Lampiran 1. Gambar Krim yang Mengandung Hidrokortison Asetat dan Kloramfenikol
Lampiran 2. Komposisi krim merek X
Contoh produk yang mengandung hidrokortison asetat dan kloramfnikol 1. Chloramfecort® krim (PT. Kimia Farma)
No. Reg : DKL7212416529A1
Expire Date : Agustus 2017
Komposisi :
Lampiran 3. Gambar Alat
Gambar 2. Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu 1800)
Gambar 3. Neraca analitik (Mettler Toledo)
Lampiran 4. Bagan Alir Prosedur Penelitian a. Hidrokortison asetat
Dimasukkan ke labu 10 ml dan dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda
Dimasukkan ke labu 10mL dan dicukupkan etanol absolut sampai garis tanda
Dimasukkan ke labu 10 ml dan dicukupkan etanol absolut sampai garis tanda
Dimasukkan ke labu 10 ml dan
dicukupkan etanol absolut sampai garis tanda
Dimasukkan ke labu 10 ml dan
dicukupkan etanol absolut sampai garis tanda
diambil 5 ml
dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL
dilarutkan dan dicukupkan dengan etanol absolut
LIB II hidrokortison asetat 50 g/ml
6 g/ml 10 g/ml 12 g/ml 14 g/ml
diambil 1,2 mL diambil 2 ml diambil 2,4 ml
diambil 1,6 ml
Diambil 2,8 ml
diukur serapan maksimum pada 200 -400 nm Serapan
Maksimum
Hidokortison asetat
ditimbang 50 mg
dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 mL
dilarutkan dan dicukupkan dengan etanol absolut
Lampiran 4. (Lanjutan)
b. Pembuatan kurva kalibrasi hidrokortison asetat
kortiso
Persamaan regresi
dibuat kurva kalibrasi Larutan Standar Hidrokortison asetat
(6; 8; 10; 12; 14 g/ml )
diukur serapan pada 200-400 nm ditransformasikan ke serapan derivat pertama
ditransformasikan ke serapan derivat kedua
ditentukan zero crossing
ditentukan panjang gelombang analisis
Lampiran 4. (Lanjutan) c. Kloramfenikol
Dimasukkan ke labu 10 ml dan
dicukupkan etanol absolut sampai garis tanda
Dimasukkan ke labu 10 ml dan dicukupkan etanol absolut sampai garis tanda Dimasukkan ke labu 10 ml dan dicukupkan etanol absolut sampai garis tanda
Dimasukkan ke labu 10 ml dan
dicukupkan etanol absolut sampai garis tanda
Dimasukkan ke labu 10 mL dan
dicukupkan etanol absolut sampai garis
diambil 5 ml
dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml
dilarutkan dan dicukupkan dengan etanol absolut
LIB II Kloramfenikol 50 g/ml
8 g/ml 12 g/ml 14 g/ml 16 g/ml
diambil 1,6 ml diambil 2,4 ml diambil 2,8 ml
diambil 2 ml
diambil 3,2 ml
diukur serapan maksimum pada 200 -400 nm Serapan
Maksimum Kloramfenikol
ditimbang 50 mg
dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml
dilarutkan dan dicukupkan dengan etanol absolut
Lampiran 4. (Lanjutan)
d. pembuatan kurva kalibrasi kloramfenikol
Persamaan regresi
dibuat kurva kalibrasi Larutan Standar Kloramfenikol
(8; 10; 12; 14; 16 g/ml)
diukur serapan pada 200-400 nm ditransformasikan ke serapan derivat pertama
ditransformasikan ke serapan derivat kedua
ditentukan zero crossing
ditentukan panjang gelombang analisis
Lampiran 4. (Lanjutan)
e. Penetapan kadar sampel krim merek X
ditimbang
dikeluarkan isi tube, kemudian ditimbang tube kosong
ditimbang setara 25 mg hidrokortison asetat
dihitung kesetaraan kloramfenikol yang terkandung didalamnya (penimbangan dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan)
dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dilarutkan dengan etanol absolut
dihomogenkan dengan sonikator selama 15 menit dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda dihomogenkan
disaring
dibuang 10 ml filtrat pertama ditampung filtrat selanjutnya dipipet 0,5 ml
dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml
dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda diukur pada 222.20 nm untuk hidrokortison asetat
dan 228.40 nm untuk kloramfenikol
dihitung Nilai Absorbansi
Kadar 10 tube
Lampiran 5. Spektrum Serapan Baku Hidrokortison Asetat dan Baku Kloramfenikol
A. Hidrokortison Asetat
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.28054
0.20000
0.10000
0.00000
-0.02973
Gambar 5. Spektrum serapan hidrokortison asetat konsentrasi 8 g/ml
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.35989
0.30000
0.20000
0.10000
0.00000
-0.03809
Lampiran 5. (Lanjutan)
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.41477
0.30000
0.20000
0.10000
0.00000
-0.04217
Gambar 7. Spektrum serapan hidrokortison asetat konsentrasi 12 g/ml
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.52578
0.40000
0.20000
0.00000
-0.05206
Lampiran 5. (Lanjutan)
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.61627
0.40000
0.20000
0.00000
-0.05932
Gambar 9. Spektrum serapan hidrokortison asetat konsentrasi 16 g/ml
nm.
201.13 250.00 300.00 350.00 399.44
A
b
s.
0.70000
0.60000
0.40000
0.20000
0.00000
Lampiran 5. (Lanjutan) B. Kloramfenikol
nm.
201.13 250.00 300.00 350.00 399.44
A
b
s.
0.60000
0.40000
0.20000
0.00000
Gambar 11. Spektrum serapan kloramfenikol konsentrasi 8 g/ml
nm.
201.13 250.00 300.00 350.00 399.44
A
b
s.
0.60000
0.40000
0.20000
0.00000
Lampiran 5. (Lanjutan)
nm.
201.13 250.00 300.00 350.00 399.44
A
b
s.
0.70000
0.60000
0.40000
0.20000
0.00000
Gambar 13. Spektrum serapan kloramfenikol konsentrasi 12 g/ml
nm.
201.13 250.00 300.00 350.00 399.44
A
b
s.
0.70000
0.60000
0.40000
0.20000
0.00000
Lampiran 5. (Lanjutan)
nm.
201.13 250.00 300.00 350.00 399.44
A
b
s.
0.90000
0.80000
0.60000
0.40000
0.20000
0.00000
Gambar 15. Spektrum serapan kloramfenikol konsentrasi 16 g/ml
nm.
201.13 250.00 300.00 350.00 399.44
A
b
s.
