Рис 3 и 4. Картина эхограммы при УЗД- диагностике (слева хронический катаральный эндометрит, а справа хронический гнойно-катаральный эндометрит).
При УЗД нужно дать правильный анализ полученных картин, что является основным условием ультразвуковой диагностики.
Акушерско-гинекологическая диспансеризация коров, позволили нам дополнительно установить причины проявления бесплодия у телок случного возраста. Так, в 18 месячном возрасте у 9 из 19 коров с гинекологическими патологиями мы отмечали недоразвитие половых органов. Недоразвитие половых органов проявлялись в виде недоразвития половых губ, влагалища, матки, яичников. У таких животных наблюдали недовес и слабое развитие экстерьера [4.5].
Наши наблюдения показали, что у некоторых коров через 2-4 месяца после установления беременности возобновлялись половые циклы. При обследовании таких коров беременность не подтверждался. Аборты у коров регистрировались во все периоды беременности. Так, с момента оплодотворения до родов беременность прерывался от 6,5% до 8,9% коров. При этом в основном аборты проявлялись в первой половине беременности, что, по-видимому, было связано с критическими периодами развития зародыша и плацентарной недостаточностью [7.8]. Отечественные ученые также изучили микробиологический состав полости матки в нормальном состоянии после отела коров и патологической стадии. Диагноз ставят на основании результатов подробного ознакомления с ведением животноводства и организацией воспроизводства животных в хозяйстве, клинических и лабораторных исследований бесплодных животных.
Комплекс мероприятий включает: правильное кормление и содержание самок, особенно беременных, научно-обоснованное выращивание тёлок на специализированных фермах или хозяйствах, организацию пунктов искусственного осеменения и подбор для работы на них высококвалифицированных техников-осеменителей, постройку родильных помещений, раннюю акушерско-гинекологическую диспансеризацию коров и тёлок, высокий уровень лечебной работы, раннюю диагностику заболеваний организма, применение стимулирующих препаратов в зависимости от вида бесплодия и состояния организма, организацию учёта воспроизводства животных [9].
Выводы
Таким образом, анализ воспроизводительной функции у коров в молочно-товарном хозяйстве позволило нам определить степень распространенности бесплодия, а также определения их причин что, стало основанием для обоснования мер профилактики и улучшения воспроизводительных функции животных.
Список литературы
1. Джуланов М.Н. Калтаев Ш.Қ., Жукин Б.Д., Койбагаров К.У., Ветеринариялық акушерлік, гинекология және көбею биотехникасы. Оқулық;. Дәуір, 2011 ж.
2. Джуланов М.Н. Койбагаров К.У. Төребеков О.Т. Мал акушерлігі және гинеко- логиясы. Агроуниверситет. 2005 ж
3. Студенцов А.П., Шипилов В.С., Никитин В.Я. и др.; Под ред. Никитина В.Я. и Миролюбова М.Г. - перераб. и доп. Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения -М.: Колос, 2005. 512-с.
4. Некрасов Г.Д., Суманова И.А. Акушерство, гинекология и биотехника воспроизводства животных: учеб. - М.: Форум, 2009. - 172.
5. Никитин В.Я., Миролюбов М.Г., Гончаров В.П. и др. Практикум по акушерству, гинекологии и биотехнике размножения животных учеб, пособие для вузов "Ветеринария",
"Зоотехния". - М.: Колос, 2003.207 с.
6. Полянцев Н.И., Подберезный В.В. Ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных. Учеб, пособие для высш. и сред. спец, учеб, заведений по специальности "Ветеринария". - Ростов: Феникс, 2001.-479 с.
7. Джуланов М.Н., Туребеков О.Т., Койбагаров К.У. и другие Методическое пособие по «Практической гинекологии» издательство «КИЕ» 2009 г.
8. Туребеков О.Т. «Сиырдың акушерлік - гинекологиялык аурулары» оқу кұралы.
2010ж.
9. Абдрахманов Т.Ж., Джакупов И.Т. «Ізденістер, нәтижелер-Исследования, результаты» №2 39-44 бет. КазҰАУ Алматы қ. 2016 жыл.
