.
Yogyakarta, 8 Juni 2010
viii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini, tidak memuat karya atau bagian orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana karya ilmiah.
Yogyakarta, 8 Juni 2010 Penulis
ix
ekstrak daun binahong , dimana asam ursolat merupakan salah satu zat yang memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi, antitumor, antikanker, antioksidan, antiinfasif,dan antiulcer. Penelitian kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun binahong ini menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik.
Penelitian ini termasuk dalam jenis penelitian deskriptif noneksperimental. Tahap pertama dari penelitian ini adalah pembuatan ekstrak daun binahong dari daun binahong yang telah dikeringkan dengan menggunakan metode ekstraksi refluks. Selanjutnya, asam ursolat dianalisis secara kuantitatif dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan fase diam kolom Kromasil 100-5 C18 dan komposisi fase gerak metanol : ortophosphoric acid 1% (90 : 10) dengan kecepatan alir 0.6 ml/menit, serta detector UV 210nm yang telah divalidasi.
Berdasarkan analisis yang dilakukan, didapatkan hasil bahwa sampel ekstrak daun binahong yang digunakan dalam penelitian ini mengandung asam ursolat dengan kadar rata-rata 0,0525 ± 0,0089 %b/b.
x ABSTRACT
Binahong’s leaf (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) have activity as antiinflammatory, antitumor, anticancer, antioxidant, antiinfasif, antiulcer, etc.. Results from this study indicate that there ursolic acid content in leaf extracts binahong where ursolic acid is one substance that is known to have activity as an antiinflammatory, antitumor, anticancer, antioxidant, antiinfasif, antiulcer, etc.. Research ursolic acid content in the leaf extract binahong uses high-performance liquid chromatography (HPLC) reversed phase method.
This research was included in the descriptive non experimental. The first phase of this research is making binahong’s leaf extract from binahong as dried leaves using the reflux extraction method. Further, ursolic acid was analyzed quantitatively by reversed phase HPLC method with a stationary phase Kromasil 100-5 C18 column and mobile phase composition of methanol: ortophosphoric acid 1% (90: 10) with a flow rate of 0.6 ml / min, and a 210nm UV detector has been validated.
Based on the results of analysis conducted, the result shows that the leaf extract samples binahong used in this study contains ursolic acid with an average
grade of 0,0525 ± 0,0089% b / b.
xi
HALAMAN JUDUL... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING... ii
HALAMAN PENGESAHAN... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN... iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ...v
PENGANTAR... vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA... viii
INTISARI... ix
ABSTRACT... x
DAFTAR ISI... xi
DAFTAR TABEL... xv
DAFTAR GAMBAR... xvi
DAFTAR LAMPIRAN... xvii
BAB I. PENGANTAR A. Latar Belakang... 1
B. Permasalahan... 2
C. Keaslian penelitian... 3
xii
E. Tujuan Penelitian... 4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA A. Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis... 5
B. Ekstraksi... 5
C. Asam Ursolat... 6
D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) 1. Definisi KCKT...7
2. Kromatografi Partisi Fase Terbalik...8
3. Detektor...9
4. Analisis Kualitatif dan Analisis Kuantitatif...9
E. Parameter Validasi Metode Analisis 1. Akurasi...10
2. Presisi...11
3. Spesifisitas/Selektivitas...11
4. Linearitas dan Rentang...12
5. Limit Of Detection (LOD) dan Limit Of Quantitative (LOQ).12 F. Landasan Teori...13
G. Hipotesis... 14
BAB III. METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian... 15
xiii
1. Determinasi Tanaman... 16
2. Preparasi Sampel a. Pemilihan Sampel...17
b. Pengeringan Sampel...17
c. Ekstraksi Sampel...17
3. Pembuatan Fase Gerak... 18
4. Pembuatan Larutan Baku Asam Ursolat a. Pembuatan Larutan Induk Asam Ursolat...18
b. Pembuatan Larutan Intermediet Asam Ursolat...18
5. Pembuatan Kurva Baku... 18
6. Analisis Validasi Metode KCKT a. Akurasi...19
b. Presisi...19
c. Linearitas...20
d. LOD dan LOQ...20
7. Pembuatan Larutan Sampel...20
8. Penetapan recovery Sampel...21
9. Penetapan Kadar Asam Ursolat...21
xiv BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembuatan Fase Gerak... 23
B. Pembuatan Kurva Baku Asam Ursolat... 24
C. Determinasi Tanaman...27
D. Preparasi Sampel... ...27
E. Penentuan Recovery, Kesalahan Acak dan Kesalahan Sistemik...29
F. Penetapan Kadar Asam Ursolat...31
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan... 38
B. Saran... 38
DAFTAR PUSTAKA... 39
LAMPIRAN... 42
xv
xvi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur Asam Ursolat...7
Gambar 2. Instrumen KCKT... 8
Gambar 3. Interaksi Hidrogen Antara Asam Ursolat Dengan Metanol Dalam Fase Gerak………...………….………...…...………24
Gambar 4. Kurva hubungan massa vs AUC kurva baku replikasi I….…...………26
Gambar 5. Kromatogram Baku...32
Gambar 6. Kromatogram Sampel………...………….33
Gambar 7. Kromatogram Hasil Pemisahan Sampel recovery... 34
xvii
Lampiran 3. Perhitungan LOD dan LOQ………...….……47 Lampiran 4. Penimbangan daun binahong………...………….…..48 Lampiran 5. Penimbangan rendemen ekstrak daun binahong………...….….48 Lampiran 6. Perhitungan recovery, kesalahan acak, dan kesalahan sistemik....….49 Lampiran 7. Contoh perhitungan kadar asam ursolat berdasarkan parameter AUC
1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang
Dewasa ini mulai banyak dikembangkan pembuatan sediaan obat dari bahan alam dan telah banyak beredar di pasaran. Pengalihan cara pandang dari penggunaan bahan kimia sintesis menjadi penggunaan bahan alam sebagai sumber pengobatan tidak dipungkiri karena adanya efek samping yang ditimbulkan dengan penggunaan obat dari zat-zat kimia, sehingga telah merubah cara pandang masyarakat untuk lebih memilih obat yang berbahan dasar bahan alam dengan harapan untuk memperkecil efek samping yang dapat ditimbulkan.
Tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) merupakan tanaman dengan banyak kandungan zat yang memiliki khasiat antioksidan terutama pada bagian daunnya. Tanaman binahong mengandung asam askorbat dan total fenol yang cukup tinggi (Uchida et.al., 2003). Khasiat lain pada tanaman binahong adalah sebagai antiinflamasi, antitumor, antikanker, antioksidan, antiinfasif, antiulcer, hepatoprotektif, gastroprotektif, dsb. (Liao, 2005). Penelitian ini ingin mengetahui kadar salah satu kandungan dalam tanaman binahong yaitu asam ursolat. Pada penelitian sebelumnya, asam ursolat biasa dijumpai pada tanaman ceri hitam (Prunus serotina Ehrh.), Eriobotrya japonica, Rosmarinus officinalis, dan Glechoma hederaceae (Cha, 1996).
lanceolatae (Plantago lanceolata L.), dan Flos Lamii albi (Lamium album L.). Tanaman yang mengandung asam oleanolat dimungkinkan pula mengandung asam ursolat. Hal ini dikarenakan asam oleanolat merupakan isomer dari asam ursolat, yang berbeda posisi gugus metilnya pada atom karbon nomor 19 dan 20.
Asam ursolat adalah salah satu zat yang dapat menimbulkan aktivitas antiinflamasi, antitumor, antikanker, antioksidan, antiinfasif, antiulcer, hepatoprotektif, gastroprotektif (Liao,2005). Mengingat pentingnya manfaat asam ursolat, maka dalam penelitian ini penulis mencoba menganalisa ada atau tidaknya kandungan asam ursolat dalam tanaman binahong. Penelitian ini juga bertujuan untuk menghitung kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik yang telah memiliki validitas yang baik, dimana nilai validitas yang baik dilihat dari nilai akurasi, presisi, liniearitas, serta LOD dan LOQ yang memenuhi persyaratan. Alasan pemilihan metode Kromatogafi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik adalah menilik bahwa sampel yang digunakan adalah bahan alam murni tanpa dilakukan isolasi, sehingga diperlukan suatu sistem kromatografi dengan sensitifitas pemisahan tinggi dan persyaratan ini dapat diakomodasi oleh metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik.
B. Permasalahan
3
1. Apakah terdapat kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun tanaman binahong?
2. Berapakah kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun binahong yang akan ditetapkan kadarnya menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik yang telah tervalidasi?
C. Keaslian Penelitian
Sejauh pengetahuan penulis, penelitian dengan menggunakan tanaman binahong (sudah sering dilakukan di Indonesia, antara lain :
1. Formulasi Gel Antiluka Ekstrak Daun Binahong (Anredera baselloides (Ten.) Steenis) dengan Basis Carbopol (Setyaningretry,2007).
2. Optimasi Formula Span 80 dan Tween 80 dalam cold cream Obat Luka Ekstrak Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) steenis) dengan Metode Simplex Lattice Design (Paramita, 2008).
Namun penelitian berkaitan dengan kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun binahong belum pernah dilakukan.
D. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat sebagai berikut :
1. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat mengetahui kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun tanaman binahong.
E. Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang ada, maka penelitian ini bertujuan untuk :
1. Mengetahui ada tidaknya kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun tanaman binahong.
5 BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA A.Binahong
Tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) termasuk dalam family Basellaceae. Tanaman binahong merupakan tumbuhan menjalar, berumur panjang (perenial), dan bisa mencapai panjang 5 m. Batangnya lunak, berbentuk silindris, saling membelit, dan berwarna merah. Daun dari tanaman ini bertangkai sangat pendek (subsessile), susunannya berseling, berwarna hijau, dan berbentuk jantung (cordata). Bunganya majemuk berbentuk tandan, bertangkai panjang, muncul di ketiak daun. Akarnya berbentuk rimpang, berdaging lunak (Hidayati, 2009).
Tanaman binahong mempunyai beberapa kandungan kimia, seperti asam oleanolat, asam ursolat, asam askorbat, fenol, minyak atsiri, ancordin, dsb. (Lazuardhi, 2009).
B. Ekstraksi
Ekstraksi digesti merupakan ekstraksi maserasi dengan menggunakan pemanasan lemah. Cara maserasi ini hanya dapat digunakan untuk simplisia yang zat aktifnya tahan terhadap panas (Haryono, 1986).