0.90000
0.80000
0.60000
0.40000
0.20000
0.00000
Lampiran 6. Spektrum Serapan Derivat Pertama Baku Hidrokortison Asetat dan Baku Kloramfenikol
A. Hidrokortison Asetat
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.01121 0.01000
0.00000
-0.01000
-0.01513
Gambar 17. Spektrum serapan derivat pertama hidrokortison asetat konsentrasi 6 g/ml
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.02000
0.01000
0.00000
-0.01000
-0.02013
Lampiran 6. (Lanjutan)
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.02000
0.01000
0.00000
-0.01000
-0.02013
Gambar 19. Spektrum serapan derivat pertama hidrokortison asetat konsentrasi 10 g/ml
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.02000
0.00000
-0.02000
-0.03013
Lampiran 6. (Lanjutan)
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.02000
0.00000
-0.02000
-0.03013
Gambar 21. Spektrum serapan derivat pertama hidrokortison asetat konsentrasi 14 g/ml
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.03000
0.02000
0.00000
-0.02000
-0.03013
Lampiran 6. (Lanjutan) B. Kloramfenikol
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.02000
0.00000
-0.02000
-0.03013
Gambar 23. Spektrum serapan derivat pertama kloramfenikol konsentrasi 8 g/ml
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.02000
0.00000
-0.02000
-0.03013
Lampiran 6. (Lanjutan)
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.02000
0.00000
-0.02000
-0.03013
Gambar 25. Spektrum serapan derivat pertama kloramfenikol konsentrasi 12 g/ml
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.04000
0.02000
0.00000
-0.02000
-0.04013
Lampiran 6. (Lanjutan)
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.04000
0.02000
0.00000
-0.02000
-0.04013
Gambar 27. Spektrum serapan derivat pertama kloramfenikol konsentrasi 16 g/ml
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.03000
0.02000
0.00000
-0.02000
-0.04013
Lampiran 7. Spektrum Serapan Derivat Kedua Baku Hidrokortison Asetat dan Baku Kloramfenikol
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00500
0.00000
-0.00513
Gambar 29. Spektrum serapan derivat kedua hidrokortison asetat konsentrasi 6 g/ml
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00500
0.00000
-0.00513
Lampiran 7. (Lanjutan)
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00500
0.00000
-0.00513
Gambar 31. Spektrum serapan derivat kedua hidrokortison asetat konsentrasi 10 g/ml
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00500
0.00000
-0.00513
Lampiran 7. (Lanjutan)
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00500
0.00000
-0.00513
Gambar 33. Spektrum serapan derivat kedua hidrokortison asetat konsentrasi 14 g/ml
b. Kloramfenikol
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00500
0.00000
-0.00500
-0.00913
Lampiran 7. (Lanjutan)
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00500
0.00000
-0.00500
-0.01000
-0.01130
Gambar 35. Spektrum serapan derivat kedua kloramfenikol konsentrasi 10 g/ml
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00500
0.00000
-0.00500
-0.01000
-0.01530
Lampiran 7. (Lanjutan)
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00500
0.00000
-0.00500
-0.01000
-0.01530
Gambar 37. Spektrum serapan derivat kedua kloramfenikol konsentrasi 14 g/ml
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00700
0.00500
0.00000
-0.00500
-0.01000
-0.01530
Lampiran 7. (Lanjutan)
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00700
0.00500
0.00000
-0.00500
-0.01000
-0.01530
Lampiran 8. Spektrum Serapan Panjang Gelombang Analisis Hidrokortison Asetat dan Kloramfenikol
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00500
0.00000
-0.00513
Gambar 40. Spektrum serapan derivat kedua hidrokortison asetat konsentrasi 10 g/ml pada = 222.20 nm
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00500
0.00000
-0.00500
-0.00913
Lampiran 8. (Lanjutan)
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.0077
0.0000
-0.0100
-0.0200
-0.0300
-0.0332
` Gambar 42. Spektrum serapan derivat kedua campuran hidrortison asetat
Lampiran 9. Data Kalibrasi Baku Hidrokortison Asetat, Persamaan Regresi dan Koefisien Korelasi
Kalibrasi serapan derivat kedua Hidrokortison Asetat pada panjang gelombang 222,20 nm
No. Konsentrasi ( g/ml) (X) Absorbansi (Y)
1. 0,0000 0,00000
2. 6,0000 0,00061
3. 8,0000 0,00080
4. 10,0000 0,00090
5. 12,0000 0,00121
6. 14,0000 0,00137
Perhitungan persamaan garis regresi
Maka, persamaan garis regresinya adalah
No. X Y XY X2` Y2
1. 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,0000000000 2. 6,00000 0,00061 0,00366 36,00000 0,000000372 3. 8,00000 0,00080 0,00640 64,00000 0,00000064 4. 10,00000 0,00090 0,00900 100,00000 0,00000081 5. 12,00000 0,00121 0,01452 144,00000 0,000001464 6. 14,00000 0,00137 0,01918 196,00000 0,000001876
ΣX = 50 = 8,33
ΣY = 0,00489 = 0,000815
ΣXY = 0,05276 ΣY
Lampiran 9 . (Lanjutan)
Perhitungan Koefisien Korelasi (⥾) ⥾
⥾
⥾
=
⥾ = 0,9970
Lampiran 10. Data Kalibrasi Baku Kloramfenikol, Persamaan Regresi dan Koefisien Korelasi
Kalibrasi serapan derivat kedua kloramfenikol pada panjang gelombang 228,4 nm.
No. Konsentrasi ( g/mL) (X) Absorbansi (Y)
1. 0,00000 0,00000
2. 8,00000 0,00146
3. 10,00000 0,00188
4. 12,00000 0,00239
5. 14,00000 0,00246
6. 16,00000 0,00291
Perhitungan Persamaan Garis Regresi
No. X Y XY` X2 Y2
1. 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
2. 8,00000 0,00146 0,01168 64,00000 0,000002131 3. 10,00000 0,00188 0,0188 100,00000 0,000002534 4. 12,00000 0,00239 0,02868 144,00000 0,000005712 5. 14,00000 0,00246 0,03444 196,00000 0,000006051 6. 16,00000 0,00291 0,04656 256,00000 0,000008468
ΣX = 60 =10,00
ΣY = 0,0111 = 0,00185
ΣXY =
0,14016 ΣX
2 = 760 ΣY2 = 0,000025896
Lampiran 10. (Lanjutan)
Perhitungan Koefisien Korelasi (⥾)
⥾
⥾
⥾ =
⥾ = 0,997
Lampiran 11. Perhitungan Batas Deteksi (Limit of Detection, LOD) dan Batas Kuantitasi (Limit of Quantitation,LOQ) Hidrokortison Asetat Persamaan garis regresi hidrokortison asetat adalah
No. X Y Yi Y-Yi (10-5) (Y-Yi)2 (10-10)
1 0,00000 0,00000 0,00001 -1 1
2 6,00000 0,00061 0,00061 0 0
3 8,00000 0,00080 0,00081 -1 1
4 10,00000 0,00090 0,00101 -11 121
5 12,00000 0,00121 0,00121 -0 0
6 14,00000 0,00137 0,00141 -4 16
Σ(Y-Yi)2 139
58,949.10-6
1,76847 g/ml
Lampiran 12. Perhitungan Batas Deteksi (Limit of Detection, LOD) dan Batas Kuantitasi (Limit of Quantitation,LOQ) Kloramfenikol
Persamaan garis regresi kloramfenikol adalah Y = 0,00018X + 0,00003
No. X Y Yi Y-Yi (10-5) (Y-Yi)2 (10-10)
1 0,00000 0,00000 0,00003 -3 9
2 8,00000 0,00146 0,00147 -1 2
3 10,00000 0,00188 0,00183 5 25
4 12,00000 0,00239 0,00219 20 400
5 14,00000 0,00246 0.00255 -9 81
6 16,00000 0,00291 0,00291 0 0
Σ (Y-Yi)2 517
56,844.10-6
0,9473 g/ml
Lampiran 13. Spektrum Serapan Derivat Kedua Sampel Krim Merek X
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.0069
0.0000
-0.0100
-0.0200
[image:35.596.120.493.106.419.2]-0.0266
Gambar 43. Spektrum Serapan Derivat Kedua Sampel Krim Merek X
No Nama Absorbansi Deskripsi
1 Sampel 1 0,00099 Hidrokortison asetat
0,00147 Kloramfenikol
2 Sampel 2 0,00100 Hidrokortison asetat
0,00151 Kloramfenikol
3 Sampel 3 0,00105 Hidrokortison asetat
0,00152 Kloramfenikol
4 Sampel 4 0,00098 Hidrokortison asetat
0,00150 Kloramfenikol
5 Sampel 5 0,00099 Hidrokortison asetat
0,00147 Kloramfenikol
6 Sampel 6 0,00102 Hidrokortison asetat
0,00102 Kloramfenikol
Lampiran 14. Hasil Analisis Kadar Hidrokortison Asetat Dan Kloramfenikol dalam sediaan Krim
1. Kadar hidrokortison asetat dalam sediaan krim (Tiap gram mengandung 25 mg hidrokortison asetat dalam satu tube)
Nama Sediaan Penimba-ngan (g) Setara (mg) Absorbansi pada = 222,2 nm
Konsentra -si teoritis
( g/mL)
Konsentrasi kloramfeni
kol ( g/mL)
Kadar (%) Kadar (mg) K R I M X
0,9965 24,91 0,00099 9,962 9,8 98,67 24,667 0,9970 24,925 0,00100 9,97 9,9 99,59 24,897 0,9989 24,97 0,00105 9,988 10,4 104,4 26,1 0,9960 24,9 0,00098 9,96 9,7 97,68 24,42 0,0062 24,905 0,00099 9,962 9,8 98,66 24,665 0,9982 24,995 0,00102 9,982 10,1 101,48 25,37
2. Kadar Kloramfenikol dalam sediaan krim (Tiap gram mengandung 20 mg kloramfenikol dalam satu tube)
Nama Sediaan Penimban -gan (g) Setara (mg) Absorban- si pada =228,4 nm Konsentr asi teoritis ( g/mL)
Konsentrasi kloramfenik
ol ( g/mL)
Kadar (%) Kadar (mg) K R I M X
Lampiran 15. Contoh Perhitungan Kadar Hidrokortison asetat danKloramfenikol dalam Sediaan Krim
i. Data penimbangan tuber krim merek X Berat tube merek X = 128,2868 g Berat 10 tube kosong = 28,5811 g
Berat krim X = 128,2868 g – 28,5811 g = 99,7057 g
ii. Perhitungan kadar untuk Hidrokortison asetat dan Kloramfenikol a.Perhitungan Kadar Hidrokortison asetat
Sediaan krim yang digunakan sampel krim merek X yang mengandung hidrokortison asetat 25 mg dan kloramfenikol 20 mg.
