TESIS. Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Magister Farmasi (M.Farm.) Program Studi Magister Farmasi

PEMODELAN DAN SIMULASI DINAMIKA MOLEKUL

HUMAN MATRIX

METALLOPROTEINASE

9

(hMMP9) UTUH SEBAGAI TARGET VIRTUAL

PENEMUAN LIGAN PADA

CATALYTIC SITE

MAUPUN

HEMOPEXIN-LIKE

DOMAIN

TESIS

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Magister Farmasi (M.Farm.)

Program Studi Magister Farmasi

Diajukan oleh:

Roy Gunawan Wicaksono, S.Farm. Nomor Induk Mahasiswa:

188122101

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2020

PEMODELAN DAN SIMULASI DINAMIKA MOLEKUL

HUMAN MATRIX

METALLOPROTEINASE

9

(hMMP9) UTUH SEBAGAI TARGET VIRTUAL

PENEMUAN LIGAN PADA

CATALYTIC SITE

MAUPUN

HEMOPEXIN-LIKE

DOMAIN

TESIS

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Magister Farmasi (M.Farm.)

Program Studi Magister Farmasi

Diajukan oleh:

Roy Gunawan Wicaksono, S.Farm. Nomor Induk Mahasiswa:

188122101

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2020

}ERSETUJUAN PEMBIMBING

PEMODELAN DAN SIMULASI

DINAMIKA

MIOLF]KTJL

HUMAN MATRD(

METALLOPROTEINASE 9 (hMNTPg)

IITUH

SEBAGAT TARGET VTRTUAL

PENEMUAN LIGAN PADA CATALYTIC

SITEiMAI|PIITN

HEMOPEXIN

DOfuLAIN

Tesis yang diajukan oleh:

Roy Crunawan Wicaksono, S.Farm. (f 88122101)

T€lah disetujui tar.ggdZr 19 ot"t,

Dosen ing Utarna

Enade Ph.D., Apt.

PENGESAIIAN TESIS BERJUDT]L

PEMODELAIT DAN

SIMULASI DINAMIKA MOLEKIJL

HUMAN

MATRD(

METALLOPROTEINASE 9 (htvfrvfp9) UTUH SEBAGAI TARGET

VIRTUAL

PENEMUAN LIGA}I PADA CITALYTIC SITE

MAUI{JN HEMOPHfiN-LIEE

DOMAIN

oleh:

Roy Gunawan Wicaksono, S.Farm. (188122101)

Dipertahankan di hadapan panitia penguji tesis Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Pada tanggal 23 lanuai 2020

Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Hartini, Apt.

Panitia Penguji:

l. Enade Perdana

Istyastono, Ph.D., Apt

2. Dr. Rini Dwiastuti, Apt. 3. Maywan Hariono, Ph.D., Apt.

tr!?

,: utl

>-_ _| {'2-_

HALAMAN PERSEMBAHAN

Tesis ini dipersembahkan untuk Tuhan Yesus Kristus, Ibu, Bapak,

Kakak , Adik, Novia Yosin dan teman-teman sehingga dapat

PERNYATAAN

KEASLLA.N

KARYA

Saya merryatakan dengan sesungguhnya bahrva tesis yang saya

tulis iui

tidak memuat

karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang

telah disebutkan

dalam

kutipan dan daftar pustaka, sebagaimaru layaknya karya ilmiah.

Apabila di

kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-undangan yang berlaku.

s/.10

Y ogyal(arta,

..../1.

.

LEMBAR PERNYATAAN

PERSETUJUAN

PUBLIKASI

IGRYA ILML{H

UNTUK KEPENTINGAN AKADEIUIS

Yang bertanda tangan di bawah

ini, saya

mahasiswa Universitas Sanata Dharma: Nama : Roy Gunawan Wicaksono. S.Farm.

Nomor

Mahasiswa :

188122101

Demi

pengembangan

_ilmu

pengekhuan,

saya memberikan kepada

perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang

be{udul "PEMODELAN DAN

.SIMULASI DINAMIKA MOLEKUL ITUMAN

MATRIX

'METALLOhROTEINASE

9

(hMMpg)

UTUH SEBAGAI

TARGET

I'IRTUAL

PENEMUAN

LIG,{N

PADA

CATALYTIC

SITE

MAUPUN

HEMOPEXIN

DOMAIN" beserta perangkat

yang diperlukan

(bila

ada). Dengan demikian saya

memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan

dalam bentuk

lain,

mengelolanya

dalam bentuk pangkalan

data, mendish'ibusikan secara terbatas, dan mempubli kasikannya

di intemet

atau media lain

untuk kepentingan akademis tanpa

perlu

meminta

izin

saya atau memberi royal4t

kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan

ini

saya buat dengan sebenar-benamya.

Dibuat di Yogyakarta Pada tang!;al

,/t, .19

Yang menyatakan,

)tt

ftM-t

€el

PRAKATA

Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas

berkat dan rahmat kasih-Nya penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul

“

PEMODELAN DAN SIMULASI DINAMIKA MOLEKUL

HUMAN MATRIX

METALLOPROTEINASE

9

(hMMP9) UTUH SEBAGAI TARGET VIRTUAL

PENEMUAN LIGAN PADA

CATALYTIC SITE

MAUPUN

HEMOPEXIN-LIKE

DOMAIN

”

dengan baik dan lancar. Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat

memperoleh gelar Magister Farmasi (M.Farm.) Program Studi Magister Farmasi.

Penulis berharap agar tesis ini dapat berguna bagi para pembaca, menjadi sumber

pengetahuan tentang dinamika molekul pada MMP-9 dan menjadi inspirasi untuk

melakukan penelitian yang lebih berkembang nantinya.

Penulis tesis ini tidak lepas dari banyak bantuan, dukungan, semangat, dan saran

dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1.

Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Santa Dharma.

2.

Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Kaprodi Magister Farmasi Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma.

3.

Bapak Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing yang

telah memberikan ilmu, saran dan bimbingan dengan sabar dalam penelitian ini.

4.

Ibu Dr. Rini Dwiastuti, Apt. selaku dosen penguji yang telah bersedia

memberikan saran bagi penelitian ini.

5.

Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen penguji yang telah bersedia

memberikan saran bagi penelitian ini.

6.

Keluarga penulis yang telah memberikan doa, semangat dan dukungan.

7.

Mas F.A Ottok yang telah membantu kelancaran dalam penelitian tesis.

8.

Teman-teman Magister Farmasi yang telah memberika ilmu dan saran.

9.

Novia Yosin Parura yang selalu memberi dukungan dan semangat kepada

penulis selama kuliah dan selalu mendampingin saat penulis membutuhkan

bantuan.

membangun

dari para

pembaca.

Akhir

kata, semoga tesis

ini

dapat bermanfaat dan selamat membaca.

.

9/

c.o YogJlakarta,

/r

.

. Penulis,

4+

Roy Gunawan Wicaksono. S.Farm.

DAFTAR ISI

PERSETUJUAN PEMBIMBING...i

HALAMAN PENGESAHAN...ii

HALAMAN PERSEMBAHAN...iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA...iv

LEMBAR PERNYATAAN PUBLIKASI...v

PRAKATA...vi

DAFTAR ISI...viii

DAFTAR GAMBAR...x

DAFTAR LAMPIRAN...xi

INTISARI...xii

ABSTRACT

...xiii

1. PENDAHULUAN...1

2. TINJAUAN PUSTAKA...2

2.1

Matrix Metalloproteinase 9

...2

2.2

Catalytic Site

dan

Hemopexin Domain

...3

2.3 MMP-9 Sebagai Target Molekul Dalam Penyembuh Luka...4

2.4 MMP-9 Sebagai Target Molekul Dalam Terapi Kanker...5

3. METODE PENELITIAN...7

3.1 Bahan dan Instrumen...7

3.1.1 Bahan...7

3.1.2 Instrumen...7

3.2 Tahapan Simulasi...7

3.2.1 Preparasi...7

3.3.2 Analisis Hasil...8

4. HASIL DAN PEMBAHASAN...8

4.1 Kualitas Hasil Pemodelan Homologi...9

4.2 Stabilitas MMP-9 Terhadapat Ligan...10

4.3

The Free Energy of Binding

(

ΔG bind)

...

