Пассаж- ный уровень
Инфекционная (log10 ЭИД50/мл) /гемагглютинирующая активность Flu-NS1-80-Omp16 Flu-NS1-80-L7/L12 Flu-NS1-80-Omp19 Flu-NS1-80-
Cu-Zn-SOD 1 7,95±0,14/1:64* 8,37±0,22/1:256 7,28±0,08/1:32 8,20±0,14/1:128 2 8,03±0,30/1:256 7,87±0,14/1:64 8,20±0,14/1:64 7,70±0,30/1:32 3 7,70±0,14/1:32 7,95±0,08/1:128 8,12±0,22/1:128 8,45±0,14/1:64 4 8,28±0,08/1:128 8,53±0,30/1:64 7,95±0,08/1:64 8,03±0,22/1:128 5 8,17±0,22/1:64 8,28±0,08/1:128 8,03±0,14/1:128 7,95±0,14/1:32
Примечани:* Гемагглютинирующая активность ГВВ разного пассажного уровня определена в одной повторности
Рисунок 1. Генетическая стабильность вирусных конструкций после 1-го и5-го пассажа на РКЭ в ОТ-ПЦР
М-маркер, 1 пассаж: 1-Flu-NS1-80-Omp16, 2-Flu-NS1-80-L7/L12, 3-Flu-NS1-80-Omp19, 4-Flu-NS1-80-Cu-Zn-SOD; 5-пассаж: 5-Flu-NS1-80-Omp16, 6-Flu-NS1-80-L7/L12, 7-Flu-NS1- 80-Omp19, 8-Flu-NS1-80-Cu-Zn-SOD; К+-А/РR/8/34 (H1N1) исходный штамм вируса гриппа, К--отрицательный контроль.
Исследование NS1 гена в ОТ-ПЦР показало, что все вирусные конструкции на протяжении 5 пассажей проявляют генетическую стабильность в РКЭ (рис. 1). Размеры NS1 генов вирусных конструкций, содержащих бруцеллезные белки Omp16,L7/L12, Omp19, Cu- Zn-SOD в агарозном геле соответствовали размерам pHW плазмид (1110 и 1242 пар оснований, соответственно).
Обсуждение результатов
Экспрессирующие бруцеллезные белки Omp16, L7/L12, Omp19 и Cu-Zn-SOD ГВВ на протяжении 5 последовательных пассажей в РКЭ сохраняют чужеродные вставки.
По такому параметру как стабильность чужеродной вставки при пассировании in vitro используемые гриппозные вирусные векторы отвечают предъявляемым требованиям. Ранее было показана генетическая стабильность других штаммов ГВВ (Flu-NS1-124-Omp16, Flu- NS1-124-L7/L12), на протяжении 5 последовательных пассажей на куриных эмбрионах [12].Отсутствие сайта протеолитического расщепления в гемагглютинине, а также отсутствие реверсии при пассировании в условиях invivo следует продолжать в последующих пассажных уровнях ГВВ. После 5 последовательных пассажей ГВВ в достаточной мере репродуцируются в РКЭ, обладают выраженной инфекционной и гемагглютинирующей активностью.
Выводы
Гриппозные вирусные векторы субтипа H5N1, экспрессирующие бруцеллезные белки Omp16, L7/L12, Omp19, Сu-Zn-SOD на протяжении 5 последовательных пассажей в РКЭ сохраняют бруцеллезные вставки, соответствующие размеру неструктурного белка NS1.
Гриппозные вирусные векторы Flu-NS1-80-Omp16, Flu-NS1-80-L7/L12, Flu-NS1-80-
1000 п.о.
600 п.о.
стабильные репродуктивные свойства в РКЭ. Инфекционная активность ГВВ 1 и 5 пассажного уровня составляли от 7,28±0,08 log10 ЭИД50/мл до 8,53±0,30 log10 ЭИД50/мл, соответственно. Гемагглютинирующая активность ГВВ 1 и 5 пассажного уровня составляли от 1:32 до 1:256, соответственно.
