i
MODUL PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI I
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA
LUBUK PAKAM
ii
VISI dan MISI
INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM
Visi
Menjadi Institut yang unggul dan professional dalam bidang kesehatan di tingkat Nasional dan Asia tahun 2028.
Misi
1. Menyelenggarakan pendidikan dan pengajaran yang unggul, berkarakter, dan kompeten yang adaptif terhadap perkembangan ilmu pengetahuan, teknologi, seni dan globalisasi;
2. Menyelenggarakan penelitian yang inovatif, produktif dan responsive terhadap ilmu pengetahuan, teknologi dan kebutuhan masyarakat;
3. Menyelenggarakan kegiatan pengabdian kepada masyarakat berlandaskan nilai dan tanggungjawab sosial; dan
4. Menjalin kerjasama yang baik dengan stakeholder mulai dari pemerintah, dunia usaha dan masyarakat sebagai pengguna lulusan.
iii
VISI dan MISI FAKULTAS FARMASI
Visi
Menghasilkan lulusan yang unggul dan professional dalam mutu pendidikan di bidang Farmasi Klinis dan Komunitas serta Mikrobiologi Molekuler Klinis yang Mampu Bersaing di tingkat Nasional dan Asia Tahun 2022.
Misi
1) Menyelenggarakan proses belajar mengajar yang kondusif dengan sistem yang mendukung pada FF sehingga pembelajaran tersebut menghasilkan prodi yang dapat menghasilkan alumni berkarakter unggul, kompeten, dan excellent service;
2) Menyelenggarakan proses praktik laboratorium yang kondusif dan handal di berbagai fasilitas pelayanan kesehatan masyarakat;
3) Mengoptimalkan dan mengimplementasikan penelitian bidang Farmasi Klinis dan Komunitas dan Mikrobiologi Molekuler Klinis dengan menggunakan pendekatan riset dalam bidang Farmasi dan Teknologi Laboratorium Medik;
4) Mengimplementasikan program pengabdian kepada masyarakat berbasis riset untuk menyelesaikan berbagai permasalahan di bidang Farmasi dan Teknologi Laboratorium Medik; dan
5) Mengembangkan kerjasama dengan institusi pendidikan, pelayanan, organisasi, dan stakeholders baik dalam maupun luar negeri.
iv
VISI dan MISI
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK
Visi
Menjadi program studi yang unggul dan professional dalam bidang Mikrobiologi Molekuler Klinis Tahun 2022
Misi
1. Menyelenggarakan pendidikan Teknologi Laboratorium Medik yang unggul dan excelent service dalam bidang Mikrobiologi Molekuler Klinis;
2. Menyelenggarakan proses praktik laboratorium yang kondusif diberbagai fasilitas pelayanan kesehatan masyarakat;
3. Mengoptimalkan dan mengimplementasikan penelitian di bidang Mikrobiologi Molekuler Klinis dengan menggunakan pendekatan riset dalam bidang Teknologi Laboratorium Medik;
4. Mengimplementasikan program pengabdian kepada masyarakat berbasis riset untuk menyelesaikan berbagai permasalahan di bidang Mikrobiologi Molekuler Klinis; dan
5. Mengembangkan kerjasama dengan institusi pendidikan, pelayanan, organisasi, dan stakeholders baik dalam maupun luar negeri.
v
KATA PENGANTAR
Pujisyukur kami panjatkan kepada kehadirat Allah SWT, karena atas izin-Nya Modul dari Mata Kuliah ini dapat diselesaikan. Modul ini disusun untuk menambah bahan bacaan mahasiswa dalam mengikuti perkuliahan.
Modul ini disusun untuk memenuhi kebutuhan mahasiswa Program Studi Teknologi Laboratorium Medik Fakultas Farmasi Institut Kesehatan Medistra Lubuk Pakam dalam menempuh mata kuliah. Modul ini disusun dengan kualifikasi merangkum semua materi teoritis.
Penyusun mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang tidak bisa disebutkan satu per satu atas selesai nya modu lini. Penyusun menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan modul ini. Oleh karena itu segala masukan dari berbagai pihak sangat diharapkan guna penyempurnaan modul ini.