11

5. KESIMPULAN DAN SARAN...12

6. DAFTAR PUSTAKA...13

7. BIOGRAFI PENULIS...18

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur

Matrix Metalloproteinase

9

...2

Gambar 2. Sruktur

Hemopexin-like domain...

3

Gambar 3. Visualisasi

Catalytic site

interaksi sistein dengan Zn yang menjaga enzim

dalam keadaan tidak aktif...4

Gambar 4. Struktur N-2-(biphenyl-4-ylsulfonyl)-N-2(isopropyloxy)-acetohydroxamic

(CC27)...5

Gambar 5. Visualisasi

Catalytic site

dengan ligan CC27 (cyan), HIS

401

_{, HIS}

405

_{, HIS}

411

(biru), GLU

402

_{(merah) dan Zn (ungu)...5}

Gambar 6. Dimer

hemopexin-like domain...6

Gambar 7. Struktur senyawa Duf-02 sebagai inhibitor PEX...6

Gambar 8. Visualisasi

Hemopexin-like domain

dengan SO

4

(kuning), GLN

666

(hijau),

ARG

618

_{(biru), GLU}

572

_{dan GLU}

526

_(merah)...7

Gambar 9. Nilai RMSD

backbone

MMP-9 (kiri) dan RMSD tiap 5ns (kanan); (A)

MMP-9 CC27, (B) MMP-9 Duf-02 dan (C) MMP-9 tanpa ligan secara

berurutan...10

Gambar 10.

The free energy of binding

CC27 dengan MMP-9 selama 5,05 ns hingga

10.05 ns dengan nilai terendah -12,75 kcal/mol pada 6,40 ns...11

Gambar 11. Visualisasi 1000 pose ligan hasil penambatan molekul...12

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 8.1. Status makalah ilmiah dan makalah ilmiah...18

Lampiran 8.2.

md_run_20ns_20ss.mcr...

28

Lampiran 8.3.

becalculation.mcr

...36

INTISARI

Enzim

Matrix Metalloproteinase 9

(

MMP-9) berpotensi sebagai target ligan

untuk penemuan obat kanker ataupun penyembuh luka pada

Diabetic Foot Ulcer

(DFU)

.

Saat ini, belum terdapat kristal struktur dari MMP-9 secara utuh, sehingga

simulasi pemodelan MMP-9 dalam penemuan ligan hanya menggunakan fragmen dari

MMP-9 baik

catalytic site

maupun

hemopexin-like domain

(PEX). Struktur MMP-9

secara utuh dapat dibuat model 3 dimensi menggunakan pemodelan homologi. Model

MMP-9 secara utuh dapat digunakan dalam penemuan ligan baik pada

catalytic site

maupun PEX.

Tujuan dari penelitian ini untuk membuat target virtual MMP-9 secara utuh

dalam penemuan ligan baik pada

catalytic site

maupun PEX. Simulasi pemodelan

molekul model MMP-9 dilakukan menggunakan YASARA-structure

dengan

AMBER14

force field.

Simulasi pemodelan molekul dilakukan hingga 20 ns dengan

snapshot

10 ps. Hasil simulasi dianalisis secara semi kuantitatif dengan melihat: (1)

Kualitas model homologi (i) kebenaran dari enantiomer; (ii) tidak adanya ikatan

cis

-peptida; (iii) kesesuaian penamaan; (iv) panjang ikatan; (v) sudut ikatan; (vi) sudut

dihedral; (vii) gugus planar. (2)

Stabilitas MMP-9 berdasarkan nilai RMSD backbone

tiap 5 ns, apabila RMSD backbone selama 5 ns dibawah 1Å maka MMP-9 dengan ligan

dikatakan stabil. (3) The free energy of binding (ΔG bind) masing-masing simulasi

dihitung menggunakan macro YASARA-structure. (4)

Nilai RMSD hasil penambatan

ulang dihitung untuk melihat hasil penambatan yang reprodusibel dengan nilai

≤

2

Å

.

Hasil pemodelan molekul MMP-9 dengan ligan Duf-02 dan tanpa ligan tidak

stabil. Hanya MMP-9 dengan ligan CC27 yang stabil dengan mencapai

equilibrium

pada 5,05 ns, MMP-9 telah mencapai

equilibrium

apabila RMSD

backbone

tiap 5ns

dibawah 1

Å.

The free energy of binding

terendah pada pose waktu 6,40 ns dengan nilai

-12,75 kcal/mol. Hasil penambatan ulang ligan pada pose waktu 6,40 ns memiliki hasil

yang reprodusibel dengan RMSD penambatan ulang 1000 kali berada di bawah 2

Å.

Kesimpulan dari hasil penelitian yang dilakukan bahwa model yang dibuat dapat

digunakan sebagai target penapisan virtual pada

catalytic site.

Kata kunci:

MMP-9,

catalytic site

,

hemopexin-like domain

, pemodelan molekul,

YASARA-structure

ABSTRACT

Matrix Metalloproteinase 9 (MMP-9) enzyme has the potential as a

ligand-target for the drug discovery of cancer or wounds healing in Diabetic Foot Ulcer

(DFU). At present, there is no complete crystal structure of MMP-9, so the MMP-9

modeling simulation in the ligand drug discovery only uses fragment from MMP-9 both

the catalytic site and hemopexin-like domain (PEX). The whole MMP-9 structure can

be made in the 3-dimensional model using homology modeling. The whole MMP-9

model can be used in ligand drug discovery at the catalytic site and PEX.

This study aims to create a full model MMP-9 as a virtual target in ligand drug

discovery at the catalytic site and PEX. Molecular dynamics simulation of MMP-9

models using YASARA-structure with an AMBER14 force field. Molecular dynamics

simulations running to 20 ns with a 10 ps snapshot. The results of simulations are

analyzed semi-quantitatively by looking at: (1) The quality of the homology model (i)

the truth of the enantiomer; (ii) absence of cis-peptide bonds; (iii) appropriateness of

naming; (iv) bond length; (v) bond angles; (vi) dihedral angle; (vii) planar groups. (2)

The stability of MMP-9 based on the RMSD backbone value every 5 ns, if the RMSD

backbone in 5 ns is below 1Å then MMP-9 with ligands is stable. (3) The free energy of

binding (ΔG bind) of each simulation is calculated using the YASARA-structure macro.

(4) The RMSD result from redocking is calculated to see the reproducible of docking,

reproducible if the RMSD redocking below ≤ 2Å.

The results of molecular modeling of MMP-9 with Duf-02 ligand and without

ligand are unstable. Only MMP-9 with CC27 ligand was stable by reaching equilibrium

at 5.05 ns, MMP-9 has reached equilibrium if the RMSD backbone every 5ns is below

1Å. The lowest free energy of binding at time 6.40 ns with a value of -12.75 kcal/mol.

Ligand redocking at 6.40 ns is reproducible, with 1000 times of RMSD redocking being

under 2Å. The conclusion from the results of this research that the model can be used as

a target virtual screening on a catalytic site.

Keywords:

MMP-9, catalytic site, hemopexin-like domain, molecular modeling,

YASARA-structure

1.PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Human matrix metalloproteinases

(hMMPs) merupakan enzim yang berperan

dalam proses

remodeling

extracellular matrix

(ECM) dan membran dasar

1

_{. Enzim}

MMPs tersusun dari

regulatory

,

catalytic site

dan

hemoxpexin-like domain

2

_.