Список литературы
1. O’Callaghan D., Whatmore A.M. Brucella genomics as we enter the multi-genome era //
Brief Funct Genomics. – 2011. – Vol. 10. – P. 334-341.
2. Pappas G., Akritidis N., Bosilkovski M., Tsianos E.Brucellosis // New Engl J Med. – 2005.
– Vol. 352. – P. 2325-2336.
3. Vershilova P.A. The use of live vaccine for vaccination of human beings against brucellosis in the USSR // B World Health Organ. – 1961. – Vol. 24. – P. 85–89.
4. Spink W.W., Hall J.W., Finstad J., Mallet E. Immunization with viable Brucella organisms.
Results of a safety test in humans // BWorld Health Organ. – 1962. – Vol. 26. – P. 409–419.
5. Lopez-Merino A., Asselineau J., Serre A., Roux J., Bascoul S., Lacave C. Immunization by an insoluble fraction extracted from Brucellamelitensis: immunological and chemical characterization of the active substances // Infect Immun. – 1976. – Vol. 13. – P. 311–321.
6. Perkins S.D., Smither S.J., Atkins H.S. Towards a Brucella vaccine for humans //FEMS Microbiol Rev. – 2010. – Vol. 34. – P. 379-94.
7. Kahl-McDonagh M.M., Elzer P.H., Hagius S.D. Evaluation of novel Brucellamelitensis unmarked deletion mutants for safety and efficacy in the goat model of brucellosis // Vaccine. – 2006. – Vol. 24. – P. 5169–5177.
8. Al-Mariri A., Tibor A., Mertens P., De Bolle X., Michel P., et al. Protection of BALB/c mice against Brucellaabortus 544 challenge by vaccination with bacterioferritin or P39 recombinant proteins with CpGoligodeoxynucleotides as adjuvant // Infect Immun. – 2001. – Vol. 69. – P. 4816–
4822.
9. Oliveira S.C., Splitter G.A. Immunization of mice with recombinant L7/L12 ribosomal protein confers protection against Brucellaabortus infection // Vaccine. – 1996. – Vol. 14. – P. 959–
962.
10. Baloglu S., Boyle S.M., Vemulapalli R., Sriranganathan N., Schurig G.G., Toth T.E.
Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing either Listeria monocytogenes partial listeriolysin or Brucellaabortus ribosomal L7/L12 protein // Vet Microbiol. – 2005. – Vol.
109. – P. 11–17.
11. Shi D., Song Y. & Li Y-J. Progress on Lactococcuslactis expressing heterologous antigens as live mucosal vaccines // WeishengwuXuebao. – 2006. – Vol. 46. – P. 680–683.
12. Tabynov K., Sansyzbay A., Kydyrbayev Z., Yespembetov B., Ryskeldinova S., Zinina N., Assanzhanova N., Sultankulova K., Sandybayev N., Khairullin B., Kuznetsova I., Ferko B., Egorov A. Influenza viral vectors expressing the Brucella OMP16 or L7/L12 proteins as vaccines against B.
abortus infection. Virol J. 2014; 11:69.
13. Tabynov K., Kydyrbayev Z., Ryskeldinova S., Yespembetov B., Syrymkyzy N., Akzhunusova I., Sansyzbay A. Safety of the novel vector vaccine against Brucellaabortus based on recombinant influenza viruses expressing Brucella L7/L12 and OMP16 proteins, in cattle. J Vaccines Immun 2014; 1:101.
14. WHO. 2002. WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. Geneva:
World Health Organization.
15. Reed L.J., Muench H. 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg, 27: 493–497.
OMP16, L7/L12, OMP19, CU-ZN-SOD БРУЦЕЛЛЕЗДІК БЕЛОКТАРЫН
ЭКСПРЕССИЯЛАЙТЫН ТҰМАУЛЫҚ ВИРУСТЫҚ ВЕКТОРЛАРДЫҢ ГЕНИТИКАЛЫҚ ТҰРАҚТЫЛЫҒЫН БАҒАЛАУ
Рыскельдинова Ш.Ж.1, Қыдырбаев Ж.1, ЕспембетовБ.А.1, Буғыбаева Д.А.1, Табынов Қ.Қ.2
1Биологиялық қауіпсіздік проблемаларының ғылыми-зерттеу инститы ҚР БҒМ ҒК, Гвардейский кенті
2Қазақ ұлттық аграрлық университеті, Алматы қ.