Keuntungan ekstraksi digesti antara lain :
1. Kekentalan pelarut berkurang yang dapat mengakibatkan berkurangnya lapisan batas.
2. Daya melarutkan cairan meningkat karena pemanasan.
3. Koefisien difusi berbanding lurus dengan suhu dan berbanding terbalik dengan kekentalan sehingga peningkatan suhu berpengaruh pada kecepatan difusi umumnya peningkatan kelarutan terjadi jika suhu juga ditingkatkan (Haryono, 1986).
C.Asam Ursolat
Asam ursolat merupakan golongan senyawa triterpen pentasiklik (Wojciak dan Kosior, 2007). Senyawa ini dapat ditemui pada tumbuhan apel, basil, bilberries, cranbarries, dsb. Senyawa ini mempunyai berat molekul sebesar 456.70 g/mol (Olszewska, 2008).
7
Gambar 1. Struktur asam ursolat
D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) 1. Definisi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi cair kinerja tinggi adalah suatu sistem kromatografi yang fase geraknya dialirkan dengan cepat dengan bantuan pompa dan hasilnya dideteksi dengan detektor (Gritter dkk., 1985). Tujuan analisis dengan KCKT yaitu didapatkan pemisahan yang baik dalam waktu yang relatif singkat (Mulja, 1995).
m s C
C K
dengan K adalah koefisien distribusi, Cs dan Cm adalah konsentrasi linarut berturut-turut dalam fase diam dan fase gerak (Johnson & Stevenson, 1978).
Gambar 2. Instrumen KCKT (Kazakevich and Mc.Nair, 1996).
2. Kromatografi Partisi Fase Terbalik
Prinsip kromatografi partisi didasarkan pada partisi linarut antara dua pelarut yang tidak bercampur yang ada pada fase diam dan fase gerak. Fase diam (polar atau nonpolar) disalutkan pada penyangga dan dikemas ke dalam kolom. Jika linarut ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri atas dua pelarut yang tidak bercampur dan keseluruhan sistem dibiarkan setimbang (Johnson & Stevenson, 1978).
9
a. Kolom. Kolom yang digunakan pada jenis kromatografi ini ialah kemasan fase terikat. Fase diam yang biasa digunakan pada kromatografi partisi fase terbalik adalah oktadesilsilan (ODS).
b. Fase gerak. Fase gerak pada KCKT sangat berpengaruh pada tambatan sampel dan pemisahan komponen dalam campuran. Pada fase terbalik, kandungan utama fase geraknya adalah air (Munson, 1984).
3. Detektor
Detektor yang baik hendaknya memiliki kepekaan tinggi, rentang respon liniernya lebar, tidak dipengaruhi suhu dan aliran, serta memberikan hasil dengan keterulangan yang baik. Secara umum, detektor dibagi menjadi 2 kategori yaitu :
a. Bulk property detektor. Detektor jenis ini merupakan detektor yang mengukur perubahan sifat fisik fase gerak dan solut.
b. Solute property detectors. Detektor ini merupakan detektor yang hanya mengukur sifat fisik solut. Detektor tipe ini 1000 kali lebih sensitif dan mampu mengukur solut sampai satuan nanogram atau lebih kecil lagi (Munson, 1984).
4. Analisis Kualitatif dan Analisis Kuantitatif
Resolusi (Rs) merupakan jarak antara dua puncak dibagi dengan rata-rata lebar dasar puncak. Resolusi dikatakan baik apabila nilai RS ≥ 1.5 yang berarti pemisahannya telah mencapai 99.7% (Sastrohamidjojo, 2002).
Analisis kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi senyawa murni dan waktu retensi senyawa yang dimaksud dalam sampel. Respon yang diperoleh berupa peak atau luas area peak dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Noegrohati, 1994).
E. Parameter Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).
Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis antara lain:
1. Akurasi
Akurasi atau kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan dengan persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan (Harmita, 2004).
11
Tabel I. Recovery (Harmita, 2004)
2. Presisi
Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang-ulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Presisi dinyatakan dalam koefisien variasi (KV). Suatu metode dapat dikatakan baik apabila memiliki KV < 2% (Harmita, 2004).
3. Spesifisitas/Selektivitas
lainnya, dan dibandingkan dengan sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan (Harmita, 2004).
4. Linearitas dan rentang
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode (pada rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit di dalam sampel. Rentang adalah jarak antara level terbawah dan teratas dari metode analisis yang telah dipakai untuk mendapatkan presisi, akurasi dan linieritas yang bisa diterima (Anonim, 2007).
5. Limit Of Detection (LOD) dan Limit Of Quantitative (LOQ)
Limit Of Detection (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat
dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko.
LOD merupakan parameter uji batas. Limit Of Quantitative (LOQ) merupakan
parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam
sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004).
LOD dan LOQ dapat dihitung dengan rumus:
13
b. Limit Of Quantitative
dengan Sy/x adalah simpangan baku, dan Sl adalah slope atau nilai b pada
persamaan garis y = bx + a (Harmita, 2004).
F. Landasan Teori
Tanaman binahong diketahui memiliki beberapa kandungan kimia golongan triterpenoid salah satunya adalah asam ursolat. Asam ursolat merupakan golongan senyawa triterpen pentasiklik. Asam ursolat dikenal mempunyai berbagai macam khasiat, seperti antiinvasif, antiinflamasi, antiulcer, antiaterosklerosis, dan hepatoprotektif.
Metode KCKT fase terbalik mempunyai daya pisah yang tinggi yang bisa
memisahkan senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun tanaman binahong.
Asam ursolat merupakan senyawa yang memiliki gugus polar sehingga pada metode
KCKT ini digunakan Metode KCKT fase terbalik.