Lubuk Pakam, Juli 2020
vi DAFTAR ISI
Visi dan Misi Inkes Medistra Lubuk Pakam ... i
Visi dan Misi Fakultas Farmasi ... ii
Visi dan Misi Program Studi Teknologi Laboratorium Medik ... iii
Kata Pengantar ... iv
Daftar Isi ... v
BAB I BAKTERI ... 1
A. Pengertian Bakteri ... 1
B. Morfologi Bakteri ... 2
C. Macam-Macam Bentuk Bakteri ... 3
D. Ukuran Bakteri ... 4
E. Susunan Sel ... 5
F. Struktur Tambahan ... 8
BAB II SEL PRIKARIOTIK ... 11
A.Pengertian Sel ... 11
B. Jenis-Jenis Sel ... 13
C. Pengertian Sel Prokariotik ... 14
D. Ciri-Ciri Sel Prokariotik ... 15
E. Struktur dan Fungsi Sel Prokariotik ... 15
F. Reproduksi Sel Prokariotik ... 17
G. Cara Geral Sel Prokariotik ... 17
BAB III SEL EUKARIOTIK ... 18
A. Pengertian Sel Eukariotik ... 18
B. Ciri-Ciri Sel Eukariotik ... 19
C. Struktur dan Fungsi Sel Eukariotik ... 20
D. Reproduksi Sel Eukariotik ... 23
BAB IV PENGENALAN, PENYIAPAN, PENGGUAAN ALAT ... 24
A. Morfologi Sel Bakteri ... 24
B. Jenis-Jensi Media ... 27
C. Sterilisasi ... 30
D. Cara Penggunaan Alat Sterilisasi ... 32
E. Metoda Pengenceran ... 37
F. Perhitungan Total Mikroba Dengan Mikroskop ... 38
G. Biakan Murni ... 40
BAB V PENGENALAN, PENYIAPAN, PENGGUAAN ALAT LANJUTAN ... 42
A. Pewarnaan Sel Bakteri ... 42
B. Berbagai Macam Metoda Pewarnaan ... 42
BAB VI KORELASI ANTARA HASIL TES MIKROSKOPIS DENGAN TES CEPAT MOLEKULER PADA PASIEN TBC 53 A. Pendahuluan ... 53
vii
B. Metode ... 54
C. Hasil ... 54
BAB VII NUTRISI DAN METABOLISME SEL BAKTERI ... 55
A. Nutrisi Bakteri ... 55
B. Metabolisme Sel Bakteri ... 59
BAB VIII PERTUMBUHAN SEL BAKTERI ... 62
A. Faktor Pertumbuhan ... 62
B. Penggolongan Jasad ... 64
C. Pertumbuhan Bakteri ... 67
BAB IX TEKNIK SAMPLING, ISOLASI, DAN INOKULASI BAKTERI ... 71
A. Sampling untuk Analisis Bakteri ... 71
B. Teknik Isolasi dan Inokulasi ... 73
BAB X TEKNIK SAMPLING, ISOLASI, DAN INOKULASI BAKTERI LANJUTAN ... 76
A. Teknik Sampling ... 76
B. Teknik Isolasi Bakteri ... 76
C. Teknik Inokulasi ... 81
BAB XI FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI PERTUMBUHAN BAKTERI ... 85
A. Nutrien ... 85
B. Suhu ... 85
C. Kelembaban ... 87
D. Pencahayaan ... 87
E. Oksigen ... 87
F. Konsentrasi Ion Hydrogen (Ph) ... 88
G. Tekanan Osmotic ... 88
BAB XII ENUMERASI BAKTERI ... 89
A. Prinsip Enumerasi Sel Bakteri ... 89
B. Jenis-jenis Enamurasi Bakteri ... 89
C. Macam-macam Metode Enamurasi Bakteri ... 90
BAB XIII IDENTIFIKASI BAKTERI ... 93
A. Tinjauan Tentang Identifikasi Bakteri ... 93
B. Tinjauan tentang Uji Identifikasi Bakteri ... 93
BAB XIV IDENTIFIKASI BAKTERI LANJUTAN ... 98
A. Pemeriksaan Mikroskopis ... 98
B. Teknik Dasar Pewarnaan Sel Bakteri ... 100
DAFTAR ISI ... 107
viii
TATA TERTIB PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI
1. Para praktikan harus sudah siap di depan ruang praktikum lima menit sebelum waktu praktikum dimulai.
2. Sebelum praktikum, eksperimen yang akan dikerjakan harus sudah dipersiapkan, dibuat rencana skema kerja dan pembagian waktunya, serta latar belakang teorinya harus sudah dikuasai.
3. Praktikan yang oleh dosen/instruktur dinilai tidak siap, tidak diperbolehkan mengikuti praktikum.
4. Segala pengamatan ditulis dalam buku catatan lab, dan pada lembar laporan dalam buku penuntun praktikum, jika ada.
5. Setiap kelompok diharuskan membuat satu laporan sementara untuk setiap eksperimen.
6. Praktikan hanya diperbolehkan menggunakan lab pada waktu praktikumnya sendiri, kecuali jika mendapat izin dari penanggung jawab praktikum.
7. Di dalam lab, praktikan diharuskan memakai baju praktikum (Jas Lab) dan alat pelindung dari (APD).
8. Inventarisasi alat - alat dilakukan pada waktu yang ditetapkan sebelum dan sesudah masa praktikum. Alat yang diterima menjadi tanggung jawab kelompok. Jika ada alat yang pecah atau hilang, kelompok harus sudah menggantinya sebelum ujian akhir praktikum.
9. Selama praktikum harus dijaga ketenangan dan kebersihan.
10. Selama kegiatan praktikum tidak boleh makan, minum atau merokok di dalam lab.
11. Pelanggaran tata tertib ini akan mengakibatkan sangsi akademis
ix
PETUNJUK KERJA DI LABORATORIUM
A. PERSIAPAN
1. Buatlah skema pembagian waktu kerja meliputi : urutan kerja yang dilakukan, apa yang akan dikerjakan lebih dulu, mana yang dapat dikerjakan bersama - sama, dll.
2. Alat yang akan digunakan diatur rapi di meja praktikum, juga buku catatan, daftar - daftar, lap, korek api dan sebagainya.