Аңдатпа
Мақалада тұмаулық вирустық векторлардың Flu-NS1-80-Omp16, Flu-NS1-80-L7/L12, Flu-NS1-80-Omp19, Flu-NS1-80-Cu-Zn-SOD әр түрлі пассаж деңгейлеріндегі генетикалық тұрақтылығын зерттеу нәтижелері көрсетілген. Бруцеллез белоктарын экспрессиялайтын Omp16, L7/L12, Omp 19, Cu-Zn-SOD тұмаулық вирустық векторлардың H5N1 субтипін дамушы тауық эмбриондарында 5 рет тізбекті пассаждау барысында бруцеллездік ендірмелер сақталады және олардың жоғары репродуктивті қасиеттері бар екендігі көрсетіледі. Тұмаулық вирустық векторлар таңдалған өсіру жүйесінде 7,28-8,53 log10
ЭИД50/мл аралығында жиналады.
Ключевые слова: Тұмаулық вирустық векторлар, бруцеллездік ендірмелер, инфекциялық белсенділік, гемагглютининдік белсенділік.
EVALUATION OF THE GENETIC STABILITY OF INFLUENZA VIRAL VECTORS EXPRESSING BRUCELLA PROTEINS OMP16, L7/L12, OMP19 and CU-ZN-SOD
Ryskeldinova Sh.Zh.1, Kydyrbaev Zh.1, Espembetov B.A.1, Bugybaeva D.A.1, Tabynov K.K.2
1Research Institute for Biological SafetyProblems Science Commite MES RK, s. Guards
2Kazakh National Agrarian University, Almaty
This work presents the results of a study of genetic stability at different levels of the passage of four influenza virus vectors (IVV): Flu-NS1-80-Omp16, Flu-NS1-80-L7/L12, Flu-NS1-80- Omp19, Flu-NS1-80-Cu-Zn-SOD. It was found that the IVV H5N1 subtype expressing the brucellosis proteins Omp16, L7/L12, Omp19, Cu-Zn-SOD, during five consecutive passages in developing chicken embryos (CE), retained brucellosis inserts and exhibited high reproductive properties. IVV is accumulated in the selected cultivation system in the range of 7.28 - 8.53 log10 EID50/ml.
Key words: influenza Virus vector, brucellosis inserts, infectious activity, hemagglutinating activity.
УДК 637.05:631.4
ИЗУЧЕНИЕ СТЕПЕНИ НАКОПЛЕНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И ТОКСИЧНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В КОРМАХ ДЛЯ КРС БАЗОВЫХ ХОЗЯЙСТВ АЛМАТИНСКОЙ ОБЛАСТИ
Сарсембаева Н.Б., Утепова З.А., Абдигалиева Т.Б., Білтебай А.Н., Мырзабаева Н.Е.
Казахский национальный аграрный университет, г. Алматы Аннотация
В статье представлены результаты об уровне существующего загрязнения растительного покрова тяжелыми металлами базовых хозяйств Алматинской области.
Исследования проб кормов показали, что содержание кадмия, ртути, свинца и мышьяка по изучаемым параметрам не выходит за пределы допустимых концентраций в базовых хозяйствах Алматинской области. Полученные результаты послужат основой для последующего мониторинга за состоянием окружающей среды по содержанию тяжелых металлов в природных объектах Республики.
Ключевые слова: корма, кормовые добавки, безопасность, тяжелые металлы, качество.
Введение
Производство экологически безопасной продукции - ключевая задача при экологизации сельскохозяйственного производства [1]. Под экологически безопасной сельскохозяйс- твенной продукцией понимают такую продукцию, которая в течение принятого для различных ее видов «жизненного цикла» (производство – переработка – потребление) соответствует установленным органолептическим, общегигиеническим, технологическим и токсикологическим нормативам и не оказывает негативного влияния на здоровье человека, животных и состояние окружающей среды [2-3].