Ditimbang serbuk setara dengan 25 mg hidrokortison asetat, maka jumlah krim yang ditimbang adalah;
x
1= 25 mg xmg g
25 1
= 1 g
Dilarutkan 1 g krim dalam etanol absolut dalam labu tentukur 50 mL sampai garis tanda. Larutan kemudian dihomogenkan, disaring, lebih kurang 10 mL filtrat pertama dibuang. Filtrat selanjutnya ditampung (larutan A).
Konsentrasi hidrokortison asetat larutan A x 1000 g = 500 g/ml Kemudian dari larutan A, dipipet 0,5 ml dan dimasukkan kedalam labu tentukur 25 mL dan diencerkan dengan etanol absolut hingga garis tanda (larutan B).
Konsentrasi hidrokortison asetat larutan B =
ml ml mlx g 25 5 , 0 / 500
= 10 µg/ml b. Perhitungan Kadar Kloramfenikol
Kemudian dihitung kesetaraan kloramfenikol yang terkandung dalam 1 g krim.
x
2 =g g
1 1
x 20 mg = 20 mg
Dilarutkan 1 g krim dalam etanol absolut dalam labu tentukur 50 mL sampai garis tanda. Larutan kemudian dihomogenkan, disaring, lebih kurang 10 mL filtrat pertama dibuang. Filtrat selanjutnya ditampung (larutan A).
Konsentrasi kloramfenikol larutan A x 1000 g = 400 g/ml
Lampiran 15. (Lanjutan)
Konsentrasi hidrokortison asetat larutan B =
ml ml mlx g 25 5 , 0 / 400 = 8µg/ml
iii.) Contoh perhitungan kadar Hidrokortison Asetat dan Kloramfenikol dari sampel krim X:
Berat krim yang ditimbang adalah 0,9965 g, maka terlebih dahulu dihitung kesetaraan dengan hidrokortison asetat dan kloramfenikol.
Kesetaraan hidrokortison asetat =
g g 1 9965 , 0
x 25 mg = 24,91 mg
Konsentrasi hidrokortison asetat = x 1000 g = 498,2 g/ml
Konsentrasi teoritis hidrokortison asetat = x 0,5 ml = 9,964 g/ml
Absorbansi hidrokortison asetat pada derivat kedua pada panjang gelombang 222,20 nm adalah 0,00099
Kadar hidrokortison asetat dihitung dari persamaan regresi pada panjang gelombang analisis hidrokortison asetat Y = 0,00010X + 0,00001
Konsentrasi hidrokortison asetat:
Y = 0,00010X + 0,00001 0,00099 = 0,00010X + 0,00001 0,00099 - 0,00001 = 0,00010X
X =
X = 9,8 g/ml
Lampiran 15. (Lanjutan)
Kesetaraan kloramfenikol =
g g
1 9965 , 0
x 20 mg = 19,93 mg
Konsentrasi kloramfenikol = x 1000 g = 398,6 g/ml
Konsentrasi teoritis kloramfenikol = x 0,5 mL = 7,972 g/ml Absorbansi kloramfenikol pada derivat kedua pada panjang gelombang 228,40 nm adalah 0,00147.
Kadar kloramfenikol dihitung dari persamaan regresi pada panjang gelombang analisis kloramfenikol Y = 0,00018X + 0,00003
Konsentrasi kloramfenikol : Y = 0,00018X + 0,00003 0,00147 = 0,00003X + 0,00003
0,00147 - 0,00003 = 0,00003X
X =
X = 8,0 g/ml
Lampiran 16. Perhitungan Statistik Hidrokortison Asetat pada krim merek X.
SD =
=
=
= 3,0729
Pada interval kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n-1= 5, maka t(α/2,dk) = 4,0321
Data diterima jika t hitung < t tabel
t hitung 1 = =
t hitung 2
=
= 0,3905t hitung 3 = = 3,4669
t hitung 4 = = 1,9128
t hitung 5 = = 1,1317
t hitung 6 = = 1,1158
No. X
Kadar (%)
2
1 98,67 -0,41 0,1681
2 99,59 -0,49 0,2401
3 104,43 4,35 18,9225
4 97,68 -2,4 5,76
5 98,66 -1,42 2,0164
6 101,48 1,4 1,96
Lampiran 16. (Lanjutan)
Dari hasil perhitungan tersebut diperoleh bahwa semua t hitung < t tabel, maka semua data tersebut diterima.
Kadar hidrokortison asetat dalam krim merek X: = ± (
t
α/2, dk) x SD/√n)= 100,08 ± (4,0321 x 3,0729/√6) = (100,08 ± 5,0591)%
Kadar hidrokortison asetat dalam krim merek X tiap gram:
= x 25mg
Lampiran 17. Perhitungan Statistitik Kloramfenikol pada krim merek X
SD =
=
=
= 1,9211
Pada interval kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n-1= 5, maka t(α/2,dk) = 4,0321
Data diterima jika t hitung < t tabel
t hitung 1 = = 2,5752
t hitung 2 = = 2,8939
t hitung 3 = = 1,4023
t hitung 4 = = 0,0892
t hitung 5 = = 2,4859
t hitung 6 = = 2,6134
No. X
Kadar (%)
1 100,3 -2,02 4,0804
2 103,05 -2,27 5,1529
3 103,47 1,1 1,21
4 102,39 0,07 0,0049
5 100,37 -1,95 3,8025
6 104,37 2,05 4,2025
Lampiran 17. (Lanjutan)
Dari hasil perhitungan tersebut diperoleh bahwa semua t hitung < t tabel, maka semua data tersebut diterima.
Kadar kloramfenikol dalam krim merek X: = ±
(t
α/2, dk) x SD/√n)= 102,32 ± (4,0321 x 1,9211/√6) = (102,32 ± 3,1627) %
Kadar kloramfenikol dalam krim merek X tiap gram:
= x 20 mg
Lampiran 18. Spektrum Serapan Sediaan Krim merek X pada Uji Perolehan Kembali
a. Spektrum serapan perolehan kembali 80% pada sediaan krim merek X
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00561
0.00000
-0.01000
[image:44.596.118.492.126.472.2]-0.02001
Gambar 44. Spektrum serapan perolehan kembali 80% pada sediaan krim merek X
Tabel absorbansi perolehan kembali 80% pada sediaan krim merek X: No Perlakuan Panjang gelombang Absorbansi Deskripsi
1 80-1 222,2 nm 0,00083 H. Asetat
228,4 nm 0,00122 Kloramfenikol
2 80-2 222,2 nm 0,00082 H. Asetat
228,4 nm 0,00122 Kloramfenikol
3 80-3 222,2 nm 0,00082 H. Asetat
[image:44.596.131.492.552.658.2]Lampiran 18. (lanjutan)
b. Spektrum serapan perolehan kembali 100% pada sediaan krim merek X
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.00718
0.00000
-0.01000
[image:45.596.117.495.151.465.2]-0.02129
Gambar 45. Spektrum serapan perolehan kembali 100% pada sediaan krim merek X
Tabel absorbansi perolehan kembali 100% pada sediaan krim merek X No Perlakuan Panjang gelombang Absorbansi Deskripsi
1 100-1 222,2 nm 0,00104 H. Asetat
228,4 nm 0,00152 Kloramfenikol
2 100-2 222,2 nm 0,00104 H. Asetat
228,4 nm 0,00155 Kloramfenikol
3 100-3 222,2 nm 0,00104 H. Asetat
[image:45.596.131.492.552.657.2]Lampiran 18. (Lanjutan)
c. Spektrum serapan perolehan kembali 120% pada sediaan krim merek X
nm.