3. Sebelum bekerja hal- hal yang belum jelas sebaiknya ditanyakan kepada dosen/instruktur.
B. SELAMA PRAKTIKUM
1. Bekerjalah dengan tenang, rapi, hati - hati, teliti, bersih dan hemat, tetapi juga cepat dan lebih teliti dari yang diperlukan menurut keadaannya.
2. Ingat kepentingan teman - teman sepraktikum. Kembalikan botol yang digunakan segera ke tempatnya supaya mudah dicari; jangan merebut botol yang sedang diperlukan orang lain. Sebaliknya, jangan terlalu lambat bekerja sehingga terpaksa orang menunggu lama, sabar menunggu giliran menggunakan sesuatu yang diperlukan bersama. Jangan membahayakan orang lain karena api, cara pemanasan larutan dan sebagainya.
3. Berbicara seperlunya dan tidak terlalu keras.
4. Jika meragukan sesuatu, bertanyalah pada dosen/instruktur.
5. Dalam mengerjakan sesuatu tidak boleh dengan perhatian setengah - setengah. Jangan sambil memperhatikan hal - hal lain, berbicara, bergurau dan sebagainya.
x
6. Jika mengambil reagen, tutup botol harus segera dipasang kembali untuk menghindari kekeliruan yang dapat merusak kemurnian isi botol (kontaminasi).
7. Bahan-bahan yang pekat jangan langsung dibuang ke saluran atau bak, tetapi diencerkan dulu dengan air kran. Setelah membuangnya, bukalah kran secukupnya untuk menghilangkan daya bahan – bahan pekat tersebut.
8. Kertas saring dan benda padat lain harus dibuang ke tempat sampah atau tempat yang disediakan. Meja yang menjadi basah/kotor harus dibersihkan.
9. Hematlah terhadap penggunaan api, air dan reagen.
10. Jika suatu reagen diperlukan oleh banyak orang, carilah pekerjaan lain sehingga waktu tidak terbuang untuk menunggu (dalam hal ini perlu dibuat rencana pembagian waktu yang fleksibel dan harus diketahui betul - betul bahan yang akan dipakai).
11. Catatan pengamatan harus singkat, tegas tetapi jelas dan lengkap. Catatan yang panjang lebar dapat menghilangkan gambaran tentang isi keseluruhan.
12. Gunakan waktu yang luang untuk menyusun laporan praktikum.
C. SELESAI PRAKTIKUM
1. Bersihkan alat - alat, meja dan lain sebagainya.
2. Aturlah botol - botol, tempat duduk, alat-alat gelas, dan lain-lainnya.
3. Periksa apakah tidak ada kerusakan, jika ada segera laporkan pada laboran hal tersebut.
xi
4. Tunggulah ditempat masing - masing, laboran akan mengumpulkan buku jurnal dan memeriksa keperluan alat-alat dan meja praktikum.
5. Tunggulah ditempat masing - masing, laboran akan mengumpulkan buku jurnal dan memeriksa keperluan alat-alat dan meja praktikum.
1
MENGIDENTIFIKASI BAKTERI
A. PENDAHULUAN
Bakteri-bakteri yang ditumbuhkan di laboratorium, jika semua kebutuhan hidupnya terpenuhi, maka selnya akan mengalami pertumbuhan. Perbanyakan sel bakteri dapat terjadi, jika proses reproduksi selnya berlangsung dalam suasana yang optimal. Sel bakteri dikatakan tumbuh, jika terjadi peningkatan jumlah selnya. Jadi, pertambahan jumlah sel pada sel bakteri, berarti pertumbuhan sel bakteri telah terjadi. Hal ini juga berarti bahwa jumlah individu sel bakteri tersebut juga bertambah.
Identifikasi bakteri adalah satu tugas yang lazim dilakukan di laboratorium.
Pencirian bakteri yang diisolasi dari pasien, makanan dan minuman, harus dilaksanakan dengan cepat dan tepat sehingga dapat diketahui nama bakteri, dan menentukan pilihan pengobatan dengan tepat
B. IDENTIFIKASI BAKTERI
Uji yang digunakan dalam identifikasi bakteri, tidaklah sama untuk semua kelompok. Sebagai contoh untuk proses identifikasi bakteri kelompok Enterbacteriaceae, salah satu langkah pengujiannya adalah digunakan kemampuan bakteri tersebut memfermentasi laktosa. Namun demikian, tahap mengujian sifat fermentasi laktosa ini tidak dapat dipakai untuk proses identifikasi bakteri kelompok Staphylococcus dan Streptococcus. Untuk kedua kelompok bakteri kokus tersebut, digunakan uji katalase.
BAB I
2
Rujukan yang dipakai dalam identifikasi bakteri, adalah Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Bergey's manual mendasarkan pada morfologi, sifat faali, dan sifat biokimiawi bakteri.
Tahap awal dalam identifikasi bakteri adalah dilakukan pewarnaan Gram.
Hasil yang diperoleh dalam pewarnaan Gram adalah: bakteri Gram positif, dan bakteri Gram negatif. Selain informasi tentang bakteri Gram positif atau bakteri Gram negatif, bentuk sel bakteri juga dapat diketahui dari hasil pewarnaan Gram.