Kondisi dan validitas pemisahan asam ursolat dari senyawa lain dalam ekstrak
daun tanaman binahong telah divalidkan dan dilakukan lewat penelitian Wardani
G. Hipotesis
1. Terdapat kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun tanaman binahong. 2. Kadar asam ursolat dalam ekstrak daun tanaman binahong dapat ditetapkan
15 BAB III
METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian deskriptif noneksperimental. Rancangan penelitian bersifat deskriptif karena penelitian ini hanya mendeskripsikan keadaan yang ada dan merupakan jenis penelitian noneksperimental karena tidak dilakukan manipulasi terhadap subjek uji.
B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Klasifikasi variabel
a. Variabel bebas. Ekstak daun binahong
b. Variabel tergantung. Kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong.
c. Variabel pengacau terkendali. Variasi kadar baku asam ursolat dan kadar sampel yang disebabkan adanya pengotor pada sistem KCKT.
2. Definisi operasional
a. Asam ursolat yang ditetapkan kadarnya adalah asam ursolat yang terkandung dalam ekstrak daun binahong.
b. Ekstrak daun binahong didapatkan dari ekstraksi dengan menggunakan metode refluks serta menggunakan pelarut metanol dan kloroform.
C. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ortophosphoric acid (p.a. Merck), kloroform (p.a. Merck), metanol (p.a. Merck), aquabidest (PT. Ikapharmindo Putramas), ekstrak daun binahong, dan standar asam ursolat(Sigma).
D. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat KCKT yang terdiri dari pompa merek Shimadzu LC-10 AD, detektor UV Vis merek Shimadzu SPD 10 AV, CBM 101 merek Shimadzu, seperangkat komputer merek ACER, printer merek Hewlett Packard Deskjet 670 C, injektor jenis katup suntik model 77251, kolom C-18 merek Knauer 4,6 mm x 25 cm, syringe merek Hamilton Part, alat degassing ultrasonik merek Retsch tipe T640, penyaring Whatmann anorganik dan organik, membran filter merek Whatman, neraca analitik merek Scaltec SBC 22, vakum merek Gast model DOA-P104-BN, Milipore ukuran pori 0,45 µm, pendingin, labu alas bulat, penangas air, rotari evaporator, seperangkat alat gelas.
E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi Tanaman Binahong
17
b. Pengeringan sampel.
Lebih kurang 100 gram daun segar tanaman binahong dibersihkan sampai bersih dengan air mengalir. Daun segar tersebut kemudian dipotong-potong dan dilakukan proses pengeringan dengan menggunakan oven pada suhu 60⁰C.
c. Ekstraksi sampel
3. Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah campuran antara metanol dengan ortophosphoric acid 1% dengan perbandingan 90:10 (v/v). Ortofosforic acid 1% dibuat dengan melarutkan 0.58 ml ortophosphoric acid dalam 50.0 ml aquabidest. Campuran metanol : ortophosphoric acid 1% 90:10 (v/v) ini kemudian disaring dengan penyaring Whatman anorganik dengan bantuan pompa vakum dan kemudian di degassing dengan menggunakan ultrasonicator selama 15 menit.
4. Pembuatan Larutan Baku Asam Ursolat a. Pembuatan larutan induk asam ursolat
Larutan induk asam ursolat dibuat dengan cara menimbang seksama sebanyak 0.01 gram baku asam ursolat, kemudian dilarutkan dalam campuran kloroform metanol 1:4 (v/v) sampai 10 ml.
b. Pembuatan larutan intermediet asam ursolat
Larutan intermediet asam ursolat dibuat dengan cara mengambil 1.0 ml larutan baku asam ursolat, kemudian ditambahkan dengan pelarut campuran kloroform metanol 1:4 (v/v) sampai 10 ml. Asam ursolat dengan konsentrasi 94.4 µg/ml ini kemudian disaring dengan millipore dan di degassing dengan
menggunakan ultrasonicator selama 15 menit. 5. Pembuatan Kurva Baku
19
8.0; dan 10.0 µl, kemudian disuntik dengan kecepatan alir fase gerak yang optimum
dan dideteksi pada panjang gelombang maksimum asam ursolat. Area Under Curve (AUC) dapat dilihat dari kromatogram pada waktu retensi yang sesuai dengan waktu retensi asam ursolat. Dibuat kurva regresi linier yang menyatakan hubungan antara kadar asam ursolat vs AUC, kemudian ditentukan nilai koefisien korelasinya.
6. Analisis Validitas Metode KCKT
Parameter-parameter yang digunakan sebagai pedoman kesahihan suatu metode analisis antara lain :
a. Akurasi
Akurasi metode analisis dinyatakan dalam persen (%) perolehan kembali recovery yang dihitung dengan cara sebagai berikut
Rumus Recovery = x 100%
(Mulja dan Hanwar, 2003). Metode analisis dikatakan memiliki nilai akurasi yang baik apabila nilai recovery larutan baku asam ursolat berada pada rentang 98%-102% (Harmita,
2004) b. Presisi
Presisi metode analisis dinilai berdasarkan koefisien variasi yang dihitung dengan cara sebagai berikut
KV = x 100%
Metode analisis dikatakan baik jika nilai KV < 2% (Harmita, 2004). c. Linearitas
Linearitas dilihat dari harga r (koefisien korelasi) hasil pengukuran seri larutan baku asam ursolat. Suatu metode analisis dikatakan memiliki linearitas yang baik jika nilai r > 0.99 atau r2 > 0.997 (Chan dkk., 2004). Rentang ditentukan dari kadar asam ursolat yang digunakan dalam analisis, mulai dari kadar terkecil hingga paling tinggi.
d. Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitative (LOQ)
LOD dan LOQ dapat dihitung menggunakan persamaan sebagai berikut. Limit Of Detection
(Harmita, 2004).
