BAB 5 TEKNOLOGI EKSTRAKSI DAN STANDARDISASI EKSTRAK
6.1. Pengujian In Vitro
6.1.1. Primary Bioassay: High-Throughput Screening (HTS), Ultra High
Dalam kaitannya dengan pengembangan obat herbal,high-throughput screening
(HTS) sangat bermanfaat dalam menapis aktivitas ratusan atau ribuan ekstrak tanaman obat. Metode ini lebih sederhana, cepat dan menggunakan prinsip interaksi ligan-target yang kemudian didapatkan informasi/data dalam jumlah masif. Hal ini dilakukan sebagai langkah awal dalam memilih ekstrak yang berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut. Karena menggunakan teknik sederhana dan jumlah besar maka secara ekonomis lebih murah tanpa mempengaruhi validitas hasil yang diperoleh. Selain itu, HTS juga dapat digunakan sebagai panduan dalam melakukan isolasi senyawa aktif dari suatu tanaman obat. Namun, karena ketidakspesifikan metode yang digunakan, kadang kala terjadifalse positiveterhadap hasil yang diperoleh.
Teknologi HTS di perusahaan farmasi dalam 10 tahun terakhir terus berkembang. Saat ini teknologi HTS yang banyak digunakan, antara lain teknologi dengan metode spektrofotometri, fluorosensi, dan DNA microarray. Dengan semakin berkembangnya teknologi, HTS dapat dilakukan secara automatic/robotic dari awal hingga akhir uji selama 24 jam 7 hari sehingga dapat dilakukan skrining suatu sampel sebanyak 50.000/hari. Sedangkan Ultra High Screening didasarkan pada mekanisme fluoresensi dan menggunakan microplate1536 sumuran (Vogel 2005).
Metode HTS juga digunakan untuk mengkarakterisasi metabolisme dan farmakokinetik suatu obat. Kansy et al. (1998) mempublikasikan metode paralel permeabilitas membran buatan untuk mempelajari absorbsi pasif secara HTS. Pengujian ini juga dapat digunakan untuk pengujian metabolisme sitokrom isoenzim P450 menggunakan substratfluorogenic Vivid (Marks et al. 2002, 2003, 2004)
Pada pengujian multiplex, dilakukan lebih dari satu senyawa di dalam satu sampel, hal ini terkait dengan adanya sampel yang diuji dengan banyak metode pengujian untuk berbagai aktivitas. Nieuwenhuijsen et al. (2003) mempublikasikan metode dual luciferase multiplexed untuk interaksi protein-protein dan Malex (2004) menggunakan multiplexed real time reverse transcriptase polymerase chain reaction
(RT-PCR) dalam pengembangan HTS.
HCS (high content screening) pertama kali diperkenalkan oleh Giuliano (1997) sebagai pendekatan lain dalam penemuan obat. HCS dapat menentukan peran dari target dalam sistem sel dengan mengkombinasikan antara reagen berbasis fluoresensi dan Arrayscan yang secara otomatis didapatkan informasi mengenai aktifitas target didalam sel. HCS memadukan antara uji berbasis sel, mikroskop fluoresensi resolusi tinggi, dan foto dengan proses algoritma sehingga secara otomatis dapat menganalisis hal-hal yang terjadi di tingkat subseluler dan seluler. Skrining dengan metode ini dapat meminimalisir hal-hal yang dapat menggangu dalam pengujian seperti perubahan morfologi, diferensiasi sel, perubahan sitoskeleton, interaksi sel dengan sel, kemotaksis dan perpindahan reseptor atau perubahan formasi reseptor (Vogel, 2005).
Sebagai panduan umum dalam mengembangan HTS terhadap sampel herbal atau senyawa aktif dari herbal, untuk mendapatkan hasil yang optimal harus diperhatikan beberapa persyaratan sebagai berikut (Rahman, et all, 2005):
1) Pengujian berbasis sel atau enzimatis
2) Format pengujian: plate dengan 96 atau 384 sumuran, atau automatis 3) Sumber reagen: reagen rekombinan manusia
4) Sinyal deteksi pengujian: Mempunyai sinyal yang tinggi 5) Inkubasi pengujian: 30-60 menit di suhu tertentu
6) Modifikasi pengujian: Minimal
7) Larut dalam dimetilsulfoksida (DMSO)
HTS pada umumnya terbagi menjadi dua tipe yaitu biokimia/enzimatis dan berbasis sel. Pengujian secara biokimia atau enzimatis menggunakan reseptor dari manusia atau enzim sebagai reagen dalam pengujian. Skrining secara enzimatis mempunyai beberapa keuntungan, antara lain tidak dibutuhkannya kultur atau kultivasi sel secara berkelanjutan dan tidak adanya permasalahan barrier permeabilitas membrane, sedangkan kerugian metode ini seperti tidak adanya mekanisme aksi secara menyeluruh pada obat atau senyawa uji dan dibutuhkannya kondisi khusus dalam pengujian dan penyimpanan reagen (Rahman, 2005).