Skema kerja dalam proses identifikasi bakteri, ditunjukkan berikut:
3
MELIHAT SEL PROKARIOTIK
A. PENDAHULUAN
Sel prokariotik merupakan sel yang tidak memiliki membran inti (nukleus), sehingga nukleusnya bercampur atau mengadakan hubungan langsung dengan sitoplasma. Daerah nukleus yang mengandung materi genetik disebut nukleoid.
Sedangkan sel eukariotik merupakan sel yang sudah memiliki membran inti.
Gambar 2.1 Sel Prokariotik
Ciri sel prokariotik adalah: ukurannya kecil (1 - 10 µm), nukleoid tidak terbungkus oleh membran, pembelahan sel secara amitosis, pengambilan nutirisi secara absorpsi.
Ciri prinsip pada sel prokariotik adalah:
1. Ketiadaan membran internal yang memisahkan inti dengan sitoplasma, 2. Pembagian inti secara fisi bukan secara mitosis,
3. Kehadiran dinding sel mengandung mukopeptide tertentu sebagai penguatan elemennya.
BAB II
4
Beberapa contoh mikroorganisme yang memiliki sel yang termasuk dalam sel prokariotik adalah: bakteri, ricketsia, mycoplasma, dan cyanobakteri.
Berdasarkan ada tidaknya Membran Nukleus, organisme dikelompokkan menjadi kelompok Prokariotik dan Eukariotik. Perbedaan utama antara sel Prokariotik dan sel Eukariotik, yaitu pada sel Prokariotik tidak memiliki Membran Nukleus atau membran inti sedangkan sel Eukariotik memiliki Membran Nukleus.
Membran Nukleus merupakan membran yang menyelimuti Nukleus (inti sel).
Kelompok Prokariotik, meliputi: Kingdom Archaebacteria dan Kingdom Eubacteria.
Cyanobacteria merupakan bagian dari Kingdom Eubacteria yang merupakan kelompok Prokariotik. Cynaobacteria tampak seperti ganggang atau alga tetapi bukan alga karena Cyanobacteria tidak memiliki Membran Nukleus atau tidak memiliki inti sejati. Cyanobacteria merupakan bakteri fotosintetik yang menggunakan air untuk menghasilkan oksigen.
Struktur dari Cyanobacteria terdiri atas lapisan lendir, Dinding Sel, Membran Sel, Sitoplasma, materi genetik, dan organel seperti Ribosom di mana pada Cyanobacteria terdapat membrana fotosintetik untuk fotosintesis. Dinding Sel Cyanobacteria tersusun atas peptidoglikan yang merupakan polimer yang terusun atas 2 (dua) jenis gula yang bergantian dalam rantai di mana asam amino dari satu gula terkait dengan asam amino di gula lainnya yang menciptakan struktur seperti jaring sederhana dan berpori tetapi kuat.
5 B. PELAKSANAAN PRAKTEK a. Alat dan Bahan
1. Alat:
Mikroskop, Object glass, Cover glass, Cawan petri, Pinset, Pipet tetes, dan Kamera/ Handphone (dokumentasi).
2. Bahan:
Air kolam atau akuarium yang berwarna hijau, tissue, dan air.
3. Prosedur Kerja:
1) Perencanaan:
a) Menyiapkan air kolam atau akuarium yang berwarna hijau 2) Pelaksanaan Praktikum:
a) Mengambil sampel air akuarium atau kolam berwarna hijau menggunakan pipet tetes.
b) Meletakkan 1-2 tetes air akuarium atau kolam tersebut di atas object glass.
c) Menutup preparat dengan cover glass.
d) Mengamati dengan mikroskop perbesaran lemah kemudian kuat.
e) Menggambar hasil pengamatan di tabel pengamatan dan foto hasil pengamatan preparat Cyanobacteria di mikroskop. Selanjutnya, memberi keterangan bagian sel yang teramati di hasil pengamatan.
6
MENGIDENTIFIKASI SEL EUKARIOTIK
A. PENDAHULUAN
Sel eukariotik memiliki inti yang terbungkus membran yang pembelahannya dengan cara mitosis, sitoskeleton, sistem membran internal yang rumit, mitokondria yang melakukan respirasi, dan, dalam kasus tanaman, terdapat kloroplas.
Gambar 3.1 Sel Eukariotik
Berdasarkan ada tidaknya Membran Nukleus, organisme dikelompokkan menjadi kelompok Prokariotik dan Eukariotik. Perbedaan utama antara sel Prokariotik dan sel Eukariotik, yaitu pada sel Prokariotik tidak memiliki Membran Nukleus atau membran inti sedangkan sel Eukariotik memiliki Membran Nukleus.
Membran Nukleus merupakan membran yang menyelimuti Nukleus (inti sel).
sedangkan kelompok Eukariotik, meliputi: Kingdom Protista, Kingdom Fungi, Kingdom Plantae, dan Kingdom Animalia.
BAB III
7
Ciri-ciri sel eukariotik adalah: ukurannya 10 - 100 µm; nukleus terbungkus oleh membran; pembelahan sel secara mitosis; pengambilan nutrisi secara absorbsi, endositosis, dan fotosintesis.