БЕДЕУЛІКТІҢ ТАРАЛУЫ ЖӘНЕ АНАЛЫҚ МАЛ БАСЫНЫҢ ТӨЛШЕҢДІГІ ТӨМЕНДЕУІ СЕБЕПТЕРІН ТАЛДАУ
Сарыбаев Ы.У., Усенбеков Е.С., Туребеков О.Т., Умитжанов М.У., Махмутов А.К.
Қазақ ұлттық аграрлық университет Аңдатпа
Қазақстан Республикасының мал шаруашылығы жыл сайын бедеулік есебінен үлкен экономикалық шығын алып келеді, олар төл мен малшаруашылығы өнімдерін толық алмаудан, асырауға және азықтандыруға, сондай-ақ гинекологиялық ауру жануарларды емдеуге жұмсалатын шығындардан тұрады. Бедеулік-бұл көбею мүшелерінің функциясы бұзылған кезде ұдайы өсуге қабілетті жатырдың жоғалуы. Бедеулік уақытша (қайтымды) және тұрақты (қайтымсыз) болуы мүмкін. Біздің зерттеуіміздің нәтижесі бойынша, кейбір сиырларда жүктілікті анықтағаннан кейін 2-4 айдан кейін жыныстық циклдер қалпына келгенін көрсетті. Мұндай сиырларды тексергенде буаздық расталмады. Сиырдың түсік тастауы буаздықтың барлық кезеңінде тіркелген. Осылайша, ұрықтандыру сәтінен бастап туғанға дейін аралықтағы түсік тастауы 6,5% - дан 8,9% - ға дейін болды. Бұл ретте негізінен түсік буаздықтың бірінші жартысында пайда болды, бұл ұрықтың күрделі даму кезеңдеріне және плаценталық жетіспеушілікке байланысты болды
Кілт сөздер: Бедеулік, төл, көбею, қысыр, гинекология, шаруашылық.
THE PREVALENCE OF INFERTILITY AND THE ANALYSIS OF THE CAUSES OF LOW IMPREGNATION CAPACITY OF BREEDING STOCK
Sarybaev Y.U., Usenbekov E.S., Turebekov O.T., Umitjanov M.U., Makhmutov A.K.
Kazakh National Agrarian University
Abstract
Animal of the Republic of Kazakhstan annually by infertility brings huge economic losses logouts of shortfall of offspring and livestock products, the cost of maintaining and feeding , and for the treatment of ginekologicheskie sick animals. Infertility is the loss of the ability to reproduce Queens in violation of the function of the reproductive organs. Infertility can be temporary (reversible) and permanent (irreversible). Infertility is a biological term, it refers to both the uterus and the producers, and yalovost-the term economic and economic, it applies only to the breeding stock, which is determined by the results of reporting at the end of each current year.
Keywords: infertility, offspring, reproduction, barrenness, gynecology, farming.
УДК 57.086.13
УЛЬТРАБЫСТРАЯ ВИТРИФИКАЦИЯ ТКАНИ ЯИЧНИКА ОВЕЦ ПРИ СВЕРХНИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ -205оС
Сейсенбаева А.С.1,3, Тойшибеков Е.М1,2, Асанова Е.А.1
1Институт экспериментальной биологии им. Ф.М.Мухамедгалиева,
2Казахский национальный аграрный университет,
3Казахский национальный университет имени аль-Фараби, Алматы Аннотация
Существуют два метода криоконсервации: медленное замораживание и витрификация.
Витрификация часто используются в медицине для криоконсервации ооцитов и эмбрионов.