Limit Of Quantitative
(Harmita, 2004).
7. Pembuatan larutan sampel
21
15 menit dan dimasukkan ke dalam tray dan di injeksikan pada sistem KCKT dengan volume injeksi 50 µl. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali dan dilakukan triplo untuk setiap replikasi.
8. Penetapan Recovery Sampel
Satu mililiter larutan intermediet asam ursolat yang dibuat dengan konsentrasi 94.4 µg/ml ditambahkan dengan sampel ekstrak daun binahong sampai volume 10 ml, kemudian disaring dengan millipore dan di degassing dengan ultrasonicator selama 15 menit dimasukkan ke dalam tray dan dibuat seri volume injek dengan volume 2,0; 6,0; dan 10,0 µl, kemudian disuntik dengan 3 kali replikasi dengan kecepatan alir fase gerak yang optimum dan dideteksi pada panjang gelombang maksimum asam ursolat. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali sehingga diperoleh 9 data. Dari kromatogram dilihat AUC pada waktu retensi sesuai dengan dengan waktu retensi asam oleanolat. Kadar asam ursolat dihitung dengan memasukkan harga AUC ke persamaan kurva baku yang diperoleh.
9. Penetapan kadar asam ursolat
dilakukan sebanyak 3 kali dan dilakukan triplo pada masing-masing pengulangan untuk menghitung recovery dengan rumus :
Rumus Recovery = x 100%
(Mulja dan Hanwar, 2003). F. Analisis Hasil
23 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN A. Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan dalam sistem KCKT ini adalah campuran metanol dengan orthophosporic acid 1% dengan perbandingan 90:10 (v/v). Orthophosporic 1% dibuat dengan cara melarutkan sebanyak 0.58 ml orthophosporic 85% kemudian diencerkan dengan aquabidest sampai volume 50.0 ml. Fase gerak sebelum diaplikasikan pada sistem KCKT terlebih dahulu disaring dengan menggunakan membran fiter merek Whatman dengan bantuan pompa vakum, hal ini bertujuan untuk menghilangkan pengotor dan partikel-partikel sebelum masuk ke sistem KCKT, setelah disaring fase gerak di degassing selama 15 menit. Proses ini bertujuan untuk menghilangkan gelembung. Karena seperti dikatahui adanya gelembung dapat mengganggu kinerja sistem KCKT yaitu dapat menyumbat kolom.
Gugus polar yang ada dalam asam ursolat akan berinteraksi dengan fase gerak melalui ikatan hidrogen. Semakin banyak gugus polar yang dimiliki oleh suatu senyawa, maka akan semakin banyak ikatan hidrogen yang terbentuk sehingga afinitas antara fase gerak dengan gugus polar suatu senyawa semakin besar dan akan semakin cepat terelusi karena konsentrasi linarut dalam fase gerak lebih besar.
O
Gambar 3. Interaksi Hidrogen Antara Asam Ursolat Dengan Metanol Dalam Fase Gerak
B. Pembuatan Kurva Baku Asam Ursolat
25
respon yang terjadi dikarenakan deteksi instrumen sebanding dengan kenaikan konsentrasi baku yang digunakan. Parameter linieritas suatu kurva ditentukan dengan nilai koefisien korelasi (r) lebih besar dari 0,999 (Snyder et al., 1997).
Lima variasi konsentrasi injeksi dibuat untuk menentukan persamaan kurva baku yakni 2.0; 4.0; 6.0; 8.0; dan 10.0 µl baku asam ursolat yang kemudian diinjeksikan ke sistem instrumen KCKT dan dibaca oleh detektor pada panjang gelombang overlapping asam ursolat yaitu 210 nm. Dilakukan tiga kali replikasi untuk setiap seri konsentrasi dengan tujuan untuk mencari nilai koefisien korelasi (r) yang terbaik yakni lebih besar dari 0.999.
Persamaan regresi linier yang didapatkan merupakan hubungan antara massa asam ursolat vs AUC. Hasil dari penetapan kurva baku dapat dilihat pada tabel dibawah ini
Tabel II. Data kurva baku
Volume Injek
(µl)
Dari data diatas dapat dilihat semua kurva baku memiliki nilai r > 0.999. Persamaan seperti ini menunjukkan nilai linearitas yang baik. Persamaan kurva baku dengan nilai koefisien korelasi terbesar digunakan untuk menetapkan kadar asam ursolat dalam sampel ekstrak daun binahong. Persamaan kurva baku yang digunakan untuk perhitungan kadar adalah persamaan replikasi I dengan nilai koefisien korelasi sebesar 0.999995.
Asam ursolat ditetapkan kadarnya dengan menggunakan persamaan kurva baku replikasi I dan hubungan antara massa asam ursolat vs AUC dapat dilihat pada gambar berikut.
Gambar 4. Kurva hubungan massa vs AUC kurva baku replikasi I
27
C. Determinasi Tanaman
Tanaman binahong telah dideterminasi oleh Laboratorium Kebun Obat Fakultas Farmasi Sanata Dharma. Determinasi dilakukan dengan mengacu pada buku Flora of java. Tanaman binahong termasuk dalam family Basellaceae.