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
A
b
s.
0.01142
0.00000
-0.01000
[image:46.596.117.496.169.506.2]-0.01603
Gambar 46. Spektrum serapan perolehan kembali 120% pada sediaan krim merek X
Tabel absorbansi perolehan kembali 120% pada sediaan krim merek X No Perlakuan Panjang gelombang Absorbansi Deskripsi
1 120-1 222,2 nm 0,00123 H. Asetat
228,4 nm 0,00182 Kloramfenikol
2 120-2 222,2 nm 0,00123 H. Asetat
228,4 nm 0,00182 Kloramfenikol
3 120-3 222,2 nm 0,00121 H. Asetat
[image:46.596.133.492.596.702.2]Lampiran 19. Data Hasil Persen Perolehan Kembali Hidrokortison Asetat pada sediaan krim merek X
Kon sen-trasi (%) Penim-bangan (g) Absor-bansi pada = 222,20 nm
Konsentrasi Baku yang ditambahka n (mg) % peroleh-an kembali Setelah penambaha n baku (mg) Sebelum penambah- an baku (mg) 80
0,5773 0,00083 20,5 14,44 6,018 101,69
0,5665 0,00082 20,25 14,17 6,018 101,03
0,5663 0,00082 20,25 14,17 6,018 101,03
100
0,7226 0,00104 25,75 18,08 7,523 101,98
0,7327 0,00104 25,75 18,33 7,523 98,63
0,7227 0,00104 25,75 18,08 7,523 101,92
120
0,8598 0,00123 30,5 21,51 9,027 99,59
0,8600 0,00123 30,5 21,52 9,027 99,48
0,8388 0,00121 30 20,98 9,027 99,81
Rata-rata (% recovery) = 100,46
Standard Deviation (SD) = 1,15
Lampiran 20. Data Hasil Persen Perolehan Kembali Kloramfenikol pada sediaan krim merek X.
Kon sen-trasi (%) Penim-bangan (g) Absor-bansi pada = 228,40 nm
Konsentrasi Baku yang ditambahkan (mg) % peroleh -an kembali Setelah penambaha n baku (mg)
Sebelum penambah-
an baku (mg)
80
0,5773 0,00122 16,53 11,814 4,799 98,25
0,5665 0,00121 16,4 11,59 4,799 99,70
0,5663 0,00121 16,38 11,588 4,799 100,43
100
0,7226 0,00152 20,7 14,79 5,999 98,58
0,7327 0,00155 21,11 14,99 5,999 101,85
0,7227 0,00152 20,69 14,789 5,999 98,53
120
0,8598 0,00182 24,85 17,59 7,199 100,98
0,8600 0,00182 24,86 17,60 7,199 100,80
0,8388 0,00177 24,17 17,17 7,199 101,54
Rata-rata (% recovery) = 100,07
Standard Deviation (SD) = 1,37
Lampiran 21. Contoh Perhitungan Persentase Perolehan Kembali (%recovery) Sampel yang digunakan adalah krim merek X
Berat kesetaraan penimbangan sampel pada penetapan kadar = 25 mg Perolehan 80%
Hidrokortison asetat 80% = x 25 mg = 20 mg Krim hidrokortison asetat 70% = x 20 mg = 14 mg Penimbangan serbuk setara 14 mg hidrokortison asetat Sampel yang ditimbang =
mg mg
25 14
x 1 g = 0,560 g Baku hidrokortison asetat 30% = x 20 = 6 mg Jumlah kloramfenikol dalam krim yang ditimbang : = g g 1 560 , 0
x 20 mg = 11,2 mg
Baku kloramfenikol yang ditambahkan :
= mg = 4,8 mg
Perolehan 100%
Hidrokortison asetat 100% = x 25 mg = 25 mg
Krim hidrokortison asetat 70% = x 25 mg = 17,5 mg Penimbangan krim setara 17,5 mg hidrokortison asetat Sampel yang ditimbang =
g g 25 5 , 17
x 1 g = 0,700 g Baku hidrokortison asetat l 30% = x 25 = 7,5 mg Jumlah kloramfenikol dalam krim yang ditimbang : = g g 1 700 , 0
x 20 mg = 14 mg
Baku kloramfenikol yang ditambahkan :
= = 6 mg
Lampiran 21. (Lanjutan)
Perolehan 120%
Hidrokortison asetat 120% = x 25 mg = 30 mg Krim hidrokortison asetat 70% = x 30 mg = 21 mg Penimbangan serbuk setara 21 mg hidrokortison asetat Sampel yang ditimbang =
mg mg
25 21
x 1 g= 0,840 g Baku hidrokortison asetat 30% = x 30 mg = 9 mg Jumlah kloramfenikol dalam krim yang ditimbang : = g g 1 840 , 0
x 20 mg = 16,8 mg
Baku kloramfenikol yang ditambahkan :
= = 7,2 mg
Contoh perhitungan % perolehan kembali pada perolehan 80% Misalnya absorbansi analisis (Y) :
Penimbangan sampel = 0,5665 mg Hidrokortison asetat (222,20 nm) = 0,00082 Kloramfenikol (228,40 nm) = 0,00121 A. Hidrokortison asetat
Persamaan regresi pada panjang gelombang analisis hidrokortison asetat ( =222,20 nm):
Y = 0,00010X + 0,00001
Konsentrasi hidrokortison asetat (X):
Y = 0,00010X + 0,00001 0,00082 = 0,00010X + 0,00001 0,00082 – 0,00001 = 0,00010X
X =
X = 8,1 g/mL
Konsentrasi sampel setelah penambahan bahan baku (CF): = 1000 ) (x isonasetat ihidrokort konsentras
x faktor pengenceran = x 2500 = 20,25 mg
Konsentrasi sampel sebelum penambahan bahan baku (CA): (CA)
=
Lampiran 21. (Lanjutan) Keterangan :
A = Berat sampel yang akan ditimbang setara 14 mg krim hidrokortison asetat 70%
B = Analit hidrokortison asetat 70%
C = Kadar rata-rata sampel hidrokortison asetat (CA) =
x
(14 mg x 100,08%) = 14,17 mg Jumlah baku yang ditambahkan ( ) = D x E Keterangan :D = Baku hidrokortison asetat 30% (yang ditambahkan) E = % kadar baku hidrokortison asetat dari sertifikat analisis ( ) = 6 mg x 100,3% = 6,018 mg
Maka % perolehan kembali hidrokortison asetat: % perolehan kembali
=
x 100 %% perolehan kembali = x 100%
= 101,03%
B. Kloramfenikol
Persamaan regresi pada panjang gelombang analisis kloramfenikol ( = 228,40 nm): Y= 0,00018X + 0,00003
Konsentrasi kloramfenikol (X):
Y = 0,000018X + 0,00003 0,00121 = 0,00018X + 0,00003 0,000121 - 0,00003 = 0,00018X
X = = 6,55 g/mL
Konsentrasi awal setelah penambahan bahan baku (CF): = 1000 ) (x ikol ikloramfen konsentras
x faktor pengenceran
= x 2500
= 16,375 mg
Lampiran 21. (Lanjutan) Keterangan :
A = Berat sampel yang akan ditimbang setara 14 mg krim hidrokortison asetat 70%
B = Jumlah kloramfenikol dalam 0,5665 g berat sampel yang akan ditimbang C = Kadar rata-rata sampel kloramfenikol
CA =
x
(11,2 mg x 102,38%) = 11,59 mg Jumlah baku yang ditambahkan ( ) = D x E Keterangan :D = Baku kloramfenikol 30% (yang ditambahkan) E = % kadar baku kloramfenikol dari sertifikat analisis ( ) = 4,8 mg x 99,99%
= 4,799 mg
Maka % perolehan kembali kloramfenikol % perolehan kembali = x 100 %
% perolehan kembali = x 100%
Lampiran 22. Perhitungan Rata-Rata, Standar Deviasi dan Relatif Standar deviasi Perolehan Kembali Hidrokortison asetat pada sediaan krim merek X.