Protozoa merupakan kelompok dari Kingdom Protista, lebih tepatnya Protista mirip hewan. Contoh dari kelompok Protozoa adalah Amoeba sp., Paramecium sp., Stentor sp., Vorticella sp., Trypanosoma sp., dan Plasmodium sp.. Species dari kelompok ini merupakan uniseluler atau memiliki satu sel
B. PELAKSANAAN PRAKTEK
a. Alat dan Bahan 1. Alat:
Mikroskop, Object glass, Cover glass, Cawan petri, Pinset, Pipet tetes, dan Kamera/ Handphone (dokumentasi).
2. Bahan:
Air kolam atau akuarium yang berwarna hijau, tissue, dan air. Air kolam atau akuarium bisa dimasukkan ke dalam botol tanpa tutup dan ditambahkan rumput-rumputan ke dalam botol. Setelah itu, ditunggu selama kurang lebih 1 minggu. Alternatif air kolam adalah air sawah yang kotor, diberi jerami kemudian dimasukkan dalam botol tanpa ditutup dan ditunggu sekitar satu minggu. Praktikan juga bisa mengambil sampel air dari sumber lain, seperti:
sumur, kali, atau perairan di sekitar tempat tinggal 3. Prosedur Kerja:
1) Perencanaan:
Menyiapkan air kolam atau akuarium yang berwarna hijau
8 2) Pelaksanaan Praktikum:
a) Mengambil sampel air akuarium atau kolam berwarna hijau menggunakan pipet tetes.
b) Meletakkan 1-2 tetes air akuarium atau kolam tersebut di atas object glass.
c) Menutup preparat dengan cover glass.
d) Mengamati dengan mikroskop perbesaran lemah kemudian kuat.
e) Menggambar hasil pengamatan di tabel pengamatan dan foto hasil pengamatan preparat Paramecium sp. dan Vorticella sp. di mikroskop.
Selanjutnya, memberi keterangan bagian sel yang teramati di hasil pengamatan.
f) Lakukan kegiatan pengamatan hingga diketemukan species yang dimaksud. Hal ini karena dalam 1-2 tetes air sampel pasti dijumpai mikroorganisme lainnya.
9
PENYIAPAN ALAT
A. PENDAHULUAN
Praktikum ini merupakan praktikum yang berhubungan dengan mikroba sehingga memerlukan beberapa alat yang mendukung pelaksanaannya seperti autoclave, mikroskop, dll. Berikut beberapa alat-alat mikrobiologi yang perlu dikenal : mikroskop, autoclave, cawan Petri, tabung reaksi, gelas ukur, lampu Bunsen, pinset, pH indikator universal.
a. Mikroskop
Gambar 4.1 mikroskop
Keterangan :
1. Lensa okuler, untuk memperbesar bayangan yang dibentuk lensa objektif 2. Revolving (pemutar lensa objektif), untuk memutar lensa objektif sehingga
mengubah perbesaran
3. Tabung pengamatan/tabung okuler
BAB IV
10
4. Stage (meja benda), spesimen diletakkan di sini
5. Condenser untuk mengumpulkan cahaya supaya tertuju ke lensa objektif 6. Lensa objektif), untuk memperbesar spesimen
7. Brightness adjustment knob (pengatur kekuatan lampu), untuk memperbesar dan memperkecil cahaya lampu
8. Tombol on-off
9. Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter) Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan kiri
10. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar 11. Specimen holder (penjepit spesimen)
12. Illuminator (sumber cahaya)
13. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal) Untuk menaikkan atau menurunkan object glass
14. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal) Untuk menggeser ke kanan / kiri objek glas
15. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar) Menaik turunkan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan cepat
16. Fine focus knob (sekrup fokus halus) Menaik turunkan meja benda secara halus dan lambat
17. Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler)
18. Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser) untuk menaik- turunkan condenser
11 b. Autoclave
Gambar 4.2 Autoclave
Keterangan :
1. Tombol pengatur waktu (timer) 2. Katup pengeluaran uap
3. Pengukur tekanan 4. Kelep pengaman 5. Tombol on-off 6. Termometer
7. Lempeng sumber panas 8. Aquades (H2O)
9. Sekrup pengaman 10. Batas penambahan air
Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi, menggunakan uap air panas bertekanan.
Tekanan yang digunakan pada umumnya 1,5 atm- 2 atm dengan suhu 121oC dan lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15-20 menit.
12 Cara Pemakaian:
1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoclave, jika air dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut.
Gunakan air hasil destilasi/steril untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.
2. Masukkan alat dan bahan.
3. Tutup dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoclave dan nyalakan.
4. Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi seluruh bagian autoclave, klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai.
Penghitungan waktu 15-20 menit dimulai sejak tekanan mencapai 1,5-2 atm dan nyalakan timer.
5. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge/penunjuk tekanan menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isinya dengan hati-hati.
c. Oven (Hot Air Sterilizer)
Gambar 4.3 Oven
13
Oven adalah alat untuk mensterilkan alat-alat dari kaca yang digunakan dalam mikrobiologi, menggunakan udara kering. Suhu 170-180oC dan lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 1,5-2 jam
Cara Pemakaian :
1. Masukkan alat-alat yang telah siap ke dalam oven
2. Tutup oven dan tutup tombol pengatur tekanan dan nyalakan tombol
3. Atur suhu pada termometer dengan cara memutar pengatur suhu sesuai suhu oven
4. Hitung waktu sterilisasi selama 1,5-2 jam dan dimulai ketika suhu sudah mencapai 170-1800C
5. Matikan tombol setelah 1,5-2 jam, tunggu sampai suhu turun dan oven dingin selanjutnya alat-alat dapat dikeluarkan
d. Cawan Petri (Petri Dish) dan Tabung Reaksi (Reaction Tube / Test Tube)
Gambar 4.4 (a) dan (b)
1. Cawan Petri (a)
berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroba. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawan yang biasa
14
berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml, sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml.
2. Tabung Reaksi (b)
digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba. Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring (slants agar). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi.
e. Lampu Bunsen (Pembakar Spiritus) dan pH Indikator Universal
Gambar 4.5 (a) dan (b) 1
1. Bunsen (a)
Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar menggunakan Bunsen.
Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara
15
tersebut. Untuk sterilisasi jarum Ose atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas). Lampu Bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas, alkohol, spiritus.
2. pH Indikator Universal (b)
berguna untuk mengukur/mengetahui pH suatu larutan. Hal ini sangat penting dalam pembuatan media karena pH pada medium berpengaruh terhadap petumbuhan mikroba. Kertas pH indikator dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna kemudian strip warna dicocokkan dengan skala warna acuan.
f. PINSET
Gambar 4.6 Pinset 1
berfungsi untuk mengambil benda dengan menjepit, menjepit bahan yang akan diisolasi mikrobanya.
B. PELAKSANAAN PRAKTEK a. Autoklaf Konvensional 1. Siapkan autoklaf
2. Tuang air ke dalam tubuh sterilisator hingga 2/3 dasar keranjang
16
3. Tata alat dan media yang akan di sterilisasi didalam tabung sehingga tersedia ruangan untuk pergerakan uap air.
4. Tutup sterilisator dengan cara mempertemukan lubang baut, sambil diputar untuk lebih rapat
5. Buka klep pengatur pengamanan, hidupkan api atau listrik
6. Bila uap mulai keluar (bunyi mendesis), tutup klep pengaman, tekanan didalam akan naik dan baca pada alat ukur tekanan sampai 1 Atm (1210C) 7. Jika sudah tercapai, pertahankan selama 15 menit dengan cara membuka
klep pengukur tekanan untuk mengurangi panas
8. Pada akhir proses, matikan api dan tunggu tekanan hingga nol, suhu dibawah 1000C
9. Keluarkan keranjang serta alat dan bahan dari dalam sterilisator.
b. Oven
1. Siapkan oven
2. Untuk penggunaan oven, cukup dengan menyetel pada suhu yang diinginkan (1600C) set stopwatch selama 2 jam, setelah alat-alat yang akan disterilkan disusun sedemikian rupa (tetap menyediakan ruang untuk udara panas)
3. Keluarkan alat yang disterilisasi dan masukkan ke dalam desikator sampai suhu stabil (stabilkan hingga suhu kamar).
17 C. STERILISASI ALAT
Cara Kerja :
1. Semua alat dari kaca yang akan digunakan dicuci menggunakan sabun dan dibilas air mengalir sampai bersih selanjutnya dikeringkan.
2. Setelah kering, untuk cawan Petri dibungkus kertas sampul coklat, tabung reaksi dan Erlenmeyer disumbat kapas / aluminium foil / tutup karet.
Tahapan ini dilakukan dengan tujuan mengurangi kontaminan yang masuk ke cawan Petri, tabung reaksi dan Erlenmeyer.
3. Semua alat yang telah siap disterilkan menggunakan autoclave dan oven dengan cara kerja seperti diuraikan pada materi I yaitu cara pemakaian autoclave dan oven.
18
MENGIDENTIFIKASI PENGONTROLAN PERTUMBUHAN BAKTERI DI LINGKUNGAN
A. PENDAHULUAN
Kehidupan mikroorganisme sangat tergantung dan dipengaruhi oleh keadaan lingkungannya. Ada tida faktor lingkungan yang sangat mempengaruhi aktivitas mikroorganisme ini, yaitu :
1. Faktor fisis, misalnya suhu, pH, tekanan osmosis, kandungan oksigen,dan lain-lain.
2. Faktor kimia, misalnya senyawa racun dan senyawa kimia lainnya sebagai bahan makanan.
3. Faktor biologis, misalnya interaksi dengan mikroorganisme lain.
Reaksi mikroorganisme ini terhadap lingkungannya sangat penting untuk diketahui sebab sangat menunjang proses-proses lainnya, misalnya dalam mengontrol adanya mikroba penyebab penyakit atau dalam proses pembuatan dan pengawetan makanan. Faktor lingkungan yang dapat mempengaruhi kehidupan mikroorganisme tersebut dapat digolongkan sebagai faktor intrinsik, seperti pH, kadar air, cahaya dan suhu, dan faktor ekstrinsik, seperti zat metabolit toksik, sumber karbon dan lain-lain.
B. PENGARUH SUHU
Suhu yang cocok untuk pertumbuhan mikroorganisme sangat bervariasi.
Pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung sangat baik pada suhu optimumnya. Suhu optimum ini biasanya sesuai dengan suhu habitat asalnya, misalnya pada suhu 37oC untuk bakteri pathogen pada hewan. Kita dapat
BAB V
19
membedakan mikroorganisme menjadi 3 kelompok berdasarkan pada suhu optimum pertumbuhannya, yaitu :
1. Psikrofilik : mikroorganisme yang hidup pada suhu rendah (5 - 30oC).
2. Mesofilik : mikroorganisme yang hidup pada suhu moderat (25 - 40oC).
3. Termofilik : mikroorganisme yang hidup pada suhu tinggi (45 - 65oC) Catatan:
rentang temperature diatas tidak strik seperti itu, karena ada beberapa mikroba yang dapat hidup pada rentang temperature yang sangat luas, sehingga terjadi banyak overlapping.
a. Alat dan bahan:
1. Medium kaldu nutrisi yang dilengkapi dengan tabung Durham.
2. Biakan E. coli, Pseudomonas sp., dan Sarcina lutea.
3. Incubator.
b. Prosedur Kerja:
1. Tanam biakan diatas pada medium kaldu nutrisi.
2. Inkubasi pada suhu 5oC, 20oC, 40oC, dan 65oC.
3. Amati pertumbuhannya setelah 2-7 hari.
C. PENGARUH pH
Seperti halnya dengan suhu, pertumbuhan mikroorganisme juga sangat dipengaruhi oleh pH lingkungannya.
a. Alat dan Bahan:
1. Medium kaldu nutrisi dengan pH yang berbeda (3, 5, 7, dan 9).
2. Biakan E. coli, Staphylococcus aureus, dan S. cerevisiae.
20 b. Prosedur kerja:
1. Tanamkan masing-masing biakan pada medium yang pHnya berbeda.
2. Inkubasi pada suhu 30oC.
3. Setelah 2 dan 7 hari, amati pertumbuhan tiap biakan.
D. PENGARUH CAHAYA
Mikroorganisme memberikan respons yang baik terhadap cahaya (ada yang positif dan ada yang negatif). Bahkan perkecambahan pun dipengaruhi oleh cahaya.
a. Alat dan Bahan (respon positif):
1. Medium NA tegak 2. Cawan petri steril
3. Biakan E. coli dalam bentuk suspensi (umur 24 jam).
b. Prosedur Kerja:
1. Pipet 1 ml suspensi biakan dan masukkan ke dalam cawan petri.
2. Cairkan medium NA dalam penangas air, dan setelah mencapai suhu 40oC, masukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi suspensi biakan.
3. Goyangkan sampai merata, dan biarkan membeku.
4. Perlakuan terhadap biakan adalah sebagai berikut : Cawan pertama disinari dengan cahata matahari selama 15-30 menit, cawan kedua disinari dengan cahaya lampu selama 15-30 menit lalu dibungkus dengan kertas hitam, dan cawan ketiga tidak disinari dan langsung ditutup dengan kertas hitam.
5. Inkubasi ketiga cawan petri pada suhu 37oC
6. Amati pertumbuhan biakan pada ketiga cawan petri.
21 a. Alat dan Bahan (respon negatif):
1. Satu tabung reaksi yang besar.
2. Air suling 3. Kertas saring 4. Kertas hitam 5. Kotoran kuda b. Prosedur Kerja:
1. Isi tabung reaksi dengan air suling sampai setinggi 10 cm.
2. Masukkan kertas saring sedemikian rupa sehingga ujungnya tercelup pada permukaan air
3. Letakkan kotoran kuda pada permukaan kertas saring tadi.
4. Tutup tabung reaksi dengan kertas hitam, lalu kertasnya dilubangi tepat diatas permukaan kotoran kuda, dengan ukuran lubang sekitar 5 x 5 mm.
5. Inkubasi pada suhu kamar pada tempat yang terkena sinar matahari.
6. Amati pertumbuhan jamur pada kotoran kuda dan perhatikan kearah mana pertumbuhannya.
22
KORELASI ANTARA HASIL TES MIKROSKOPIS DENGAN TES CEPAT MOLEKULER PADA PASIEN TBC
A. PENDAHULUAN
Tuberculosis (TB) adalah penyakit paru akibat Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) dan memiliki gejala berupa batuk yang berlangsung lama yaitu lebih dari 3 minggu, biasanya berdahak dan terkadang mengeluarkan darah.
Penderita TB juga akan merasakan gejala berupa demam, lemas, berat badan menurun, tidak nafsu makan, nyeri dada dan berkeringat di malam hari. M.
tubercuosis tidak hanya menyerang paru-paru, tetapi juga bisa menyerang tulang, usus, atau kelenjar. Penyakit ini ditularkan dari percikan ludah yang keluar dari penderita TB ketika berbicara, batuk, atau bersin. Penyakit ini lebih rentan terkena pada seseorang yang kekebalan tubuhnya rendah, misalnya penderita Human Immunodeficiency Virus (HIV).