Считается, что из ядов, регулярно попадающих в организм человека, около 70%
поступает с пищей, 20% – из воздуха и 10% – с водой.
На сегодняшний день известно, что примерно 30-40% продукции загрязнено нежелательными ингредиентами. Загрязнено также до 70% питьевой воды (то есть примерно семь человек из десяти пьют загрязненную воду). Общепризнанно, что основным источником поступления тяжелых металлов (ТМ) в организм человека являются пищевые продукты. Проблему загрязнения продукции тяжелыми металлами необходимо рассматривать как жизненно важную [4].
Наряду с такими источниками загрязнения, как энергетика (особенно ТЭС), промыш- ленность, транспорт, есть «критические точки», вызывающие загрязнение продукции и окружающей среды. Проблему получения качественного продовольствия в условиях негативного антропогенного воздействия на окружающую природную среду, в том числе и в процессе сельскохозяйственного производства, можно решить на основе экологизации сложившихся или вновь создаваемых систем ведения сельского хозяйства [5].
Получение высоких урожаев сельскохозяйственных культур невозможно без применения минеральных удобрений. Системы удобрений обеспечивают реализацию потенциальной продуктивности возделываемых культур, способствуют воспроизводству плодородия почв [6]. Но, в зависимости от физико-химических свойств почвы видов и доз применяемых минеральных удобрений, изменение уровня плодородия происходит не всегда однозначно. Часто отмечается накопление в почвах различных тяжелых металлов, источником которых служат вносимые удобрения [7]. С минеральными удобрениями вносится достаточно большое количество тяжелых металлов [8]. Последствия такого накопления приводят к увеличению концентрации тяжелых металлов в почве и продукции растениеводства, и в конечном итоге в организме человека. Поэтому при внесении минеральных удобрений необходимо знать степень их влияния на накопление тяжелых металлов в почве.
Сегодняшний день неоднократно ученые доказали что металлы, такие как свинец и ртуть, который группированы как тяжелые металлы, вызывают неврологические повреждения у младенцев и детей. Воздействие кадмия может также приводить к повреждению почек, как правило, у пожилых людей. Металлы могут заражать пищевые продукты в результате загрязнения воздуха, воды и почвы [9].
К тяжелым металлам относятся химические элементы с атомной массой более 40.
Наиболее опасными из них являются: свинец, ртуть, кадмий, цинк, никель и др. Примерно 90% тяжелых металлов, поступающих в окружающую среду, аккумулируются почвой, затем они мигрируют в природные воды, поглощаются растениями и поступают в пищевые цепи [10].
Целью работы является изучение влияния содержания свинца, кадмия, ртути, и мышьяка (Pb, Cd, Hg, и As) в компонентах рациона крупного рогатого скота на их биоаккумуляцию в животноводческой продукции (молоко, мясо) в базовых хозяйствах Алматинской области. Научно обосновать возможность получения экологически безопасной животноводческой продукции в мясном и молочном скотоводстве.
Методика исследований
Объектами наших исследований служили пробы основных сельскохозяйственных культур для кормоприготовления базовых хозяйств, расположенных в Алматинской области:
ТОО «КазАгроСтандарт» (Рисунок 1) и крестьянское хозяйство «Айдарбаев» (Рисунок 2).
Отбор проб объектов проводили весной и летом текущего года в соответствии с ГОСТ- ми РК и межгосударственными стандартами.
Образцы сельскохозяйственных культур для кормоприготовления отбирали в наиболее типичных для почвенно-климатических зон хозяйств, отмечали возможные техногенные источники тяжелых металлов. Всего проанализировано 209 проб кормов и кормовых добавок (Рисунок 3).
Исследования образцов кормов на содержание тяжелых металлов проводились в Аккредитованной испытательной лаборатории КЯИЦ. В июле 2015 году ЛИП «Электронная микроскопия» КЯИЦ успешно прошла аккредитацию в Национальном центре аккредитации в составе Казахстанско-Японского инновационного центра в системе аккредитации Республики Казахстан на соответствие требованиям СТ РК ИСО/МЭК 17025-2007 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий», № KZ.И.02.1624. В августе 2017 году ЛИП «Электронная микроскопия» успешно прошла инспекционный контроль со стороны НЦА на соответствие аккредитуемым требованиям.