Криоконсервация ткани яичника человека и животных все ещё стоит на экспериментальном
уровне. Поэтому целью нашего исследования явилась ультрабыстрая витрификация ткани яичника овец для выбора оптимального метода криоконсервации и для сохранения их генофонда. Для этого мы витрифицировали ткани яичника при температуре -205оС на различных витрификационных растворах: 20% DMSO (диметилсульфоксид) + 20% EG (этиленгликоль) + 0,5 М сахароза + 10% FCS (фетальная телячья сыворотка); 20% DMSO + 20% PROH (пропандиол-1,2) + 0,5 М сахароза +10% FCS; 20% EG + 20% PROH + 0,5 М сахароза + 10% FCS на L-15 (среда Лейбовиц). Оценку выживаемости ткани яичника проводили с помощью гистологического анализа и САМ-культивирования. Наиболее эффективными растворами для витрификации оказались 20% DMSO + 20% EG + 0,5 М сахароза +10% FCS и 20% DMSO+ 20% PROH+0,5 М сахароза +10% FCS на L-15.
Ключевые слова: ткани яичника, ультрабыстрая витрификация, криопротекторы, САМ- культивирование.
Введение
Одним из современных методов криоконсервации гамет и гонад в репродуктивной биотехнологии является витрификация. Следует отметить, что протоколы витрификации начинают входить в основное русло вспомогательной репродуктивной технологии человека.
В медицине витрификация широко используется при криоконсервации ооцитов и эмбрионов.
Альтернативным методом криоконсервации ооцитов и эмбрионов является криоконсервация ткани яичника. Во многих клиниках мира для криоконсервации ткани яичника человека используют медленное замораживание. Количество рожденных детей после аутотрансплантации криоконсервированной ткани путем медленного замораживания достигло до 100 [1]. Медленное замораживание ткани яичника по сравнению витрификацией занимает много времени и требует дорогостоящего оборудования. Из-за исключения дорогого программного замораживателя и простоты выполнения метода, витрификация может являться практичной с коммерческой точки зрения. Поэтому в последнее время в мире растет количество работ посвященных витрификацию ткани яичника человека и животных [2-5]. Однако рожденных детей у людей и появление потомство у животных после трансплантации витрифицированной ткани яичника всего несколько [6-9]. Преимуществом метода витрификации перед медленным замораживанием являются предотвращение кристаллов льда и препятствие возникновения эффекта солевого раствора. В результате при витрификации ткани яичника происходит быстрый переход системы в стекловидное состояние. В этом состоянии система имеет свойства твердого тела, но сохраняет молекулярную структуру жидкости. Такое состояние достигается при эквилибрации ткани в растворах с высокой (в среднем 5,5 М) концентрацией проникающих и непроникающих криопротекторов. Высокая концентрация криопротекторов повышает вязкость системы и таким образом снижает точку замерзания раствора. Однако использование высокой концентрации криопротекторов очень токсична для клетки и их удаление может вызвать значительный осмотический стресс [10, 11]. Тем не менее, если преодолеть проблемы токсичности и осмотического повреждения, витрификация дает некоторые потенциальные преимущества.
Многие переменные факторы, такие как концентрация криопротекторов, продолжительность воздействия на клетки, размер фрагментов ткани, используемый девайс и скорость охлаждения могут влиять на жизнеспособность ткани яичника во время витрификации. Чтобы максимизировать эффективность процедуры витрификации нужно оптимизировать эти переменные факторы. На сегодняшний день «универсальный» протокол витрификации еще предстоит разработать. Поскольку методы ВРТ используются не только для сохранения фертильности человека, но и для сохранения редких и исчезающих видов животных, для подтверждения этого метода необходимы более обширные исследования [12- 16]. С этой целью мы витрифицировали ткани яичника овец Чуйской популяции при сверхнизкой температуре -205оС с использванием различных витрификационных растворов.
Выживаемость витрифицированной ткани проверяли с помощью гистологического анализа и САМ-культивирования.