Skrining berbasis sel merupakan pengujian yang menggunakan sel primer atau
cell line sebagai objek pengujian. Skrining berbasis sel mempunyai beberapa keuntungan, antara lain: (1) didapatkannya beberapa target molekular didalam satu metode pengujian, sebagai contoh adalah pengukuran produksi IL-2 dengan menstimulasi sel T yang dapat melibatkan beberapa target sekaligus seperti tyrosin kinase p56lck, p59fyn, ZAP70, tyrosine phosphatase CD45 yang mempunyai dampak terhadap perununan produksi IL-2 jika target-target tersebut dihambat; (2) tidak dibutuhkannya reagen yang murni dan hanya membutuhkan penumbuhan sel. Sedangkan kerugiannya skrining berbasis sel adalah banyaknya kejadian “false-positive” pada senyawa uji terkait dengan target non spesifik (Rahman, 2005).
A. HTS secara enzimatis
Dalam pengujian secara enzimatis, dibutuhkan beberapa variable yang perlu diperhatikan, antara lain: sumber enzim, konsentrasi enzim yang digunakan, jenis dan konsentrasi substrat, kofaktor, pH pengujian, temperatur pengujian, kelarutan senyawa uji dengan DMSO dan kelarutan ekstrak atau senyawa uji. Informasi terkait dengan reaksi enzim yang bersifat tunggal atau multiple substrat, mekanisme katalisis, kofaktor yang dibutuhkan dan faktor atau kondisi yang mendukung aktivitas enzim sangat dibutuhkan untuk mendesain prosedur pengujian yang optimum dan mengeksplorasi mekanisme senyawa uji. Berikut contoh pengujian atau skrining secara enzimatis untuk beberapa aktivitas:
Tabel 6.3 HTS secara enzimatis untuk target aktivitas
Target Pengujian Target Aktivitas
Inhibisi protease Anticancer, pulmonary emphysema, arthritis, anti-pancreatitis, anti-hipertensi
Inhibisi tirosinase Hyper pigmentation
Inhibisi hyaluronidase Anti-alergi dan antiinflamasi Inhibisi asetilkolinesterase Alzheimer, dementia, ataxia Inhibisi β laktamase Antibakteri
Inhibisi Lipoksigenase Anti alergi, anti inflamasi (asma) Inhibisi α glukosidase Antidiabetes
Sumber: Rahman, et al, 2005
B. HTS berbasis sel
Pengujian berbasis sel dibagi dalam 3 kategori yaitu:
1) Pengujian second messenger dalam proses transduksi sinyal yang diikuti dengan aktivasi reseptor permukaan sel.
2) Pengujian gen reporter yang memonitor respon seluler pada tingkat transkripsi/ translasi
3) Pengujian proliferasi sel untuk memonitor ada tidaknya perkembangan sel terkait dengan adanya rangsangan dari luar
Berikut adalah contoh metode pengujian untuk masing-masing kategori. Tabel 6.4 HTS untuk pengujiansecond messenger, gen reporter dan proliferasi sel
Pengujian Second messenger Pengujian gen reporter Pengujian proliferasi sel
Luminescence based assay untuk uji viabilitas pada sel mamalia
Uji monitoringG protein-coupled receptordengan aktivasi enzim
B-galactosidase
Pengukuran transmisi cahaya dari sel yang tertransfeksi plasmid Contoh: pengujian transfeksi non steroid progesterone manusia menggunakan ekspresi luciferase
Pengujian tranfeksi menggunakan gen
berfluorosensi, Contoh : uji aktivitas protein kinase menggunakan reporter gen berfluorosensi
Multiceluler spheroid cells dalam sistem kultur 3 dimensi
ArrayscanTM
Pengukuran sel tunggal berflorosensi
Flowsitometri
Sumber: Vogel, 2005
Berikut adalah contoh metode pengujian HTS berbasis sel untuk target penyakit dengan prevalensi terbanyak di Indonesia:
Tabel 6.5 Metode pengujian HTS berbasis sel untuk target penyakit dengan prevalensi terbanyak di Indonesia
Target Penyakit Metode Pengujian
Antidiabetes Metode pengujianGlucose Uptakemenggunakan sel 3T3-L1 Metode pengujian sekresi insulin pada sel primer pankreas (B-TET)
terinduksi glukosa
Metode pengujian Transporter glukosa menggunakan sel skeletal
C2C12 dan sel adiposit 3T3L1
Metode pengujian potensi adipogenesis (deferensiasi sel preadiposit 3T3-L1)
Metode pengujian modulasi metabolisme glukosa hepatik
menggunakan sel hepatosit mencit H4 II E dan sel hepatosit manusia HepG2
Metode pengujian penghambatan absorbsi glukosa intestinal
Metode pengujian penghambatan Sitokrom P450
Metode pengujian aktivitas antioksidan.
Kardiovascular Metode pengujianAdenosin A3 Receptor Bindingmenggunakan sel CHO
Metode pengujian penghambatanAdenosine Uptakepada sel eritrosit manusia
Mycobacterium Tubercolosis
Metode pengujianAdenylate Kinase dengan plate 384 sumuran
Metode pengujianMicroplate Alamar Blue assay
Resazurin-based Microplate Assay(REMA)
Metode pengujian berbasis reporter seperti Luciferase, atauGreen Fluorosence Protein (GFP)
Metode pengujian skrining bakterisidal