Рис. 1. Коровник и коровы породы «Алатауская» ТОО «КазАгроСтандарт»
Рис. 2. Крестьянское хозяйство «Айдарбаев»
Рис.3. Пробы кормов и комбикормов ТОО «КазАгроСтандарт» и К/Х «Айдарбаев»
Имеющееся оборудование КЯИЦ на 100% внесено в реестр РК и метрологически поверено.
Основным современным методом определения тяжелых металлов в различных объектах является метод атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС). Метод ААС включает два этапа: деструкция пробы и проведение измерений.
Деструкция пробы - пробоподготовка, является важной стадией в процессе анализа и нередко вносит основную погрешность в результат анализа. В последние годы предпочтение отдается методам пробоподготовки в закрытых сосудах - в микроволновых печах.
Это направление является перспективным, так как удовлетворяет аналитическим требованиям, предъявляемым к методам пробоподготовки: быстрое вскрытие, высокая эффективность деструкции при повышенном давлении, практически полное исключение потерь летучих элементов, небольшие количества минеральных кислот, необходимых для разложения и т.д.
Пробоподготовка образцов кормов в рамках проекта проводилась методом сухой и кислотной минерализации.
Работа выполнялась на атомно-абсорбционном спектрометре novAA350 (AnalytikJena, Германия) представляющий собой прибор нового поколения для автоматизированного анализа методом пламенной атомно-абсорбционной спектроскопии с дейтериевой коррекцией фонового излучения (дейтериевая лампа с полым катодом) с возможностью быстрого перехода в режим определения методом атомно-эмиссионной спектроскопии без использования ламп с полым катодом.
Лабораторные исследования по определению содержания солей тяжелых металлов и токсичных элементов в кормах проводились согласно следующим нормативным доку- ментам:
- СТ РК ИСО 8288-2005 Определение содержания кобальта, никеля, меди, цинка, кадмия и свинца. Пламенные атомно-абсорбционные спектрометрические методы;
- ГОСТ 30692-2000 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Атомно-абсорбци- онный метод определения содержания меди, свинца, цинка и кадмия;
- МУ 08-47/162 Вольтамперометрический метод измерения массовой концентрации ртути;
- МУ 31-09/04 Методика выполнения измерений массовой концентрации мышьяка методом инверсионной вольтамперометрии на анализаторах типа ТА.
Метрологический контроль приборов и лабораторного оборудования обеспечивались в соответствии с требованиями Госстандарта РК в установленном нормативными документами порядке.
Количественные показатели результатов исследований были обработаны вариационно- статистическим анализом с помощью пакета программ Microsoft Excel (2003), Statgraf, Statgraf Plus. Достоверность различий установлена по методу Стьюдента-Фишера.
Основные результаты исследований
Для стабильного развития молочного животноводства хозяйствам необходимо иметь устойчивую кормовую базу. В период проведения исследований мы изучили содержание тяжелых металлов (свинец, кадмиий) и токсичных элементов (ртуть и мышьяк), и их содержание в рационах коров стойлового периода (Таблица 1).
Тяжелые металлы (Hg, Cd, Рb) и мышьяк (As) содержатся в суточных рационах лактирующих коров в различных количественных сочетаниях. Наибольшее количество As и Hg с суточным рационом получали коровы из К/Х «Айдарбаев». Их количество в среднем составляло: 0,0065 мг/кг и 0,0011мг/кг. А наибольшее количество Cd и Рb с суточным рационом получали коровы из ТОО «КазАгроСтандарт». Их количество в среднем составляло: 0,0002 мг/кг и 0,0039мг/кг. Однако вышеуказанные показатели не превышали ПДК. Произведенный расчет коэффициента миграции тяжелых металлов из почвы в корма показал, что увеличение концентрации кадмия, свинца, ртути и мышьяка в кормах суточного рациона лактирующих коров зависит от почвенно-климатических условий базовых хозяйств Алматинской области.