Материалы и методы
Для эксперимента яичники были взяты путем забоя животных, транспортировались в лабораторию при температуре 38оС в среде L-15 (питательная среда Лейбовиц) с 5% FCS (фетальная телячья сыворотка). Яичники освободили от связок, и промывали в течение 30 сек. в основной среде. Яичники в количестве 10 экземпляров помещали в L-15 с 5% FCS, удаляли мозговую часть, оставив кортикальную часть с содержанием маленького фрагмента медулы с помощью одноразового скальпеля. С каждого яичника 1 кусочек ткани отправляли на гистологию как контроль. Из яичника удаляли мозговую часть, кортикальную часть разделили на мелкие кусочки c размером 1х1,2х1 мм (120 шт кусочков) и разделили следующим образом:
Группа 1: (n=30) 20% DMSO + 20% EG +0,5М сахароза +10% FCS на L-15;
Группа 2: (n=30) 20% DMSO+ 20% PROH +0,5М сахароза +10% FCS на L-15;
Группа 3: (n=30) 20% EG + 20% PROH+0,5М сахароза +10% FCS на L-15;
Группа 4: контрольная группа не замораживалась. Их качества оценивали с помощью гистологического анализа и CАМ культивирования.
Для насыщения ткани использовали трехэтапное введение крипротекторов во всех подопытных группах. Были приготовлены 5%, 10% и 20% витрификационные растворы с каждой группы. В 5% и 10% растворах ткани эквилибрировали по 5 минут в каждом растворе при комнатной температуре. Затем в 20% растворе эквилибрировали в течение 10 минут при температуре 4оС. После эквилибрации, образцы переносили в 2 мл криопробирки с витрификационным раствором 1 мл. Ультрабыструю витрификацию ткани яичника проводили с помощью аппарата VIT-Master Vitrificator (рис. 1 а, б), затем образцы поместили в сосуд Дьюара и хранили в течение месяца.
Для размораживания витрифицированные образцы в криопробирках 30 сек. держали в атмосферном воздухе при комнатной температуре. Затем криопробирки погрузили в 100оС кипящую водяную баню и держали там в течение 60 сек. В течение 5-10 сек. после оттаивания содержимое криопробирки последовательно переносили в 100 мл контейнеры, содержащие нисходящие концентрации сахарозы 0,5 М, 0,25 М и 0,12 М с 10% FCS на L-15 по 5 мин в каждой помещая их на шейкере. После этих манипуляции образцы трижды отмывали в среде L-15 + 10%
FCS по 10 минут каждой. Затем кусочки ткани подсадили на САМ.
а б
Рисунок 1 - VIT-Master Vitrificator
Для САМ культивирования фрагментов ткани яичника были куплены куриные эмбрионы в местной птице-фабрике «Аллель Агро». На 4-й день инкубации в скорлупе делали окно (1х1,5 см).
Отверстие покрывали пленкой, чтобы предотвратить высыхание.
На 6-7 сутки инкубации кусочки кортикального слоя ткани яичника после размораживания с размером 1 мм3 подсаживали на САМ. Подсадку проводили на САМ через маленькое отверстие в центр стерильного силиконового кольца. На 12-й день инкубации извлекали САМ вместе с кусочком ткани яичника и силиконовым кольцом. Проводили фоторегистрацию образца ткани яичника и прилежащей области хориоаллантоисной мем-браны с помощью цифровой камеры.
Образцы ткани всех исследуемых групп (контрольная, после витрификации и культивирования) фиксировали в 10% солевом растворе нейтрального формалина в течение 24 часов, дегидратировали и заключали в парафиновые блоки. С каждого образца делали серийные срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилин-эозином. Микрофотосъемку осуществляли с помощью микроскопа Zeiss Axiostar plus, «Видеотест морфология» (CarlZeiss, Германия).
Жизнеспособность ткани яичника определяли по целостности структуры примордиальных, первичных, вторичных и антральных фолликулов в гистосрезе.
Уровень жизнеспособных фолликулов в ткани в исследуемой и контрольной группах оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Разность считалась статистически достоверной при р<0,05.
Результаты исследования и обсуждение
Гистологические исследования были выполнены в сравнительном аспекте: одни части ткани яичника были исследованы после убоя животных (контрольная группа), другие – после их витрификации, третьи – после САМ культивирования витрифицированной ткани.
Анализ гистологических срезов свежей контрольной группы показал хорошую сохранность преантральных фолликулов, большая часть которых осталась неповрежденной. В фолликулах наблюдалось однородное распределение цитоплазмы в ооцитах (рис. 2 а, б).