Berdasarkan substrat enzim MMPs dikategorikan menjadi

collagenase

,

gelatinase

,

stromelysis

,

matrilysins

dan

membrane

-

types

3

_{. Enzim MMP-9 yang termasuk}

_gelatinase

merupakan suatu protein yang berfungsi mendegradasi

extracellular matrix

dan ikut

berperan dalam proses penyembuhan luka. Aktivitas MMP-9 yang tidak terkontrol akan

menyebabkan proses penyembuhan luka menjadi lambat pada komplikasi penyakit

kronis seperti

Diabetic Foot Ulcer

(DFU)

4

_{. Enzim MMP-9 berpotensi sebagai target}

protein dalam penemuan obat penyembuh luka pada DFU

5

_{. Penyembuhan luka}

ditargetkan pada

catalytic site

dengan menghambat sisi

catalytic site

untuk

mendegradasi ECM, sehingga membantu proses penyembuhan luka pada penderita

diabetes. Selain sebagai target penyembuh luka MMP-9 juga digunakan sebagai target

dalam anti kanker

2

_{. Diketahui bahwa ekspresi berlebih dari MMP-9 memiliki korelasi}

terhadap proliferasi dan peningkatan ukuran sel kanker

6

_.

_{Hemopexin-like domain}

_(PEX)

pada MMP-9 akan berinteraksi dengan reseptor

clusters of differentiation

44 (CD44)

dan memicu proliferasi sel

7

_{. Suatu ligan inhibitor PEX}

_{akan menghambat pembentukan}

dimer, sehingga tidak dapat berinteraksi dengan reseptor CD44 dan proliferasi sel tidak

terjadi

8

_.

Selama ini penghambatan MMP-9 secara umum ditargetkan pada

catalytic site.

Namun, adanya homologi yang tinggi pada

catalytic site

pada semua MMP

menyebabkan target menjadi tidak selektif

35

_{. Semua kerja MMP menjadi dihambat,}

padahal MMP juga dibutuhkan dalam memetabolisme senyawa di dalam tubuh seperti

inflamasi

11

_{. Ketidak selektifan ini berdampak pada gagalnya hampir semua MMP}

inhibitor pada fase klinik. Ke gagalan pada fase klinik dikarenakan munculnya efek

samping yaitu nyeri otot. Karena itu, dikembangkan target lain dari MMP9 yang

mempunyai homologi cukup rendah.

Hemopexin-like domain

pada

MMP-9

hanya

memiliki 25% kemiripan dengan MMP yang lain. Sehingga

hemopexin-like domain

menjadi target yang berpotensi sebagai inhibitor MMP-9

17

_.

Pemodelan molekul dalam penemuan ligan dengan target MMP-9 tidak

menggunakan struktur MMP-9 secara utuh, dikarenakan hingga saat ini belum terdapat

kristal struktur MMP-9 secara utuh

9

_{. Sehingga pemodelan molekul hanya menggunakan}

fragmen dari MMP-9 baik

catalytic site

maupun PEX. Simulasi pemodelan molekul

yang dilakukan secara terpisah tersebut menyebabkan tidak dapat diketahui afinitas

ligan tersebut berada pada

catalytic site

atau PEX

10

_.

Penelitian pemodelan molekul penemuan ligan pada MMP-9 dilakukan dengan

ligan ditambatkan pada masing-masing sub unit pada MMP-9 utuh. Tujuan dari

penelitian ini untuk memodelkan target virtual MMP-9 secara utuh sebagai target

penemuan ligan baik pada

catalytic site

maupun PEX. Hasil pemodelan ini diharapkan

dapat digunakan sebagai target virtual pemodelan molekul untuk penemuan ligan yang

spesifik pada

catalytic site

maupun PEX. Luaran yang diharapkan dari penelitian ini

adalah publikasi artikel ilmiah, setidaknya di jurnal nasional terakreditasi.

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Matrix Metalloproteinase 9

Enzim

matrix metalloproteinase 9

(MMP-9) merupakan proteinase yang

berfungsi mendegradasi

extracellular matrix

(ECM)

11

_{. Enzim MMP-9 memiliki struktur}

terdiri dari

propeptide

,

catalytic site

,

fibronectin,

linker

dan

hemopexin-like domain

(PEX) (Gambar 1)

5

_{. Enzim MMP-9 dibentuk dalam keadan}

_zymogen

_{(tidak aktif)}

12

_.

Propeptide

menjaga MMP-9 dalam keadaan tidak aktif dengan adanya interaksi sistein

dengan Zn

3

_{. Ketika ada substrat yang akan masuk, interaksi sistein dengan Zn akan}

putus dan MMP-9 menjadi aktif.

Catalytic site

merupakan bagian dari sisi aktif yang

memiliki Zn dan berperan dalam proses enzimatiknya

11

_.

Gambar 1. Struktur Matrix Metalloproteinase9

Enzim MMP-9 secara normal dalam proses fisiologis memiliki peran sebagai perbaikan

sel, proliferasi, migrasi dan angiogenesis bahkan penyembuhanan luka

13

_{. Dalam}

Propeptide Catalytic site Linker Hemopexin domain

penyakit kanker terdapat peningkatan ekspresi MMP-9 yang berpengaruh dalam

penyebaran sel kanker

14

_{dan peningkatan ekspresi MMP-9 memiliki korelasi terhadap}

proliferasi dan peningkatan ukuran sel kanker

15

_{. Inhibitor MMP-9 menghambat migrasi}

dan proliferasi sel dengan cara mengganggu pembentukan dimer PEX

sehingga sinyal

kepada reseptor

clusters of differentiation

44 untuk mengalami migrasi dan proliferasi

tidak terjadi

13

_.

2.2

Catalytic Site

dan

Hemopexin-like Domain

Hemopexin-like domain

(PEX) berupa

4

beta-propeller

dihubungkan dengan

catalytic site

oleh

hinge

/

linker region

yang fleksibel

16

_{(Gambar 2).}

_{Sub unit}

_{PEX akan}

membentuk dimer dan berinteraksi dengan reseptor

clusters of differentiation

44 pada

permukaan membran sel. Interaksi yang tejadi akan memicu sel mengalami proliferasi

sehingga sel kanker dapat tumbuh dan menyebar

17

_{. Suatu senyawa inhibitor PEX akan}

menghambat pembentukan dimer PEX. Penurunan kadar MMP-9 menunjukkan

penurunan ukuran dan metastasis dari sel kanker, oleh karena itu penemuan obat kanker

didesain sebagai inhibitor PEX

18

_.

Gambar 2. Struktur Hemopexin domain19

Catalytic site

merupakan sisi aktif dari MMP-9 yang berperan mendegradasi

extracellular matrix

11

_{dan memiliki ion Zn sebagai kofaktor}

3

_.

_{Catalytic site}

_biasa

digunakan sebagai target penyembuh luka dengan menghambat proses enzimatiknya

20

_.

Interaksi sistein dengan Zn menjaga enzim tidak aktif, ketika interaksi tersbut terputus

kantung ikatan pada

catalytic site

seolah-olah terbuka dan MMP-9 menjadi aktif

(Gambar 3). Substrat yang masuk ke dalam

catalytic site

akan dihidrolisis dengan

adanya molekul air yang berinteraksi dengan asam glutamat dengan bantuan Zn

7

_.

_Secara

normal mekanisme kerja enzim MMPs akan dihambat oleh endogen spesifik seperti

tissue inhibitor of metalloproteinases

(TIMPs)

1

_.