D. Preparasi Sampel
Penyiapan sampel dimulai dari pemilihan daun segar binahong (yang kemudian dipotong-potong dan dikeringkan dalam oven pada suhu 60ºC. Pengeringan daun binahong merupakan proses penting yang bertujuan untuk menjaga stabilitas daun binahong dari pertumbuhan mikroba. Resiko pertumbuhan mikroba pada daun kering jauh lebih kecil daripada daun segar, hal ini dikarenakan kandungan air yang cukup tinggi pada daun segar. Proses pengeringan juga berujuan untuk membuat matinya sel pada daun, dengan penghilangan kadar air dalam daun yang merupakan kebutuhan bagi kehidupan sel daun maka akan menyebabkan matinya sel daun. Matinya sel daun akan menyebabkan membran sel yang merupakan bagian daun yang mengatur keluar masuknya zat dari dan menuju sel akan rusak sehingga kandungan zat yang terdapat dalam sel akan lebih mudah diambil sehingga akan didapatkan kadar asam ursolat yang lebih banyak.
yang dilengkapi dengan alat pendingin tegak, lalu dipanaskan sampai mendidih. Cairan penyari akan menguap, uap tersebut akan diembunkan dengan pendingin tegak dan akan kembali menyari zat aktif dalam simplisia tersebut. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan daun kering sebanyak 5 gram.
Ekstraksi asam ursolat pada daun binahong menggunakan sistem dua kali ekstraksi. Ekstraksi pertama menggunakan pelarut kloroform sebanyak 30 ml selama 30 menit pada suhu 70ºC. Residu dari ekstraksi pertama kemudian diekstraksi kembali dengan menggunakan pelarut campuran antara metanol dan kloroform sebanyak 30 ml dengan perbandingan 1:1 (v/v) selama 30 menit pada suhu 70ºC. Proses ekstraksi pada penelitian ini menggunakan dua pelarut dikarenakan asam ursolat memiliki gugus polar dan gugus nonpolar sehingga dilakukan ekstraksi dengan dua pelarut yang bersifat polar dan nonpolar yaitu metanol sebagai pelarut polar dan kloroform sebagai pelarut nonpolarnya. Hasil ekstraksi pertama dan kedua dicampur untuk kemudian di evaporasi menggunakan rotari evaporator. Metode dua kali ekstraksi juga digunakan dalam proses ini yang bertujuan untuk meningkatkan efektifitas ekstraksi sehingga diharapkan seluruh kandungan asam ursolat pada daun binahong dapat tertarik pada pelarut.
29
daun binahong sebanyak tiga kali kemudian dilarutkan dengan metanol sampai volume 10 ml.
Untuk mendapatkan larutan yang jernih, maka dibutuhkan penyaringan larutan sampel dengan menggunakan millipore, fungsi millipore sebagai membran filter adalah untuk menghilangkan semua partikel yang tak larut dalam fase gerak. Semakin kecil ukuran pori membran filter maka filtrat yang dihasilkan akan semakin jernih. Pada penelitian digunakan millipore dengan ukuran pori 0,45 µm, oleh sebab itu maka yang akan dihilangkan adalah partikel yang berukuran > 0,45 µm. Partikel
harus dihilangkan sebelum injeksi sebab partikel akan menyumbat inlet kolom, sehingga akan merusak kolom yang pada akhirnya akan mengurangi umur normal kolom (Snyder et al., 1997). Filtrat yang didapatkan selanjutnya didegassing selama 15 menit untuk menghilangkan gelembung yang terdapat dalam larutan, karena adanya gelembung dikhawatirkan dapat menyumbat kolom instrumen KCKT.
E. Penentuan Recovery, Kesalahan Acak, dan Kesalahan Sistemik
Penentuan nilai recovery dilakukan untuk melihat tingkat akurasi metode yang digunakan dan memeriksa apakah metode yang digunakan dapat menetapkan kadar hingga mendekati nilai yang sebenarnya.
Tabel III. Nilai recovery asam ursolat
(Wardani, 2010). Nilai recovery metode KCKT untuk asam ursolat adalah 104.413% untuk volume injeksi 2 µl; 105.931% untuk volume injeksi 6 µl; dan 107.242% untuk volume injeksi 10 µl. Nilai recovery pada baku asam ursolat masuk dalam rentang
yang diijinkan sehingga dapat dinyatakan metode KCKT fase terbalik ini memiliki akurasi yang baik untuk menetapkan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong berdasarkan parameter respon AUC.
Untuk mengukur tingkat kesalahan yang terjadi dalam penetapan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol, maka ditentukan pula nilai kesalahan sistemik yang merupakan parameter kesalahan yang disebabkan oleh faktor instrumen dan metode yang digunakan. Kesalahan sistemik metode KCKT fase terbalik ini baik yaitu memiliki nilai 4.84% pada volume injeksi 2 µl ; 1.768% pada volume injeksi 6
31
µl dan 1.346% pada volume injeksi 10 µl dimana nilai tersebut dibawah batas nilai
yang dipersyaratkan.