SD =
=
= 1,15
RSD =
x
100%
=
x100%=1,15%
No KadarPerolehan
Kembali[X](%) Xi-X (Xi–X)2
1. 100,69 0,23 0,0529
2. 101,03 0,57 0,3249
3. 101,03 0,57 0,3249
4. 98,63 -1,83 3,3489
5. 101,98 1,52 2,3104
6. 101,92 1,46 2,1316
7. 99,81 -0,65 0,4225
8. 99,59 -0,87 0,7569
9. 99,48 -0,98 0,9604
Lampiran 23. Perhitungan Rata-Rata, Standar Deviasi dan Relatif Standar Deviasi Perolehan Kembali Kloramfenikol pada sediaan krim merek X
SD =
=
= 1,37
RSD
=
x
100%= x 100%
= 1,37% No
KadarPerolehan
Kembali [X] (%) Xi-X (Xi–X)2
1. 98,25 -1,87 3,4969
2. 99,70 -0,37 0,1369
3. 100,43 0,36 0,1296
4. 101,85 1,78 3,1684
5. 98,58 -1,49 2,2201
6. 98,53 -1,54 2,3716
7. 101,54 1,47 2,1609
8. 100,98 0,91 0,8281
9. 100,80 0,73 0,5329
DAFTAR PUSTAKA
Cairns, D. (2008). Essentials of Pharmaceutical Chemistry. Third Edition. London: Pharmaceutical Press. Halaman 177 - 179.
Ditjen. BKAK., (2014). Farmakope Indonesia. Edisi Kelima. Jakarta:
Kementerian Kesehatan RI. Halaman 536, 686.
Ermer, J., dan McB. Miller, J.H. (2005). Method Validation in Pharmaceutical Analysis. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Halaman 16, 63-79.
Ganjar, I.G., dan Rohman, A. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Halaman 235-236, 240-243 dan 464.
Gunawan, S.G., Setiabudy, R., Nafrialdi dan Elysabeth. (2007). Farmakologi dan Terapi. Edisi Kelima. Jakarta: FKUI. Halaman 505, 700.
Harmita. (2004). Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode I dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian I(3). Halaman 117-135.
Hayun, Leswara, N.D., dan Zarkasih, L. (2014). Penetapan Kadar Hidrokortison Asetat Dalam Sediaan Krim Mengandung Pengawet Nipagin Secara Spektrofotometri Derivatif Orde Pertama. Original Article. Depok: Fakultas Farmasi Universitas Indonesia. Halaman 95.
Maftuhah, H., dan Abidin, T. (2009). Oral Kortikosteroid. Mataram: Fakultas Kedokteran Universitas Mataram.
Moffat, A.C., Osselton, M.D., dan Widdop, B. (2005). Clarke’s Analysis of Drug
and Poisons. Third Edition. London: Pharmaceutical Press. Halaman 324 -326.
Munson, J.W. (1984). Pharmaceutical Analysis – Part B Modern Methods.
Penerjemah : Harjana. (1991). Analisis Farmasi Metode Modern – Bagian B. Surabaya: Erlangga University Press. Halaman 385.
Nurhidayati, L. (2007). Spektrofotometri Derivatif dan Aplikasinya dalam Bidang Farmasi. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 5(2). Jakarta Selatan: Fakultas Farmasi Universitas Pancasila. Halaman 93-99.
Owen, A.J. (1995). Uses of Derivative Spectroscopy Aplication Note UV - Visible Spectroscopy. Germany: Agilent Technologies.
Schwartz, R.A., dan Al Mutairi, N. (2010). Topical Antibiotic In Dermatology: An Update, Review Article. The Gulf Journal Od Dermatology And Venereology. USA: New Jersey Medical School.Volume 17.
Skujins, S., dan Varian, A.G. (1986). Applications of UV - Visible Derivative Spectrophotometry. Switzerland: CH 6300 Zug. Halaman 1 - 30.
Sudjana. (2005). Metode Statistika. Bandung: Penerbit Tarsito. Halaman 93, 145,201, 225.
Tan, H.T, dan Rahardja, K. (2007). Obat-Obat Penting: Khasiat, Penggunaan, Da Efek-Efek Sampingnya. Edisi Keenam. Jakarta: PT. Elex Media Komputindo. Halaman 85.
Talsky, G. (1994). Derivative Spectrophotometry: Low and High Order.
Weinheim: VCH Verlagsdesellschaft mbH. Halaman 16-19.
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian deskriptif dengan metode spektrofotometri derivatif terhadap analisa hidrokortison asetat dan kloramfenikol yang terkandung pada sediaan krim merek X.
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni sampai dengan September 2015 di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.3 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer UV-Visible (dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 35), Personal Computer (PC) yang dilengkapi software UV Probe 2.42 (UV-1800 Shimadzu), neraca analitik (Mettler Toledo), kuvet, kertas saring, bola karet, spatula, alat gelas dan alat-alat lainnya yang diperlukan dalam penyiapan sampel.
3.4 Bahan
3.5 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif, yaitu ditentukan atas dasar pertimbangan bahwa sampel yang terambil mempunyai karakteristik yang sama dengan yang diteliti (Sudjana, 2005). Sampel yang digunakan yaitu krim merek X yang mengandung hidrokortison asetat 25 mg dan kloramfenikol 20 mg. Gambar sediaan dan daftar spesifikasi sediaan krim dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2 halaman 48 dan 49.
3.6 Prosedur Penelitian
3.6.1 Pembuatan Larutan Induk Baku dan Larutan Standar 3.6.1.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Hidrokortison Asetat
Ditimbang dengan seksama 50 mg baku pembanding kloramfenikol kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, ditambahkan 10 ml dengan etanol absolut hingga larut, dicukupkan volume dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 500 g/ml (LIB I). Dari larutan LIB I dipipet 0,5 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 50 g/ml (LIB II). Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 51.
3.6.1.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Kloramfenikol
Dari larutan LIB I dipipet 0,5 mL dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 mL, dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 50 g/mL (LIB II). Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 54.
3.6.1.3 Pembuatan Larutan Standar Hidrokortison Asetat
Larutan standar dibuat dalam 5 labu tentukur 10 ml yang memiliki konsentrasi masing-masing 6 g/ml, 8 g/ml, 10 g/ml, 12 g/ml, dan 14 g/ml, dengan cara mengencerkan sebanyak 1,2 ml, 1,6 ml; 2 ml; 2,4 ml; dan 2,8 ml secara berurutan dari LIB II hidrokortison asetat menggunakan pelarut etanol absolut. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 51. 3.6.1.4 Pembuatan Larutan Standar Kloramfenikol
Diambil sebanyak 1,6 ml; 2 ml; 2,4 ml; 2,8 ml; dan 3,2 ml dari LIB II kloramfenikol. Kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam 5 labu tentukur 10 ml. Dilarutkan dengan pelarut etanol absolut. Kemudian dicukupkan dengan pelarut yang sama untuk membuat larutan standar dengan konsentrasi 8 g/ml; 10 µg/ml, 12 g/ml; 14 µg/ml; dan 16 g/ml. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 53.
3.6.2 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum
larutan hidrokortison asetat dengan konsentrasi 10 g/ml. Diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 51.
3.6.2.2 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Kloramfenikol
Diambil sebanyak 2,4 mL dari LIB II kloramfenikol (konsentrasi = 12
g/mL) kemudian dimasukan ke dalam labu tentukur 10 mL untuk diencerkan dengan pelarut etanol absolut hingga garis tanda, lalu dikocok sampai homogen untuk memperoleh larutan dengan konsentrasi 12 g/mL. Diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 53.
3.6.3 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif
3.6.3.1 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif Hidrokortison Asetat
Dibuat spektrum serapan (tanpa diderivatkan) dari larutan standar hidrokortison asetat dengan konsentrasi 6 g/ml, 8 g/ml, 10 g/ml, 12 g/ml, dan 14 g/ml pada panjang gelombang 200-400 nm. Kemudian spektrum ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dan kedua dengan
Δ = 2 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 52.
3.6.3.2 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif Kloramfenikol
Dibuat spektrum serapan (tanpa diderivatkan) dari larutan standar kloramfenikol dengan konsentrasi 8 g/ml; 10 g/ml; 12 g/ml; 14 g/ml; dan 16
Δ = 2 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 54.
3.6.4 Penentuan Zero Crossing
Penentuan zero crossing diperoleh dengan menumpangtindihkan spektrum serapan masing-masing derivat dalam berbagai konsentrasi larutan. Zero crossing
masing-masing zat ditunjukkan oleh panjang gelombang yang memiliki serapan nol pada berbagai konsentrasi.