Gambar 3. Visualisasi Catalytic site interaksi sistein dengan Zn yang menjaga enzim dalam keadaan tidak aktif21

2.3 MMP-9 Sebagai Target Molekul Dalam Penyembuh Luka

Pada hari pertama luka MMP-9 disekresikan oleh sel inflamasi dan

membersihkan luka dari

extracellular matrix

(ECM) yang rusak

6

_{. Ketika MMP-9}

mendegradasi ECM, respon inflamasi akan terjadi hal ini karena mediator inflamasi

seperti prostalglandin dan bradikinin terlepas saat degradasi ECM

11

_{. Selain}

mendegradasi ECM, enzim MMP-9 juga berperan dalam pembentukan dari membran

sel

22

_{. Selama perbaikan}

_{sel MMP-9 juga berperan dalam mendegradasi matrik yang}

tidak beraturan. Aktivitas MMP-9 yang tidak terkontrol akan mempengaruhi

keseimbangan penghancuran dan pembentukan membran sel. Penghancuran membran

sel yang tidak dihambat akan menurukan proses penyembuhan

luka

23

_.

Penemuan ligan sebagai inhibitor MMP-9 dalam penyembuh luka ditargetkan

pada

catalytic site

24

_{dengan membuat enzim menjadi tidak aktif. Asam amino penting}

pada pada

catalytic site

adalah HIS

401

_{, HIS}

405

_{dan HIS}

411

_{dan GLU}

402

_{. Interaksi yang}

penting sebagai inhibitor MMP-9 pada

catalytic site

adalah interaksi phi-phi antara

gugus aromatis pada ligan dengan histidin, interaksi ion dengan Zn dan interaksi

hidrogen dengan glutamat

25

_.

Salah satu ligan yang diketahui sebagai inhibitor MMP-9 pada

catalytic site

adalah

N-2-(biphenyl-4-ylsulfonyl)-N-2(isopropyloxy)-acetohydroxamic

yang memiliki

IC

50

200nM (Gambar 4)

.

Ligan tersebut memiliki gugus aromatis yang berinteraksi

(Gambar 5). Salah satu ciri ligan inhibitor

catalytic site

pada MMP-9 yaitu memiliki

gugus hidroxamat. Ligan yang berada pada

catalytic site

akan bersifat kompetitif

menyebabkan substrat tidak dapat masuk

26

_.

Gambar 4.Struktur N-2-(biphenyl-4-ylsulfonyl)-N-2(isopropyloxy)-acetohydroxamic (CC27)

Gambar 5. Visualisasi Catalytic site dengan ligan CC27 (cyan), residu HIS401_{, HIS}405 _dan HIS411 _{(biru), GLU}402 _{(merah) dan Zn (ungu)}

2.4 MMP-9 Sebagai Target Molekul Dalam Terapi Kanker

Penelitian awal mengenai obat kanker berfokuskan pada cara untuk membunuh

sel kanker, akan tetapi kebanyakan sel normal ikut terbunuh dan sel kanker tetap

resisten

6

_{. Pada tahun 90-an, MMP-9 telah teridentifikasi dan berpotensi sebagai target}

penemuan ligan untuk obat kanker

25

_{. Saat ini, penemuan obat kanker didesain sebagai}

inhibitor

hemopexin-like domain

(PEX) untuk menghambat aktivitas MMP-9

27

_.

Sub unit

PEX akan membentuk dimer (Gambar 6) dan berinteraksi dengan

reseptor

clusters of differentiation

44 (CD44) pada permukaan sel

28

_{. Interaksi antara}

PEX dengan reseptor CD44 akan mengaktivasi

epidermal growth factor receptor

(EGFR) menyebabkan sel mengalami proliferasi

6

_{. Ekspresi MMP-9 yang tidak}

terkontrol akan menyebabkan sel kanker tumbuh tidak terkendali

12

_.

Gugus hidroxamat Cincin

Salah satu ligan yang diketahui sebagai inhibitor MMP-9 dan telah diuji adalah

senyawa sintesis oleh Dufour

et al.

(Gambar 7). Struktur senyawa Duf-02 memiliki

gugus aril amida dan hidrofobik yang mampu berikatan pada kantung ikatan

hemopexin-like domain.

Gugus aril amida akan berada didalam kantung ikatan diantara

4 bilah dikarenakan memiliki gugus amida yang menyerupai substrat. Gugus -NH dari

aril amida akan berinteraksi hidrogen dengan GLU

618

_{. Selain itu terdapat atom polar}

seperti O maupun N pada cincin planar yang mampu berinteraksi dengan ARG

618

_{. Ligan}

tersebut bekerja dengan mencegah pembentukan dimer yang berinteraksi secara

hidrofobik sehingga PEX tidak dapat berinteraksi dengan reseptor CD44

7

_{. Bagian}

penting

hemopexin-like domain

terletak pada

blade

4 dengan ARG

618

_{yang berinteraksi}

dengan SO

4.

. Asam amino yang diduga penting sebagai target ligan adalah GLN

666

,

ARG

618

_{, GLU}

572

_{dan GLU}

526

_{. Inhibitor PEX untuk obat kanker mencegah agar}

proliferasi sel kanker tidak terjadi dan mencegah terjadinya pertumbuhan serta

metastasis dari sel kanker

18

_.

Gambar 6. Dimer hemopexin-like domain

Gambar 7. Struktur senyawa Duf-02 sebagai inhibitor PEX

Aril amida

Cincin planar

Gugus hidrofobik

Gambar 8.Visualisasi Hemopexin-like domain dengan SO4 (kuning) dan residu GLN666 (hijau), ARG618 _{(biru), GLU}572 _{dan GLU}526 _(merah)

3. METODE PENELITIAN

3.1 Bahan dan Instrumen

3.1.1 Bahan

File

pdb

berisi struktur model MMP-9 utuh hasil pemodelan homologi

menggunakan YASARA-structure

32

_{yang diambil dari doi}

_{:10.17632/xj7yt48jwb.1}

33

_.

Ligan yang digunakan berupa ligan CC27 (Gambar 4) dari kristal struktur

4H3X.pdb

yang diambil dari Protein Data Bank (PDB; https://www.rcsb.org/) dan senyawa

(Gambar 7) yang diuji oleh Dufour

et al

20

_.

3.1.2 Instrumen

Simulasi pemodelan molekul menggunakan perangkat lunak YASARA-structure

versi 19.1.27.

Force field

yang digunakan dalam simulasi menggunakan AMBER14.

Server Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma (IP 172.23.1.176) dengan

spesifikasi sistem operasi Linux dengan 16

core

RAM 16 GB dan komputer lab kimia

komputasi dengan

processor

Intel® Core

TM

_{i5-7500, 8 GB RAM dengan sistem operasi}

Windows 10 professional 64-bit.

3.2 Tahapan Simulasi

3.2.1 Preparasi

Masing-masing ligan CC27 dan Duf-02 ditambatkan pada

catalytic site

dan

hemopexin-like domain

model MMP-9. Ruang penambatan molekul pada

catalytic site

ditentukan 5

Å

dari ligan CC27 yang telah ada pada model MMP-9 sedangkan

hemopexin-like domain

5 A dari asam amino ARG

574

_{. Pemilihan ARG}

574

_{sebagai center}

dikarenakan ARG

574

_{berada di antara asam amino GLN}

666

_{, ARG}

618

_{, GLU}

572

_{dan GLU}

526

_.

Sehingga terdapat 4 sistem yang dilakukan dinamika molekul selama 20 ns

menggunakan macro

md_run_20ns_ss10.mcr

(Lampiran 8.2)

29

_{. Hasil simulasi dinamika}

molekul

selanjutnya dianalisis menggunakan

md_analyze.mcr

standar bawaan

YASARA-structure

untuk melihat RMSD. Hasil dinamika molekul selama 5 ns setelah

mencapai

equilibrium

diambil untuk dianalisis

The free energy of binding (ΔG)

34

_.

_Pose

waktu model MMP-9 yang memiliki energi terendah kemudian diambil dan digunakan

sebagai target penambatan molekul ligan sebanyak 1000 kali menggunakan macro

dock_run_1000.mcr

(Lampiran 8.4).