F. Penetapan Kadar Asam Ursolat
Penetapan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong dilakukan dalam kondisi sama seperti validasi metode penetapan kadar asam ursolat dengan metode KCKT fase terbalik. Asam ursolat merupakan analit dari ekstrak daun binahong yang akan ditentukan kadarnya, dimana dalam ekstrak daun binahong terdapat pula senyawa-senyawa lain yang dapat mengganggu penetapan kadar asam ursolat. Oleh karena itu metode KCKT fase terbalik yang akan digunakan untuk menetapkan kadar asam ursolat harus bisa memisahkan asam ursolat dari senyawa-senyawa lain yang ada di dalam ekstrak daun binahong .
33
Gambar 6. Kromatogram sampel
Keberhasilan pemisahan ditunjukkan dengan nilai resolusi dimana nilai resolusi dihitung dengan persamaan sebagai berikut.
Rs = ( ) ( )
(Noegrohati, 1994).
baik adalah lebih dari 1.5 (Noegrohati, 1994). Dengan didapatkan nilai resolusi yangbaik maka dapat dikatakan bahwa telah terjadi pemisahan senyawa dengan baik.
Metode spiking digunakan untuk lebih menguatkan uji kualitatif adanya asam ursolat pada ekstrak daun binahong. Dari hasil kromatogram sampel dengan volume injek 10 µl pada menit ke 23,509 menunjukkan AUC sebesar 132058,sedangkan dari
sampel yang di-spiking dengan baku asam ursolat pada menit ke 23,438 menunjukkan nilai AUC sebesar 734811. Peningkatan nilai AUC tersebut secara kualitatif menunjukkan adanya senyawa asam ursolat dalam ekstrak daun binahong. Hasil kromatogram uji kualitatif dengan metode spiking ditunjukkan pada gambar berikut.
35
Gambar 8. Kromatogram hasil pemisahan sampel spiking
Berdasarkan hasil validasi metode Wardani (2010), metode KCKT fase terbalik dengan menggunakan fase diam berupa Kromasil 100-5 C
Penetapan kadar asam ursolat dalam sampel ekstrak daun binahong dilakukan sebanyak tiga kali replikasi yaitu diwakili oleh tiga kali penyiapan sampel dan setiap replikasi dilakukan triplo. Perhitungan kadar asam ursolat dalam sampel ekstrak daun binahong dilakukan dengan menggunakan interpolasi AUC yang dihasilkan sebagai respon detektor terhadap senyawa hasil pemisahan dari kolom. Parameter AUC digunakan karena telah memenuhi kriteria akurasi. Berdasarkan hasil perhitungan, maka diperoleh kadar asam ursolat sebagai berikut.
Tabel IV. Hasil penetapan kadar asam ursolat
AUC Kadar asam
Kadar rata-rata asam ursolat 0.0525 ± 0.0089
37
38 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN A. KESIMPULAN
1. Ekstrak daun tanaman binahong terbukti memiliki kandungan asam ursolat. 2. Kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun binahong adalah 0.0525 ±
0.0089 %b/b.
B. SARAN
1. Perlu dilakukan penetapan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong dengan sampel yang lebih luas.
2. Perlu dilakukan penetapan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong yang telah terstandarisasi.
39
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2007, The United States Pharmecopeia 30th The National Formulary 25th, Unites States Pharmacopeal Convention, inc., New York.
Cha, Hee-Jae, Soo-Kyung Bae, Ho-Young Lee, Anti-Invasive Activity of Ursolic Acid Correlates with the Reduced Expression of Matrix Metalloproteinase-9
(MMP-9) in HT1080 Human Fibrosarcoma Cells1,
http://cancerres.aacrjournals.org/cgi/reprint/56/10/2281.pdf, diakses tanggal 28
April 2010
Dirjen POM, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Gritter, R.J., Robbit, J.M., and Schwarting, A.E., 1985, Introduction to Chromatography, 12, 197, 206, 209, 213, 219, 227, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Edisi III, ITB, Bandung.
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, 5-7, 8, Departemen Farmasi FMIPA UI, Depok, Jakarta.
Haryono, Djoko, 1986, Sediaan Galenik, 12, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Hidayati, Isnaini Wahyu, 2009, Uji Aktifitas Salep Ekstrak Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) sebagai Penyembuh Luka Bakar Pada Kulit Punggung Kelinci, Skripsi, Universitas Muhammadiyah Surakarta Press, Surakarta
Johnson, E.L., Robert Stevenson, 1991, Basic Liquid Chromatography, diterjemahkan oleh Padmawinata, 1-27, 90-117, Institut Teknologi bandung, Bandung.
Kazakevich, Y. and Mc.Nair, H., 1996, Basic Liquid Chromatography, Textbook on HPLC, http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/, diakses pada tanggal 3 Mei 2010.
Lazuardhi, 2009, Binahong, http://www.lazuardhi.blogspot/binahong, diakses pada tanggal 28 April 2010
Liao, Qiongfeng, Wei Yang, Ying Jia, et al., 2005, LC-MS Determination and Pharmacokinetic Studies of Ursolic Acid in Rat Plasma after Administration of The Traditional Chinese Medicinal Preparation Lu-Ying Extract,
http://yakushi.pharm.or.jp/FULL_TEXT/125_6/pdf/509.pdf, diakses tanggal 28
Mulja, M., dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium Yang Baik, 71-76, Majalah Farmasi Airlangga, Surabaya.
Mulja, M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 6-7, 10-11, 26-27, 31-37, 40, Airlangga University Press, Surabaya.
Munson, J.W., 1991, Analisis Farmasi Metode Modern, 17, 23, 32-33, 44-48, diterjemahkan oleh Harjana, Airlangga University Press, Surabaya.