3.6.5 Penentuan Panjang Gelombang Analisis
3.6.6 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi
3.6.6.1 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Hidrokortison Asetat
Dibuat larutan standar hidrokortison asetat dengan konsentrasi 6 g/mL; 8
g/mL; 10 g/mL; 12 g/mL; dan 14 g/mL, kemudian diukur serapan derivat
kedua (Δ = 2 nm) pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan. Kemudian dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dan nilai serapan sehingga diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b. Dan berdasarkan nilai serapan pada panjang gelombang analisis, dilakukan pula perhitungan limit deteksi / limit of detection (LOD) dan limit kuantitasi / limit of quantitation (LOQ).Untuk menentukan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) dapat digunakan rumus :
Keterangan : SB = Simpangan baku
LOD = Limit of Detection LOQ = Limit of Quantitation
3.6.6.2 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Kloramfenikol Dibuat larutan standar kloramfenikol dengan konsentrasi 8 g/ml; 10
g/ml; 12 g/ml; 14 g/ml dan 16 g/ml, kemudian diukur serapan derivat kedua
dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dan nilai serapan sehingga diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b. Dan berdasarkan nilai serapan pada panjang gelombang analisis, dilakukan perhitungan limit deteksi / limit of detection (LOD) dan limit kuantitasi / limit of quantitation (LOQ). Perhitungan untuk menentukan LOD dan LOQ seperti rumus sebelumnya.
3.6.7 Penentuan Kadar Hidrokortison asetat dan Kloramfenikol dalam Sediaan Krim
Ditimbang tube krim merek X yang mengandung hidrokortison asetat 25 mg dan kloramfenikol 20 mg kemudian dikeluarkan isinya dari dalam tube, kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass. Selanjutnya ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan 25 mg hidrokortison asetat, dihitung kesetaraan hidrokortison asetat yang terkandung di dalamnya (penimbangan krim dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan). Selanjutnya dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dan ditambahkan etanol absolute 10 ml, disonikasi selama 15 menit, sampai larut, kemudian dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda, dikocok sampai homogen. Larutan tersebut kemudian disaring, lebih kurang 10 ml filtrat pertama dibuang. Filtrat selanjutnya ditampung. Kemudian dari filtrat ini dipipet sebanyak 0,5 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan yang didalamnya terdapat hidrokortison asetat dengan konsentrasi 10 g/ml dan kloramfenikol
konsentrasi 8 g/ml. Diukur serapan pada panjang gelombang 200−400 nm,
selanjutnya spektrum serapan ditransformasikan menjadi spektrum serapan
asetat dan kloramfenikol masing-masing 222,2 nm dan 228,4 nm. Bagan alir prosedur penelitian penentuan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 55.
3.6.8 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik
Data perhitungan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji T. Tabel distribusi t dapat dilihat pada Lampiran 16 halaman 87-90.
Rumus yang digunakan adalah :
SD =
1 -n
X
-Xi 2
Untuk mencari t hitung digunakan rumus:
t hitung = SD n
X Xi
/
Data diterima jika thitung < ttabel pada interval kepercayaan 99% dengan nilai
α = 0,01.
Keterangan :
SD = standard deviation / simpangan baku Xi = kadar dalam satu perlakuan
X = Kadar rata-rata dalam satu sampel (mg/100g)
n = jumlah pengulangan
Menurut Sudjana (2005) untuk menghitung kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol sebenarnya dalam sampel secara statistik dapat digunakan rumus:
µ = X ± [(t α/2, dk) x (SD / √n )]
Keterangan : SD = standard deviation / simpangan baku
X = Kadar rata-rata dalam satu sampel
n = jumlah perlakuan
t = harga ttabel sesuai dengan derajat kepercayaan 3.6.9 Uji Validasi
3.6.9.1 Uji Akurasi
Uji akurasi dilakukan dengan metode penambahan bahan baku yaitu dengan membuat 3 konsentrasi analit sampel dengan rentang spesifik 80%, 100%, 120%. Dimana pada masing-masing rentang spesifik digunakan 70% sampel dan 30% baku yang akan ditambahkan (Harmita, 2004).
Kemudian campuran sampel dan baku diukur serapannya pada panjang gelombang 200 – 400 nm, selanjutnya spektrum serapan ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat kedua dengan Δ 2 nm pada panjang gelombang analisis hidrokortison asetat dan kloramfenikol masing-masing 222,2 nm dan 228,4 nm. Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus:
% perolehan kembali = 100 %
Keterangan:
3.6.9.2 Uji Presisi
Presisi diukur sebagai simpangan baku relatif atau koefisien variasi. Presisi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual ketika suatu metode dilakukan secara berulang untuk sampel yang homogen. Nilai simpangan baku relatif yang memenuhi persyaratan menunjukkan adanya keseksamaan metode yang dilakukan (Harmita, 2004). Simpangan baku relatif dapat dihitung dengan rumus berikut ini :
RSD =
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penentuan Spektrum Serapan Maksimum
Penentuan spektrum serapan maksimum dilakukan pada panjang gelombang 200–400 nm. Pengukuran hidrokortison asetat pada konsentrasi 10
g/mL, sedangkan untuk kloramfenikol pada konsentrasi 12 g/ml. Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh panjang gelombang maksimum hidrokortison asetat pada 241,8 nm dan kloramfenikol pada 273,4 nm. Spektrum serapan maksimum hidrokortison asetat konsentrasi 10 g/ml dan kloramfenikol konsentrasi 12 g/ml masing-masing dapat dilihat pada Gambar 4.1 dan 4.2.
nm.
200,00 250,00 300,00 350,00 400,00
A
bs.
0,526
0,400
0,200
0,000 -0,052
Gambar 4.1 Spektrum serapan maksimum hidrokortison asetat konsentrasi 10
nm.
200,00 250,00 300,00 350,00 400,00
A
bs.
0,706
0,600
0,400
0,200
0,000 -0,062
Gambar 4.2 Spektrum serapan maksimum kloramfenikol konsentrasi 12 g/ml
nm .
200,00 250,00 300,00 350,00 400,00
Ab
s.
0,600
0,400
0,200
0,000
Gambar 4.3 Spektrum tumpang tindih serapan maksimum hidrokortison asetat konsentrasi 10µg/ml dan kloramfenikol konsentrasi 12 µg/ml
Dari Gambar 4.3 dapat dilihat bahwa hasil tumpang tindih serapan hidrokortison asetat dan kloramfenikol terdapat serapan yang berimpit. Berdasarkan hasil spektrum tumpang tindih serapan maksimum diatas maka tidak dapat dilakukan penetapan kadar masing-masing komponen maka dilakukan derivatisasi.
[image:71.595.121.491.81.284.2] [image:71.595.121.516.323.498.2]4.2 Hasil Penentuan Spektrum Serapan
[image:72.595.149.485.412.580.2]Ketika dilakukan orientasi dengan berbagai konsentrasi yaitu 6 µg/ml, 8 µg/ml, 10 µg/ml, 12 µg/ml, 14 µg/ml dan untuk kloramfenikol dengan konsentrasi 8 µg/ml, 10 µg/ml, 12µg/ml, 14 µg/ml, 16 µg/ml, ternyata konsentrasi yang terbaik adalah 8 µg/ml:10 µg/ml dengan perbandingan 4:5. Hasil penentuan spectrum serapan dibuat terhadap larutan hidrokortison asetat dengan konsentrasi 10 µg/ml dan larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 8µg/ml, kemudian dibuat spektrum serapan pada panjang gelombang 200-400 nm. Spektrum serapan dari hidrokortison asetat 10 µg/ml dan kloramfenikol 8 µg/mL masing-masing dapat dilihat pada Gambar 4.4 dan Gambar 4.5. Spektrum tumpang tindih serapan hidrokortison asetat 10 µg/mL dan kloramfenikol 8 µg/mL dapat dilihat pada Gambar 4.6.
nm .
200,00 250,00 300,00 350,00 400,00
Ab
s.
0,600
0,400
0,200
0,000
nm .
212.71 250.00 300.00 350.00 400.00
Ab
s.
0.5258
0.4000
0.2000
0.0000
-0.0521
Gambar 4.5 Spektrum serapan kloramfenikol konsentrasi 8 µg/mL
nm .
200,00 250,00 300,00 350,00 400,00
Ab
s.