В нашем исследовании для оценки выживаемости ткани яичника после витрификации мы использовали САМ-культивирование. Потому что хорионаллантоисная мембрана куриных эмбрионов используется для тестирования различных биоматериалов в тканевой инженерии [17, 18]. На нем были культивированы опухолевые клетки для изучения ангиогенеза [19], ткани матки для изучения эндометриоза [20], кожи человека [21], печеночные клетки [22], ткани скелетных мышц [23], мышиные и человеческие ткани яичника [24, 25]. Эти авторы считают, что структура внеклеточного матрикса САМ аналогична брюшиной стенки, которая трансплантируется ткани яичника путем внутри-брюшинной ксенотрансплантации и ортотопической аутотрансплантации.
а б
в г
Рисунок 2. Криоконсервированные ткани яичника после 5-ти дневного культивирования на САМ системе. а – 3-х суточные куриные эмбрионы. Сосудистая система в этом периоде пока ещё слабо развита; б - куриные эмбрионы с трансплантантом после культивирования. Сосудистая система
хорошо развита. в, г - извлеченные САМ вместе с кусочками ткани яичника и силиконовым кольцом из эмбриона. Видна хорошая васкуляризация ткани.
После инкубирования выживаемость эмбрионов составила 97% (60 из 58). Состояние ткани яичника оценивали по ее способности индуцировать процессы прорастания кровеносных сосудов хорионаллантоисной мембраны в область трансплантата. После 5-ти дневного культивирования (12-й день инкубирования яиц) ткани яичника на хорионаллантоисной мембране кусочки приобретали округлую форму, тем самым доказывая рост ткани яичника на мембране. Количество кровеносных сосудов в мембране рядом с имплантируемыми фрагментами яичника заметно увеличилось (рис. 2). В некоторых случаях кровеносные сосуды куриного эмбриона врастали непосредственно в образец ткани яичника и пронизывали его. Так же наблюдалось явление выселение клеток яичника из кусочка и расселения по поверхности хорионаллантоисной мембраны, что дополнительно свидетельствовала о жизнеспособности данных образцов.
Данные гистологического анализа зафиксированной ткани после размораживания и после размораживания/культивирования были сходны. Результаты показали, что преантральные фолликулы сохранили свою жизнеспособность, несмотря на некоторые изменения структуры (рис. 2 в, г). Встречались пикноморфные преантральные фолликулы.
(рис. д). Однако после САМ-культивирования количество антральных фолликул резко снизилось. Все обнаруженные малый антральные фолликулы были в состоянии разрушения или превратились в атретические тела (рис. ж). Это можно объяснить чувствительностью антральных фолликулов к гормонам и к другим факторам роста. Наличие кровеносных сосудов является очень важным фактором для успешной трансплантации яичников, так как это требуется для быстрого восстановления и для выживания фолликулов в яичниках [26].
Было показано, что пересаженные ткани яичника крысы обильно реваскуляризируются в течение 48 ч после аутотрансплантации [27]. До реваскуляризации, имплантаты уязвимы для ишемии, которая является основным препятствием для выживания ткани после трансплантации. Такие повреждения сопровождается фиброзными изменениями [28].
Как видно из представленной таблицы, в витрифицированной группе процент нормальных фолликулов ниже, чем в контрольной группе. При сопоставлении результатов общий процент нормальных преантральных фолликулов между витрифицированными и контрольными группами достоверно отличался (Pa,b<0,05).
а б
в г
д ж
Рисунок 3. Контрольные, не витрифицированные препараты: а – примордиальные фолликулы; б – вторичный фолликул. Витрифицированные ткани яичника после 5-ти дневного культивирования на
САМ системе: в – примордиальные и первичные фолликулы; г – примордиальные и вторичные фолликулы: д – нормальные первичные и вторичные фолликулы, а также видны сморщенные фолликулы; ж – атеретические тела вместо малых антральных фолликулов. Увеличение: х200 и
х400.
Таблица 1 - Относительное количество (%) морфологически нормальных фолликулов в