3.3.2 Analisis Hasil

Analisis secara semi kuantitatif dilakukan dengan melihat: (1) Kualitas model

homologi yang telah dilakukan dinamika molekul selama 10 ns; (i) kebenaran dari

enantiomer; (ii) tidak adanya ikatan

cis

-peptida; (iii) kesesuaian penamaan; (iv) panjang

ikatan; (v) sudut ikatan; (vi) sudut dihedral; (vii) gugus planar

32

_{. (2) Stabilitas MMP-9}

dianalisis dengan menghitung nilai

root mean square deviation

(RMSD)

backbone

tiap

5 ns, jika RMSD backbone ≤ 2Å selama 5 ns maka dianggap MMP-9 telah stabil

30

_.

Apabila RMSD backbone tidak berada di bawah 2Å selama 5 ns, maka MMP-9

dikatakan tidak stabil dan tidak dilakukan analisis binding energi. (3) The binding free

energy (ΔG) dihitung menggunakan becalculation.mcr (Lampiran 8.3). (4)

Reprodusibel penambatan

ligan dilihat dengan menghitung RMSD penambatan ulang

dibanding pose ligan pada pose binding energi terendah (ligan referensi) menggunakan

dock_run_1000.mcr

(Lampiran 8.4), dikatakan reprodusibel jika nilai RMSD

≤ 2Å

31

_.

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk membuat target virtual yang dapat digunakan

sebagai penapisan virtual MMP-9. Target yang dibuat berupa model MMP-9 secara

utuh sebagai target penapisan virtual baik pada

catalytic site

maupun

hemopexin-like

domain

. Ligan CC27 dan senyawa Duf-02 ditambatkan pada masing-masing sub unit.

Selanjutnya MMP-9 dengan ligan yang berada pada masing-masing kantung ikatan

dilakukan dinamika molekul selama 20 ns. Simulasi tanpa adanya ligan ditambahkan

sebagai pembanding pengaruh adanya ligan terhadap stabilitas MMP-9.

Dinamika molekul MMP-9 dengan ligan CC27 maupun Duf-02 pada

hemopexin-like domain

tidak dapat dianalisis. Tidak adanya ligan referensi pada

kantung ikatan

hemopexin-like domain

menyebabkan tidak diketahuinya letak kantung

secara spesifik. Sehingga penambatan molekul pada

hemopexin-like domain

yang

dilakukan berdasarkan prediksi pada ARG

574

_{sebagai pusat. Ligan yang di tambatkan}

pada sisi yang kurang tepat kemungkinan menyebabkan terjadinya interaksi yang tidak

dapat diprediksi oleh YASARA-structure. Dinamika molekul dengan kedua ligan yang

ditambatkan pada

hemopexin-like domain

tersebut tidak dapat dianalisis oleh

YASARA-structure

.

4.1 Kualitas Hasil Pemodelan Homologi.

Model yang yang telah dibuat tidak terdapat kesalahan penamaan. Panjang

ikatan, sudut ikatan, sudut dihedral dan gugus planar tidak lebih kecil dari -2 (Tabel 1).

Terdapat 2 ikatan

cis-

peptida pada model MMP-9 yang dibuat

.

Adanya ikatan

cis

-peptida terdapat pada PRO

553

_{dan PRO}

598

_{. Dua ikatan}

_cis-

_peptida

_{tersebut berada pada}

hemopexin-like domain

. Ikatan

cis-

peptida prolin masih dapat diterima. Secara

keseluruhan kualitas model MMP-9 utuh yang dibuat cukup baik.

Tabel 1. Hasil analisis kualitas model pemodelan homologi

Kualitas Model Homologi

32

Parameter

Nilai

Kebenaran enantiomer 0 (> 0 bad)

Adanya ikatan cis-peptida 2 cis-peptida prolin (> 0 bad ) Kesesuaian penamaan 0 (> 0 bad)

Panjang ikatan 0,727 (< -2 poor, < -4 bad) Sudut ikatan 0,183 (< -2 poor, < -4 bad) Sudut dihedral 0,176 (< -2 poor, < -4 bad) Gugus planar 0,505 (< -2 poor, < -4 bad)

4.2 Stabilitas MMP-9 Terhadap Ligan

Simulasi dinamika molekul MMP-9 dikatakan stabil apabila selama 5 ns nilai

RMSD

backbone

tiap 5 ns di bawah 1

Å

30

_{. Nilai RMSD}

_backbone

_{tiap 5 ns pada}

_MMP-9

dengan ligan Duf-02 dan tanpa ligan tidak ada yang di bawah 1

Å selama 5 ns.

Oleh

karena itu MMP-9 dengan ligan Duf-02 dan tanpa ligan dinyatakan tidak stabil.

Sedangkan RMSD MMP-9 dengan ligan CC27 setelah 5,05 ns berada dibawah 1

Å

hingga 20 ns. Pada 0 ns hingga 5,05 ns dianggap merupakan proses equilibrium dan

setelah 5,05 ns MMP-9 dengan ligan CC27 telah stabil

(Gambar 9). Adanya ligan CC27

pada

catalytic site

meningkatkan stabilitas dari MMP-9 dibanding MMP-9 tanpa ligan.

Ligan Duf-02 kemungkinan besar tidak menempati kantung ikatan

catalytic site

karena

selama 20 ns MMP-9 tidak stabil. Ligan Duf-02 kemungkinan menempati sisi kantung

ikatan lain pada MMP-9.

Gambar 9.Nilai RMSD backbone (kiri) dan RMSD tiap 5ns (kanan); (A) MMP-9 ligan CC27, (B) MMP-9 ligan Duf-02 dan (C) MMP-9 tanpa ligan secara berurutan

4.3

The Binding Free Energy

(

ΔG bind)

Simulasi dinamika molekul MMP-9 dengan ligan CC27 selanjutnya dilakukan

analisis

the binding free energy

. Model MMP-9 dengan ligan Duf-02 tidak dilakukan

analisis binding energi karena MMP-9 tidak stabil selama simulasi. Hasil analisis

binding energi ligan CC27 dengan MMP-9 didapat nilai terendah -12,75 kcal/mol pada

waktu 6,40 ns (Gambar 10).

Gambar 10. The free energy of binding CC27 dengan MMP-9 selama 5,05 ns hingga 10.05 ns dengan nilai terendah -12,75 kcal/mol pada 6,40 ns

4.4 Penambatan Ligan

Pose MMP-9 yang memiliki energi terendah kemudian digunakan sebagai target

penapisan virtual. Ligan CC27 dilakukan penambatan ulang sebanyak 1000 kali pada

pose waktu 6,40 ns. Hasil 1000 pose penambatan ulang ligan dibandingkan dengan pose

ligan pada waktu 6,40 ns untuk megetahui reprodusibilitas dari penambatan.

Penambatan ligan dikatakan reprodusibel apabila RMSD ligan hasil penambatan ulang

dibanding ligan referensi (pose ligan pada 6,40 ns) di bawah 2

Å

31

_{. Nilai RMSD semua}

ligan hasil penambatan ulang dibanding ligan referensi yang diperoleh di bawah 1

Å

dengan nilai RMSD tertinggi 1.275

Å

. Dari hasil RMSD tersebut penambatan ulang

ligan pada pose 6,40 memiliki hasil reprodusibel. Sehingga hasil pemodelan molekul

yang diperoleh dapat digunakan sebagai target virtual untuk penapisan virtual MMP-9

pada

catalytic site

.

Gambar 11. Visualisasi 1000 pose ligan (cyan) hasil penambatan molekul

5. KESIMPULAN DAN SARAN

Berdasarkan protokol yang telah dilakukan hasil model MMP-9 dapat digunakan

sebagai target penapisan virtual pada

catalytic site

, akan tetapi tidak untuk

hemopexin-like domain

. Perlu dilakukan analisis pada

hemopexin-like domain

menggunakan

tools

lain seperti

plugin

trajectory pada VMD dan/atau dilakukan pemodelan homologi

dengan

hemopexin-like domain

yang telah ditambah ligan.