Mus, 2008, Informasi Spesies Binahong Anredera cordifolia (Ten.) Steenis.
http://www.plantamor.com/spcdtail.php?recid=1387, Diakses pada tanggal 19
Februari 2010
Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, 3-16, 31-33, Laboratorium Analisis Kimia dan Fisika Pusat UGM, Yogyakarta.
Olszewska, M., 2008, Optimization and Validation of an HPLC-UV Method for Analysis of Corosolic, Oleanolic, and Ursolic Acids in Plant Material:Application to Prunus serotina Ehrh., Acta Chromatographica, Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Medical University of Lodz, Poland
Paramita, 2008, Optimasi Formula Span 80 dan Tween 80 dalam cold cream Obat Luka Ekstrak Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) steenis) dengan Metode Simplex Lattice Design, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Sastrohamidjojo, H., 2002, Kromatografi, edisi kedua, 71, Liberty Yogyakarta, Yogyakarta.
Skoog, D.A., 1985, Principles of Instrumental Analysis, 3rd ed, 160, 182, CBS College Publishing, Japan.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, 2nd Edition, 27-29, , 40-42, 61-66, , 206-211, 430, 687-691, 695, John Wiley and Sons, Inc., New York.
Setyaningretry, 2007, Formulasi Gel Antiluka Ekstrak Daun Binahong (Anredera baselloides (Ten.) Steenis) dengan Basis Carbopol, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Uchida, S, 2003, Production of a digital map of the hazardous conditions of soil erosion for the sloping lands of West Java, Indonesia using geographic information systems (GIS), JIRCAS, Indonesia.
41
Wojciak, M. dan Kosior, 2007, Application of High Performance Thin-layer Chromatography to Separation of Oleanolic, Ursolic, and Betulinic Acids,
http://www.jpccr.eu/archive_pdf/2007_vol_1_nr_2/Wojciak_Kosior.pdf,
diakses tanggal 28 April 2010
42 LAMPIRAN
Lampiran 1. Pembuatan larutan stok dan seri larutan baku asam ursolat Pembuatan larutan stok asam ursolat
Ditimbang sebanyak 0,01 g baku asam ursolat, kemudian di-add dengan campuran kloroform-metanol 1:4 (v/v) hingga volumenya tepat 10 ml.
Tabel VIII. Penimbangan Baku Asam Ursolat 90%
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Berat alumunium foil 0.15631 0.13370 0.14145
Berat alumunium foil + zat 0.16647 0.14392 0.15154 Berat alumunium foil + sisa 0.15703 0.13393 0.14189
Berat zat 0.00944 0.00999 0.00965
Cara perhitungan konversi volume injek menjadi massa : Injek 2µl = 94.4 µg/ml x 2.10-3
43
= 0.5994 µg
45
= 0.7720 µg
Lampiran 2. Penetapan kurva baku
Data penetapan kurva baku Volume
Injek (µl)
47
Lampiran 3. Perhitungan LOD dan LOQ
Hasil perhitungan LOD dan LOQ
y = 676973.5169x – 4264.8
Sb ( ) = ′ = . = 703.3501
LOD = ( ) = .
. = 3.117x10
-3µg/ml
LOQ = ( ) = .
. = 0.0104 µg/ml
Massa (µg) y y’ (y’-y)2
0.1888 124308 123547.8 577904.04
0.3776 250582 251360.4 605906.56
0.5664 378897 379173 76176
0.7552 506832 506985.6 23592.96
0.9440 635246 634798.2 200524.84
Lampiran 4. Penimbangan daun binahong (Anredera cordifolia (Ten,) Steenis) kering
Kertas : 0.4020 gram Kertas + zat : 5.4022 gram Kertas + sisa : 0.4021 gram Zat : 5.0001 gram
Lampiran 5. Hasil penimbangan rendemen ekstrak daun binahong (Anredera cordifolia (Ten,) Steenis)
1. ekstraksi sampel I
Wadah : 284.874 gram Wadah + zat : 285.454 gram Wadah + sisa : 284.874 gram
Zat : 0.580 gram
b. ekstraksi sampel II
Wadah : 284.404 gram Wadah + zat : 285.325 gram Wadah + sisa : 284.404 gram
49
Lampiran 6. Perhitungan recovery, kesalahan acak, dan kesalahan sistemik Contoh perhitungan nilai recovery hasil spiking
Kurva baku asam ursolat replikasi I y = 676973.5169x - 4264.8 Nilai recovery pada konsentrasi bawah
y = 676973.5169x - 4264.8 132084 = 676973.5169x - 4264.8 X= 0.1007
Lampiran 7. Contoh perhitungan kadar asam ursolat berdasarkan parameter AUC
51
282074 = 676973.5169x - 4264.8 X = 0.4230 µg/50µl
Perhitungan kadar sampel 1. replikasi I
a. 0.6345 µg/50µl untuk per mikroliter = 0.6345/50 = 0.0126 µg/µl
b. 0.3968 µg/50µl untuk per mikroliter = 0.3968 /50 = 0.0079 µg/µl
2. replikasi II
a. 0.8652 µg/50µl untuk per mikroliter = 0.8652 /50 = 0.0173 µg/µl
b. 0.4026 µg/50µl untuk per mikroliter = 0.4026 /50 = 0.0080 µg/µl
3. replikasi III
a. 0.3801 µg/50µl untuk per mikroliter = 0.3801/50 = 0.0076 µg/µl
61
BIOGRAFI PENULIS