0,600
0,400
0,200
0,000
Gambar 4.6 Spektrum tumpang tindih serapan hidrokortison asetat dan kloramfenikol
Dari Gambar 4.6 dapat dilihat bahwa hasil tumpang tindih serapan hidrokortison asetat 10 µg/mL dan kloramfenikol 8 µg/mL terdapat serapan yang berimpit. Maka dilakukan derivatisasi untuk memperoleh zero crossing terhadap masing-masing komponen.
4.3 Penentuan Zero crossing pada Serapan Derivat
4.3.1 Penentuan Zero crossing pada Serapan Derivat Pertama
Spektrum serapan hidrokortison asetat konsentrasi 10 µg/mL dan kloramfenikol konsentrasi 8 µg/mL ditransformasikan menjadi spektrum serapan
derivat pertama dengan Δ = 2 nm. Hasil penentuan zero crossing pada derivat pertama diperoleh dengan menumpangtindihkan spektrum serapan derivat pertama pada masing-masing zat. Zero crossing pada spektrum derivat pertama dari masing-masing zat ditunjukkan oleh panjang gelombang yang memiliki serapan nol. Spektrum hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada spektrum serapan derivat pertama masing-masing dapat dilihat pada Gambar 4.7 dan 4.8. Spektrum tumpang tindih serapan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dapat dilihat pada Gambar 4.9.
nm .
212.71 250.00 300.00 350.00 400.00
Ab
s.
0.0200
0.0100
0.0000
-0.0100
-0.0200 -0.0221
Gambar 4.7 Spektrum serapan hidrokortison asetat konsentrasi 10 µg/mL pada derivat pertama
nm .
212.71 250.00 300.00 350.00 400.00
Ab
s.
0.0200
0.0100
0.0000
-0.0100
[image:74.595.111.525.231.689.2]-0.0200 -0.0221
[image:74.595.124.522.508.679.2]nm .
212.71 250.00 300.00 350.00 400.00
Ab
s.
0.0200
0.0100
0.0000
-0.0100
-0.0200 -0.0221
Gambar 4.9 Spektrum tumpang tindih serapan hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada derivat pertama
Dari Gambar 4.9 dapat dilihat hasil tumpang tindih serapan derivat pertama hidrokortison asetat konsentrasi 10 µg/ml dan kloramfenikol konsentrasi 8 µg/ml tidak diperoleh zero crossing sehingga tidak dapat dilakukan penentuan kadar masing-masing zat maka dilanjutkan pada derivat kedua.
4.3.2 Penentuan Zero crossing pada Serapan Derivat Kedua
Hasil penentuan spektrum serapan derivat kedua dibuat dengan terlebih dahulu membuat spectrum serapan dari larutan hidrokortison asetatdengan konsentrasi 10 µg/ml dan larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 8 µg/ml pada panjang gelombang 200-400 nm. Spektrum serapan yang telah diperoleh ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat kedua dengan ∆ 2 nm. Spektrum serapan derivat kedua dari masing-masing zat tersebut ditumpangtindihkan. Spektrum hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada serapan derivat kedua dapat dilihat pada Gambar 4.10 dan 4.11. Spektrum tumpang tindih hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada serapan derivat kedua pada Gambar 4.12.
nm .
212.71 250.00 300.00 320.00
Ab
s.
0.0060
0.0050
0.0000
-0.0050
-0.0060
Gambar 4.10 Spektrum serapan derivat kedua hidrokortison asetat konsentrasi 10 µg/ml
nm .
212.71 250.00 300.00 320.00
Ab
s.
0.0060
0.0050
0.0000
-0.0050
-0.0060
[image:76.595.110.511.78.484.2]nm .
212.71 250.00 300.00 320.00
Ab
s.
0.0060 0.0050
0.0000
-0.0050 -0.0060
301.4 nm
293.8 nm 287.4 nm 257.4 nm
255.6 nm 228.4 nm
222.2 nm
Gambar 4.12 Spektrum tumpang tindih serapan derivat kedua hidrokortison asetat dan kloramfenikol
Dari Gambar 4.12 dapat dilihat tumpang tindih serapan hidrokortison asetat dan kloramfenikol diperoleh hasil zero crossing pada serapan derivat kedua terdapat pada panjang gelombang 222,20 nm, 256,80 nm dan 257,60 untuk hidrokotison asetat. Sedangkan pada panjang gelombang 228,40 nm, 255,60 nm dan 293,8 nm untuk kloramfenikol. Hasil zero crossing dari hidrokortison asetat dan kloramfenikol digunakan untuk penentuan kadar campuran kedua komponen tersebut.
4.4 Hasil Penentuan Panjang Gelombang Analisis Hidrokortison asetat dan Kloramfenikol
Penentuan panjang gelombang analisis dilakukan dengan membuat larutan hidrokortison asetat 10 g/ml, larutan kloramfenikol 8 g/ml dan larutan
campuran hidrokortison asetat 10 g/ml dan kloramfenikol 8 g/ml. Kemudian dibuat spektrum serapan derivat pertama masing-masing larutan hidrokortison
[image:77.595.116.514.83.285.2]10 g/ml, larutan kloramfenikol 8 g/ml, selanjutnya ditumpang tindihkan, hal
yang sama juga dilakukan untuk spektrum derivat kedua. Untuk menentukan panjang gelombang analisis pada spektrum serapan pada masing-masing derivat dilakukan dengan mengamati panjang gelombang yang menunjukkan serapan senyawa pasangannya nol dan serapan senyawa lain dan campurannya memiliki nilai serapan sama atau hampir sama. Spektrum tumpang tindih serapan
hidrokortison asetat 10 g/ml, larutan kloramfenikol 8 g/ml dan campuran
hidrokortison asetat 10 g/ml dan larutan kloramfenikol 8 g/ml pada spektrum
serapan derivat kedua dapat dilihat pada Gambar 4.14. Spektrum panjang gelombang analisis hidrokortison asetat dan kloramfenikol dapat dilihat pada Gambar 4.14 dan 4.15.
nm .
212.71 220.00 230.00 240.00 250.00
Ab
s.
0.0060 0.0050
0.0000
-0.0050 -0.0060
Gambar 4.13 Spektrum tumpang tindih serapan derivat kedua hidrokortison asetat, kloramfenikol dan campuran hidrokortison asetat dan kloramfenikol
Hidrokortison asetat 10 µg/ml Kloramfenikol 8 µg/ml
[image:78.595.116.514.415.625.2]nm .
212.71 220.00 230.00 240.00 250.00
Ab s. 0.0060 0.0050 0.0000 -0.0050 -0.0060 222.2 nm
Gambar 4.14 Panjang gelombang analisis hidrokortison asetat 222,20 nm
nm .
212.71 220.00 230.00 240.00 250.00
Ab s. 0.0060 0.0050 0.0000 -0.0050 -0.0060 228.4 nm
Gambar 4.15 Panjang gelombang analisis kloramfenikol = 228,40 nm
Berdasarkan Gambar 4.13, diperoleh panjang gelombang yang dapat dipakai untuk penentuan kandungan hidrokortison asetat dan kloramfenikol adalah pada serapan derivat kedua. Hal tersebut diketahui berdasarkan pemilihan panjang gelombang analisis pada setiap derivat. Panjang gelombang analisis didapatkan dengan menentukan zero crossing untuk hidrokortison asetat dan kloramfenikol.
Panjang gelombang analisis ditentukan dengan cara menumpangtindihkan spektrum serapan masing-masing derivat dari hidrokortison asetat, kloramfenikol
Hidrokortison asetat 10 µg/ml Kloramfenikol 8 µg/ml
Campuran hidrokortison asetat 10µg/ml dan kloramfenikol 8 µg/ml
Hidrokortison asetat 10 µg/ml Kloramfenikol 8 µg/ml
[image:79.595.116.509.87.271.2] [image:79.595.115.534.314.499.2]dan campuran hidrokortison asetat dan kloramfenikol. Selanjutnya ditentukan panjang gelombang dimana absorbansi salah satu zat berada pada nilai nol, sedangkan zat lain memiliki nilai serapan hampir sama. Pada serapan derivat pertama, panjang gelombang analisis untuk hidrokortison asetat dapat ditemukan. Namun panjang gelombang analisis untuk kloramfenikol tidak ditemukan, sehingga penetapan kadar campuran hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada sediaan krim tidak bisa dilakukan pada derivat pertama. Oleh karena itu dibuat spektrum serapan derivat kedua, kemudian dilakukan penentuan panjang gelombang analisis dengan cara yang sama seperti pada derivat pertama.