Hemopexin domain

dengan

adanya ligan pada kantung ikatan akan memastikan ligan yang ditambatkan tepat pada

tempatnya.

6. DAFTAR PUSTAKA

111

1.

Keeling J, Herrera GA. Human matrix metalloproteinases: Characteristics and

pathologic role in altering mesangial homeostasis.

Microsc Res Tech

.

2008;71(5):371-379. doi:10.1002/jemt.20565

2.

Roeb E, Schleinkofer K, Kernebeck T, Pötsch S, Jansen B, Behrmann I, Matern

S, Grotzinger J. The matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) hemopexin domain is a

novel gelatin binding domain and acts as an antagonist.

J Biol Chem

.

2002;277(52):50326-50332. doi:10.1074/jbc.M207446200

3.

Hidalgo M, Eckhardt SG. Development of matrix metalloproteinase inhibitors in

cancer therapy.

J Natl Cancer Inst

. 2001;93(3):178-193.

doi:10.1093/jnci/93.3.178

4.

Ayuk SM, Abrahamse H, Houreld NN. The role of matrix metalloproteinases in

diabetic wound healing in relation to photobiomodulation.

J Diabetes Res

.

2016;2016:1-9. doi:10.1155/2016/2897656

5.

Vandooren J, Knoops S, Buzzo JLA, Boon L, Martens E, Opdenakker G,

Kolaczkowska E. Differential inhibition of activity, activation and gene

expression of MMP-9 in THP-1 cells by azithromycin and minocycline versus

bortezomib: a comparative study.

PLoS One

. 2017;12(4):1-19.

doi:10.1371/journal.pone.0174853

6.

Farina AR, Mackay AR. Gelatinase B/MMP-9 in tumour pathogenesis and

progression.

Cancers (Basel)

. 2014;6(1):240-296. doi:10.3390/cancers6010240

7.

Ezhilarasan R, Jadhav U, Mohanam I, Rao JS, Gujrati M, Mohanam S. The

hemopexin domain of MMP-9 inhibits angiogenesis and retards the growth of

intracranial glioblastoma xenograft in nude mice.

Int J Cancer

.

2009;124(2):306-315. doi:10.1002/ijc.23951

8.

Gentile E, Liuzzi GM. Marine pharmacology: therapeutic targeting of matrix

metalloproteinases in neuroinflammation.

Drug Discov Today

. 2017;00(00):1-15.

doi:10.1016/j.drudis.2016.09.023

9.

Hou J, Wang Y, Gao W, Yao W, Yao Q, Zhang J. Screening for the selective

inhibitors of MMP-9 from natural products based on pharmacophore modeling

and molecular docking in combination with bioassay experiment, hybrid

QM/MM calculation, and MD simulation.

J Biomol Struct Dyn

. 2018;0(0):1-15.

doi:10.1080/07391102.2018.1509019

10.

Kaczanowski S, Zielenkiewicz P. Why similar protein sequences encode similar

three-dimensional structures?

Theor Chem Acc

. 2010;125(3-6):643-650.

doi:10.1007/s00214-009-0656-3

11.

Van Lint P, Libert C. Chemokine and cytokine processing by matrix

metalloproteinases and its effect on leukocyte migration and inflammation.

J

Leukoc Biol

. 2007;82(6):1375-1381. doi:10.1189/jlb.0607338

12.

Mali AV, Joshi AA, Hedge MV, Kadam SS. Enterolactone suppresses

proliferation, migration and metastasis of MDA-MB-231 breast cancer cells

through inhibition of uPA induced plasmin activation and MMPs-mediated ECM

remodeling.

Asian Pacific J Cancer Prev

. 2017;18(4):905-915.

doi:10.22034/APJCP.2017.18.4.905

13.

Vu TH, Werb Z. Matrix metalloproteinases: effectors of development and normal

physiology.

Genes Dev

. 2000;14:2123-2133. doi:10.1101/gad.815400.GENES

14.

Merchant N, Nagaraju GP, Rajitha B, Lammata S, Jella KK, Buchwald ZS,

Lakka SS, Ali AN. Matrix metalloproteinases: their functional role in lung

cancer.

Carcinogenesis

. 2017;38(8):766-780. doi:10.1093/carcin/bgx063

15.

Bhowmick NA, Neilson EG, Moses HL. Stromal fibroblasts in cancer initiation

and

progression

Neil.

Nature

.

2011;432(7015):332-337.

doi:10.1038/nature03096.Stromal

16.

Glasheen MB, Kabra TA, Page-McCaw A. Distinc functions for the catalytic and

hemopexin domains of drosophila matrix metalloproteinase.

PNAS

.

2009;302(6784):1053-1055. doi:10.1073/pnas.0804171106

17.

Dufour A, Cao J, Kuscu C, Dufour A, Zucker S, Sampson NS. Role of matrix

metalloproteinase-9 dimers in cell migration.

J Biol Chem

.

2010;285(46):35944-35956. doi:10.1074/jbc.m109.091769

18.

Alford VM, Kamath A, Ren X, Kumar K, Gan Q, Awwa M, Tong M, Seeliger

MA, Cao J, Ojima I, Sampson NS. Targeting the hemopexin-like domain of

latent matrix metalloproteinase-9 (proMMP-9) with a small molecule inhibitor

prevents the formation of focal adhesion junctions.

ACS Chem Biol

.

2017;12:2788-2803. doi:10.1021/acschembio.7b00758

19.

Cha H, Kopetzki E, Huber R, Lanzendörfer M, Brandstetter H. Structural basis of

the adaptive molecular recognition by MMP9.

J Mol Biol

.

2002;320(5):1065-1079. doi:10.1016/S0022-2836(02)00558-2

20.

Hingorani DV, Lippert CN, Crisp JL, Savariar EN, Hasseimann JPC, Kuo C,

Nguyen QT, Tsien RY, Whitney MA, Ellies LG. Impact of MMP-2 and MMP-9

enzyme activity on wound healing , tumor growth and RACPP cleavage.

PLoS

One

. 2018;13(9):1-17. doi:10.1371/journal.pone.0198464

21.

Elkins PA, Yen SH, Smith WW, Janson CA, Alessio KJD, McQueney MS,

Cummings MD, Romanic AM. Structure of the C-terminally truncated human

ProMMP9, a gelatin-binding matrix metalloproteinase.

Acta Crystallogr Sect D

Biol Crystallogr

. 2002;58(7):1182-1192. doi:10.1107/S0907444902007849

22.

Lebert DC, Squirrell JM, Rindy J, Broadbridge E, Lui Y, Zakrzewska A, Elicelri

KW, Meijer AH, Huttenlocher A. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen

matrices and wound repair.

Co Biol

. 2015;142:2136-2146.

doi:10.1242/dev.121160

23.

Hariono M, Yuliani SH, Istyastono EP, Riswanto FDO, Adhipandito CF. Matrix

metalloproteinase 9 (MMP9) in wound healing of diabetic foot ulcer: molecular

target and structure-based drug design.

Biochem Pharmacol

. 2018;9:1-47.

doi:10.1016/j.wndm.2018.05.003

24.

Sabino F, Keller U auf dem K. Matrix metalloproteinases in impaired wound

healing.

Met Med

. 2015;2:1–8. doi:https//dx.doi.org/10.2147/MNM.S68420

25.

Winer A, Adams S, Mignatti P. Matrix metalloproteinase inhibitors in cancer

therapy: turning past failures into future successes.

Mol Cancer Ther

.

2018;17(6):1147-1155. doi:10.1158/1535-7163.MCT-17-0646

26.

García-Pardo A, Opdenakker G. Nonproteolytic functions of matrix

metalloproteinases in pathology and insights for the development of novel

therapeutic inhibitors.