Tabel 4.1 Panjang Gelombang Analisis dan Absorbansi pada Derivat Kedua
Panjang Gelombang
(nm)
Absorbansi Hidrokortison
asetat
10 g/mL
Kloramfenikol
8 g/mL Hidrokortison Campuran asetat dan Kloramfenikol
222,20 0,0009 0,0000 0,0011
228,00 0,0000 0,0015 0,0016
228,20 0,0000 0,0014 0,0015
228,40 0,0000 0,0015 0,0015
255,60 0,0000 0,0002 0,0002
Berdasarkan Tabel 4.1 diperoleh panjang gelombang analisis hidrokortison asetat dan kloramfenikol yang digunakan masing-masing adalah 222,20 nm dan 228,40 nm. Penentuan panjang gelombang analisis didasarkan pada nilai absorbansi ketiga larutan pada panjang gelombang tersebut.
4.5 Hasil Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi 4.5.1 Kurva Kalibrasi
Linearitas kurva kalibrasi menunjukkan hubungan yang linier antara absorbansi dengan konsentrasi. Persamaan regresi hidrokortison asetat, Y = 0,00010X + 0.0001 dengan korelasi r = 0,997 dan kloramfenikol, Y = 0.00018X + 0,00003 dengan korelasi r = 0,997. Nilai r > 0,995 menunjukkan adanya korelasi linier antara X dan Y (Moffat, dkk., 2005). Kurva kalibrasi hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada masing-masing panjang gelombang 222,20 nm dan 228,40 nm dapat dilihat pada Gambar 3.16 dan 3.17. Data kalibrasi, persamaan regresi dan koefisien korelasi dapat dilihat pada Lampiran 10 halaman 78-79.
Standard Curve
Conc. (mg/l)
0.00000 5.00000 10.00000 15.00000
A
b
s.
0.00153
0.00100
0.00050
[image:82.595.115.504.356.502.2]0.00000
Gambar 4.16 Kurva kalibrasi hidrokortison asetat pada panjang gelombang 222,2 nm
Standard Curve
Conc. (mg/l)
0.00000 5.00000 10.00000 15.00000 17.00000
A
b
s.
0.00324
0.00200
0.00100
[image:82.595.111.507.359.673.2]0.00000
4.5.2 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung dari persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi. Batas deteksi hidrokortison asetat dan kloramfenikol adalah 1,76847 g/ml dan 0,9473 g/ml secara berturut-turut dan batas kuantitasi hidrokortison asetat dan kloramfenikol adalah 5,8949 g/ml dan
3,158 g/ml secara berturut-turut. Perhitungan batas deteksi dan batas kuantitasi tersebut dapat dilihat pada Lampiran 11 halaman 80 dan Lampiran 12 halaman 81.
Hal tersebut menunjukkan bahwa penentuan kadar hidrokortison asetat
dengan konsentrasi 10 g/mL dan kloramfenikol dengan konsentrasi 8 g/mL
dapat dideteksi dan diukur menggunakan metode spektrofotometri derivatif. Batas deteksi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi. Batas kuantitasi didefenisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Gandjar dan Rohman, 2007).
4.6 Hasil Penentuan Kadar Hidrokortison Asetat dan Kloramfenikol dalam Sediaan Krim
Penentuan penetapan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam salep yang beredar diapotik mengandung masing-masing hidrokortison asetat 25 mg dan kloramfenikol 20 mg. Sedangkan pengukuran hidrokortison asetat dan kloramfenikol baku pada sediaan kedua masing-masing hidrokortison asetat 10
g/ml dan kloramfenikol 8 g/ml.
spektrum serapan derivat kedua dengan Δ = 2 nm. Berdasarkan spektrum tersebut dapat ditentukan absorbansi hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada panjang gelombang analisis yang telah diperoleh sebelumnya, yaitu panjang gelombang 222,20 nm dan 228,40 nm. Contoh perhitungan penetapan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dapat dilihat pada Lampiran 15 halaman 84-86.
Spektrum serapan penetapan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada krim merek X dapat dilihat pada Lampiran 13 halaman 82. Data hasil perhitungan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada sediaan krim merek X setelah dilakukan analisa secara statistik (data dan perhitungan pada Lampiran 16–Lampiran 17) dapat dilihat pada Tabel 4.2.
Tabel 4.2 Kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam sediaan krim merek X
No Kadar (mg)
Krim merek X (mg)
Persyaratan (mg)
1. Hidrokortison asetat 24,42-26,1 23,75-26,28
2. Kloramfenikol 20,06-20,874 19,83-21,096
Dapat dilihat pada Tabel 4.2 kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek X memenuhi persyaratan.
4.7 Hasil Uji Validasi 4.7.1 Hasil Uji Akurasi
[image:84.595.113.512.429.543.2]gelombang analisis yang digunakan. Spektrum serapan uji perolehan kembali Hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek X dapat dilihat pada Lampiran 18 halaman 91-93. Sedangkan data dan perhitungan uji perolehan kembali hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim dapat dilihat pada Lampiran 19-21 halaman 94-99.
Tabel 4.3 menunjukkan bahwa rata-rata persen perolehan kembali yang diperoleh yaitu 100,46% untuk hidrokortison asetat dan 100,07% untuk kloramfenikol. Dimana rata-rata persen perolehan kembali memenuhi syarat akurasi untuk validasi prosedur analitik karena rata-rata berada di antara rentang 98-102% (Harmita, 2004).
Tabel 4.3 Hasil perolehan kembali hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada krim merek X.
Rentang Spesifik % Perolehan kembali Hidrokortison asetat (%) Perolehan kembali Kloramfenikol (%) 80
100,69 98,25
101,03 99,7
101,03 100,43
100
98,63 101,85
101,98 98,58
101,92 98,53
120
99,81 101,54
99,59 100,98
99,48 100,8
Rata-rata (% recovery)
Standard Deviation (SD)
Relative Standard Deviation (RSD)(%)
100,46 1,15 1,15 100,07 1,37 1,37
4.7.2 Hasil Uji Presisi
[image:85.595.114.513.400.654.2]BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang dilakukan, maka dapat disimpulkan:
a. Metode spektrofotometri derivative dengan zero crossing dapat digunakan untuk menetapkan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol.
b. Kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada krim merek X memenuhi persyaratan pada USP 30 dan NF 25 (2007) dan Ditjen. BKAK., (2014). c. Uji validasi yang dilakukan pada krim merek X menunjukkan bahwa metode
spektrofotometri derivatif memenuhi persyaratan validasi.
5.2 Saran
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1Uraian Bahan
2.1.1 Hidrokortison Asetat
Menurut Ditjen. BKAK., (2014), uraian tentang hidrokortison asetat adalah sebagai berikut :
[image:88.595.211.428.301.451.2]Rumus Struktur :
Gambar 2.2 Struktur Hidrokortison Asetat
Rumus Molekul : C23H32O6 Berat Molekul : 404,50
Nama Kimia : (11β)-11,17-dihidroxipregna-4-ena-3,20 dione, 21 asetat
Kandungan : Mengandung hidrokortison asetat, C23H32O6 tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.
Kelarutan : Tidak larut dalam air; sukar larut dalam kloroform.
Hidrokortison asetat merupakan obat golongan kortikosteroid. Sebagian besar khasiat yang diharapakan dari pemakaian kortikosteroid adalah sebagai antiinflamasi, antialergi. Karena khasiat inilah kortikosteroid banyak digunakan dalam bidang dermatologi. Di bidang dermatologi pada umumnya lebih digunakan sebagai obat antialergi (Maftuhah dan Abidin, 2009).
2.1.2 Kloramfenikol
Menurut Ditjen. BKAK., (2014), uraian tentang kloramfenikol adalah sebagai berikut :
Rumus struktur :
Gambar 2.1 Struktur kloramfenikol
Rumus Molekul : C11H12Cl2N2O5 Berat Molekul : 323,13
Nama Kimia : D-treo-(-)-2,2-Dikloro-N-[ß-hidroksi-a-(hidroksimetil)-nitrofenetil]asetamida
Kandungan : tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 130,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.
praktis netral terhadap lakmus P; stabil dalam l