Met Med

. 2015;2:19-28. doi:10.2147/MNM.S63629

27.

Cathcart J, Pulkoski-Gross A, Cao J. Targeting matrix metalloproteinases in

cancer: Bringing new life to old ideas.

Genes Dis

. 2015;2(1):26-34.

doi:10.1016/j.gendis.2014.12.002

28.

Grass GD, Tolliver LB, Bratoeva M, Toole BP. CD147 , CD44 and the epidermal

growth factor receptor (EGFR) signaling pathway cooperate to regulate breast

epithelial cell invasiveness.

J Biol Chem

. 2013;288(36):26089-26104.

doi:10.1074/jbc.M113.497685

29.

Krieger E, Vriend G. New ways to boost molecular dynamics simulations.

J

Comput Chem

. 2015;36(13):996-1007. doi:10.1002/jcc.23899

30.

Liu K, Watanabe E, Kokubo H. Exploring the stability of ligand binding modes

to proteins by molecular dynamics simulations.

J Comput Aided Mol Des

.

2017;31(2):201-211. doi:10.1007/s10822-016-0005-2

31.

Liu K, Kokubo H. Exploring the stability of ligand binding modes to proteins by

molecular dynamics simulations: a cross-docking study.

J Chem Inf Model

.

2017;57(10):2514-2522. doi:10.1021/acs.jcim.7b00412

32.

Krieger E, Koraimann G, Vriend G. Increasing the precision of comparative

models with YASARA NOVA - A self-parameterizing force field.

Proteins

Struct Funct Genet

. 2002;47(3):393-402. doi:10.1002/prot.10104

33.

Istyastono EP. Model of full human matrix metalloproteinase 9 with ligands from

PDB:4H3X and PDB:1ITV.

Mendeley Data

. 2019. doi:10.17632/xj&yt48jwb.1

34. Prasasty VD, Istyastono EP. Structure-based design and molecular dynamics

simulations of pentapeptide AEYTR as a potential acetylcholinesterase inhibitor.

Indones.

J. Chem

. 2019;1–7.

https://doi.org/10.22146/ijc.46329

35. Adhipandito CF, Ludji DPKS, Aprilianto E, Jenie RI, Al-Najjar B, Hariono M.

Matrix Metalloproteinase9 as the protein target in anti-breast cancer drug

discovery: an approach by targeting hemopexin domain.

Futur J Pharm Sci

.2019;5(1):1-15.

7. BIOGRAFI PENULIS

Roy Gunawan Wicaksono, S.Farm. Lahir di

Sleman pada tanggal 28 Februari 1996. Riwayat

pendidikan formal yang telah ditempuh oleh penulis adalah

SD N 1 Nanggulan (2002-2008). SMP N 7 Yogyakarta

(2008-2011). SMA N 1 Nanggulan (2011-2014). Sarjana

Farmasi di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

(2014-2018). Setamat dari pendidikan Sarjana Farmasi, penulis

melanjutkan pendidikan Magister Farmasi di Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama

menempuh pendidikan Magister Farmasi penulis menjadi dosen luar biasa (DLB)

praktikum biokimia di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

8.

LAMPIRAN

8.1 Status makalah ilmiah dan makalah ilmiah

JURNAL FARMASI SAINS DAN KOMUNITAS, month year, pp Vol. X No. X p-ISSN 1693-5683; e-ISSN 2527-7146

doi:

MOLECULAR DYNAMICS STUDIES OF FULL HUMAN MATRIX

METALLOPROTEINASE 9 LIGANDED WITH

N

-HYDROXY-2-[(4-PHENYLPHENYL)SULFONYL-PROPAN-2-YLOXYAMINO]ACETAMIDE

Roy Gunawan Wicaksono, Maywan Hariono and Enade Perdana Istyastono

*)

Faculty of Pharmacy, Sanata Dharma University, Paingan Maguwoharjo Depok

Sleman Yogyakarta, 55282, Indonesia

* Corresponding author: Enade Perdana Istyastono

email: enade@usd.ac.id

co-Author email:

Roy Gunawan Wicaksono: roy.gunawanw@gmail.com

Maywan Hariono: mhariono@usd.ac.id

ABSTRACT

The research presented in this article aimed to provide a full quarternary structure

of human matrix metalloproteinase 9 (MMP9) enzyme with a ligand in the catalytic site

for structure-based virtual screening. The enzyme plays an important role in wound

healing of diabetic foot ulcer. By employing the primary structure of the enzyme

obtained from UniProt database (UniProt:P14780), the theoretical structure of full

apoenzyme of the human MMP9 (PDB:1LKG), the crystal structures of the catalytic

domain (PDB:4H3X) and the hemopexin domain (PDB:1ITV) of the human MMP9,

homology modeling studies have been performed. The ligand

N-2-(biphenyl-4-yl-sulfonyl)-N-2-(isopropyloxy)-acetohydroxamic acid (CC27) or

N

-hydroxy-2-[(4-phenylphenyl)sulfonyl-propan-2-yloxyamino]acetamide (IUPAC version) from

PDB:4H3X was embedded in the catalytic site of the enzyme. The modeling made use of

the modules of homology modeling in YASARA structure. Subsequently, molecular

dynamics (MD) simulations in YASARA structure were performed to examine the

stability of the enzyme. The homology model was found stable after 5.05 ns and the

lowest energy of the model was found at the 6.40 ns of the MD production run. This

lowest energy snapshot was then energetically minimized and analyzed for its

applicability for virtual screening. This optimized model was then stored in Mendeley

Data (DOI: 10.17632/4gsb4p75gz.1).

Keywords:

matrix metalloproteinase 9; virtual screening; homology modeling;

molecular dynamics simulations; YASARA structure.

INTRODUCTION

Enzyme matrix metalloproteinase 9 (MMP9) becomes a molecular target of

interest in the discovery of therapeutic agents for a diabetic foot ulcers and cancer

(Hariono et al., 2018). The enzyme comprises a catalytic domain and a hemopexin-like

domain, which have different roles (Roeb et al., 2002). The catalytic domain degrades

the damaged matrix membrane in the wound healing processes (Vandooren et al., 2017).

Uncontrolled enzyme activity causes the membrane degradation and formation balance

disruption in the wound healing processes (Ayuk et al., 2016). Inhibitors in the catalytic

domain are required to control the balance (Jones et al., 2019). On the other hand,

although existed in the same MMP9 enzyme, the hemopexin domain has a different role

(Dufour et al., 2010). Hemopexin domain acts as a messenger receptor by forming

dimers (Ezhilarasan et al., 2009). The interaction between the hemopexin domain with

cell surface receptors triggers cell proliferation (Delozier et al., 2011). The growth of

cancer cells could, therefore, be inhibited by inhibitors for the hemopexin domain

(Alford et al., 2017).

The available 3D structures can assist the visualization of the ligand and protein

interactions in structure-based drug design (SBDD) approaches (Wang et al., 2018). The

homology comparative modeling method is an approach to predict the 3D structure of

protein-based on its amino acid chain. Three-dimensional structures in this approach are

made using other similar proteins that the 3D structures are already known as the

templates (Cavasotto and Phatak, 2009). The processes of building the structure of the

3D protein model include: (1) Other similar proteins with known the 3D structures are

used as templates; (2) The amino acid sequences of protein target are aligned to the

templates; (3) The 3D structures of the target are constructed based on the 3D structure

of the templates; (4) The MMP9 model resulted are then evaluated, validated, and

remodelled until appropriate models are obtained (Mart et al., 2000).

There is one publicly available of full MMP9 model (PDB:1LKG).

Unfortunately, there is no ligand in the model, which then create difficulties in the

binding pocket identification. The aim of the research presented in this article was to

provide validated virtual target to discover inhibitors for MMP9. Therefore, homology

modeling approaches to construct a 3D structure of full MMP9 with ligands followed by

molecular dynamics simulations to examine the stability of the model were performed.

The optimized model resulted in this research could be downloaded from Mendeley

Data (

DOI: 10.17632/4gsb4p75gz.1

).

METHODS

Materials and Instrumentations

The human MMP9 primary sequences (UniProt:P14780) were obtained from The

Universal Protein Resource (UniProt;

https://www.uniprot.org/

). Three-dimensional

structures from The Protein Data Bank (PDB;

https://www.rcsb.org/

) with identity

PDB:1LKG, PDB:4H3X, and PDB:1ITV were used as the 3D structure templates of

human MMP9. The software mainly used was YASARA Structure version 19.1.27

(license number of 394125786). Computational studies for homology modeling were

performed in a workstation with Intel® Pentium® Silver N5000 as the processor, 4 GB

random access memory (RAM), and Windows 10 Home 64-bit as the operating system.

The molecular dynamics simulations and re-docking simulations were performed in a

workstation with Intel® Core

TM

_{i5-7500 as the processor, 8 GB RAM, and Windows 10}

Professional 64-bit as the operating system.

Procedures

The homology model of the human MMP9 was constructed by employing

P14780.fasta obtained from UniProt as the source of the primary sequences and

PDB:1LKG (sequences 1 to 93 and 445 to 511), PDB:4H3X (sequences 94 to 444), and

PDB:1ITV (sequences 512 to 707) from PDB as the templates. The module

homology

modeling

in YASARA Structure was employed to construct the initial full model of the

human MMP9. Subsequently the ligands from PDB:4H3X, and PDB:1ITV were

incorporated by aligning the chain A of the structures to the initial model and followed

by removing the protein parts of the crystal structures. Focused on the side chain

residues of the model, the quarternary structure was then subjected to molecular

dynamics simulations with fixed atoms in the main chain of residues number 94 to 444

and 512 to 707. All ligands were also fixed during molecular dynamics simulations. The

molecular dynamics simulations were performed in YASARA Structure by employing a

modified macro from the default macro

md_run.mcr

from YASARA Structure (Krieger

and Vriend, 2009). The modification was done in line 67, from

duration=’forever’

to

duration=1000

. The molecular dynamics simulations were followed by trajectory

analysis using

md_analyse.mcr

. The final scene file from molecular dynamic

simulations resulted from the analysis was unfix and then subjected to energy

minimization using

energy minimization

module. The scene resulted from energy

minimization was then saved as

mmp9_final.sce

. Objects 2 and 3 in the scene were then

joined to object 1 by using module

Join

in YASARA. The object 1 was then stored in

YASARA object and pdb formats as

mmp9_final.yob

and

mmp9_final.pdb

, respectively.

The model of the human MMP9 was then analyzed by employing module

Check

in

YASARA Structure and AMBER14 as the force field.

The file

mmp9_final.pdb

was subsequently employed as the starting point for 20 ns

MD simulations using YASARA Structure (Krieger and Vriend, 2009). The default

macro

md_run.mcr

from YASARA Structure was used with modification in line 67,

from

duration=’forever’

to

duration=20000

and in line 109, from

saveinterval=100000

to

saveinterval=10000

. The MD simulations were followed by trajectory analysis using

md_analyse.mcr

. The structure of the complex enzyme-inhibitor is considered stable if

the deviation of the root-mean-squared-deviation (RMSD) values of at least 5 ns

duration of the MD simulations is less than or equal to 1 Å (Liu et al., 2017). The first 5

ns of the MD simulations were considered as the production run. The free energy of

binding (



G) of all snapshots during the production run was calculated by employing a

method published by Prasasty and Istyastono (2019). The snapshot with the lowest



G

value was then minimized and selected to be analyzed for its applicability for being the

target in structure-based virtual screening campaigns by performing 1000 times redock

simulations using VINA embedded in YASARA Structure. The docking configuration

was embedded to the macro file

dock_run_1000.mcr

developed in this research. The file

could be obtained from Mendeley Data ((

DOI: 10.17632/4gsb4p75gz.1

). The model

was considered as applicable for virtual screening if the RMSD values of at least 95%

redocking result of the ligand are less or equal to 2 Å.

RESULTS AND DISCUSSION

The research presented in this article aimed to publicly provide a full quarternary

structure of human MMP9 with a relevant ligand in the catalytic site to be used further

in drug discovery for diabetic wound healing. The result of the homology modeling is

available in 3 formats: YASARA scene (

mmp9_final.sce

), YASARA object

(

mmp9_final.yob

), and PDB file (

mmp9_final.pdb

). These files were then stored in

Mendeley Data (doi:10.17632/xj7yt48jwb.1). The final model applicable for virtual

screening is available as a pdb file (

mmp9.pd

b), which was also stored in Mendeley

Data (

DOI: 10.17632/4gsb4p75gz.1

).

The analysis of the human MMP9 homology model showed an acceptable

deviation from the average structure in all aspects. The results and the details of the

analyzed aspects are presented in Table 1. Based on the results, the model of the tertiary

structure of the human MMP9 resulted from the homology modeling is acceptable for

further application. However, visual inspection of the interactions between the protein,

the ligands, and the cofactors should be performed and compared to those from the

reference structures,

i.e.

, PDB:4H3X and PDB:1ITV.

[Table 1]

[Figure 1]

The catalytic site of the model (Figure 1A) is slightly different from the catalytic

site of the crytal structure PDB:4H3X (Figure 1B). The histidine triad in the model is

slightly away from the zinc atom compared to the crystal structure, while the glutamate

residue remains similar. Nevertheless, the quantitave approach by aligning the backbone

of the model to the backbone of the crystal structure showed the RMSD value of those

residues in the model compared to the crystal structure was 0.817 Å. Figure 1 and the

alignment show that the model could reproduce the essential interactions for ligands and

cofactors with the protein. Unfortunately, the ligands in PDB:1ITV, which was used as

one of the templates, are only sulfate ions. Therefore, further investigation in this

hemopexin-like domain should be performed.

[Figure 2]

The reliability of the model to be employed in a further virtual screening campaign

will significantly be increased by employing a model with stable protein-ligand

interactions (Liu et al., 2017). Therefore, further MD simulations for 20 ns with a

snapshot in every 10 ps were performed. Figures 2A and 2B shows the RMSD values of

the backbone atoms during the simulations and the deviation of these RMSD values in

the duration of 5 ns started from the initial point, respectively. As depicted in Figure 2,

the MMP9-CC27 complex in this research was considered stable starting from 5.05 ns

of the MD simulations. The G values of snapshots in 5 ns after the starting stable point

were then calculated to identify the snapshot with the lowest G value. Figure 3 shows

that the lowest snapshot was identified at the 6.40 ns of the MD production run.

[Figure 3]

The MMP9-CC27 complex from the 6.40 ns of the MD production run was then

minimized and exported as a pdb file (

mmp9.pdb

). The applicability checks of this

complex for virtual screening by employing 1000 redocking simulations resulted in

RMSD values of less than 2.0 Å for all redocking of CC27 poses. The highest RMSD

value was 1.274 Å. Thus, the MMP9-CC27 complex (

mmp9.pdb

) resulted in this

research is highly suggested to be used in the further development of structure-based

virtual screening protocols to discover drugs targeting human MMP9.

CONCLUSION

Homology modeling studies followed by 20 ns MD simulations by employing

YASARA Structure could result in a proper quaternary structure of full human MMP9

complexed with CC27. The availability of the model offers possibilities to perform

structure-based drug design targeting the catalytic site of the human MMP9. Further

investigation in the hemopexin domain should be performed to study the inhibitor

selectivity of the catalytic site over the hemopexin domain.

ACKNOWLEDGEMENT

This work was financially supported by the Indonesian Ministry of Research,

Technology & Higher Education (No. 029/Penel./LPPM-USD/IV/2019) to M.H. as the

principal investigator and E.P.I. as the member investigator.