B. METODE
Populasi dan Sampel
Populasi dari penelitian ini adalah seluruh penderita suspek TB dan TB-MDR yang telah melukan tes mikroskopis dan TCM. Teknik pengambilan sampel pada penelitian ini menggunakan motode purposive sampling berdasarkan kriteria inklusi dan eksklusi
Teknik Penumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini adalah data sekunder. Data sekunder diperoleh dari registrasi pemeriksaan laboratorium pasien TB Di RS GrandMed Lubuk pakam
BAB VI
23 Analisis Data
Data dianalisis menggunakan program SPSS analisis dilakukan secara bertahap, yaitu dengan univariat dan bivariat dengan menggunakan uji chi-square.
HASIL
Penelitian ini dilaksanakan di RS GrandMed Lubuk Pakam pada. Hasil penelitian sampel yang didapatkan sejumlah 90 pasien suspek TB. Frekuensi hasil tes mikroskopis pasien suspek TB didapatkan hasil terbanyak yaitu negatif sebanyak 71 sampel (78,9%) diikuti dengan 1+ sebanyak 7 sampel (7,8%), 3+
sebanyak 6 sampel (6%) dan 2+ sebanyak 3 sampel (3,3%) sedangkan yang paling sedikit yaitu Scanty sebanyak 3 sampel (3,3%).
Frekuensi hasil TCM pasien suspek TB didapatkan hasil terbanyak yaitu negatif sebanyak 58 sampel (64.4%), diikuti sensitif rifampisin sebanyak 30 sampel (33,3%), sedangkan yang paling sedikit resisten rifampisin sebanyak 2 (2.2%).
Frekuensi hasil tes mikroskopis dan TCM yang memiliki hasil negatif sebanyak 58 sampel (100%), sedangkan tes mikroskopis negatif dan TCM sensitif rifampisin sebanyak 14 sampel (40%), pemeriksaan mikroskopis scanty dengan TCM sensitif rifampisin sebannyak 3 sampel (10 %), tes mikroskopis +1 dengan sensitif rifampisin sebanyak 6 sampel (20%), tes mikroskopis +2 dengan sensitif rifampisin sebanyak 3 sampel (10%), tes mikroskopis +3 sebanyak 6 sampel (20%), dan tes mikroskopis negatif dengan TCM resistant rifampisin sebanyak 1 sampel (50%), tes mikroskopis +1 dengan TCM resistant rifampisin sebanyak 1 sampel (50%).
24
MENGIDENTIFIKASI PERTUMBUHAN BAKTERI
A. PENDAHULUAN
Pertumbuhan sel dapat didefinisikan sebagai pertambahan secara teratur semua komponen di dalam sel hidup. Pada organisme multiseluler, yang dimaksud dengan pertumbuhan adalah peningkatan jumlah sel per organisme, di mana ukuran sel juga menjadi lebih besar. Pada organisme multiseluler, pertambahan jumlah sel, tidak diikuti dengan pertambahan jumlah organismenya.
Sedangkan pada organisme uniseluler seperti bakteri, pertumbuhan adalah pertambahan jumlah sel yang berarti juga terjadi pertambahan jumlah organisme/individu.
B. KURVA PERTUMBUHAN
Jika suatu sel bakteri mempunyai waktu generasi 20 menit, berarti sel bakteri tersebut akan memperbanyak diri menjadi dua sel anak dalam waktu 20 menit.
Jika sel tersebut diinokulasi pada suatu media pada kondisi yang optimum untuk pertumbuhannya, maka dalam waktu 48 jam, sel tersebut akan mengalami pembelahan sebanyak 48(60)/20 kali, atau sebanyak 144 generasi. Jumlah sel diperoleh dengan rumus: 2n (2n adalah jumlah akhir sel, n adalah banyaknya generasi atau berapa kali pembelahan terjadi).
Proses pertambahan jumlah sel bakteri dalam suatu medium pertumbuhan dalam berbagai interval waktu dapat digambarkan dalam suatu kurva pertumbuhan untuk suatu sel bakteri. Gambar 7.1 menunjukkan kurva pertumbuhan sel bakteri
BAB VII
25
Gambar 7.1 Kurva Pertumbuhan Sel Bakteri
Pada gambar 7.1 terdapat beberapa fase pertumbuhan, yaitu:
a. Fase adaptasi (A)
Pada fase ini sel bakteri mulai mengadakan adaptasi. Sel belum mengadakan pembelahan. Hal ini disebabkan beberapa enzim mungkin belum disintesis.
Jumlah sel tetap, atau berkurang. Lamanya fase ini dipengaruhi oleh beberapa faktor.
1. Medium dan lingkungan pertumbuhan
Jika medium dan lingkungan pertumbuhan sel tersebut seperti sebelumnya, maka tidak perlu adaptasi. Tetapi jika kondisi nutrien dan lingkungan baru sangat berbeda dengan sebelumnya, maka diperlukan waktu penyesuaian untuk mensintesis enzim-enzim yang dibutuhkan untuk metabolisme.
2. Jumlah inokulum
Jumlah awal sel yang semakin tinggi, akan mempercepat fase adapatasi.
Fase adaptasi mungkin berjalan lambat, karena:
26
1) kultur dipindahkan dari medium yang kaya nutrien ke medium yang kandungan nutriennya terbatas,
2) mutan yang baru terbentuk,
3) kultur yang dipindahkan dari fase statis ke medium baru dengan komposisi sama seperti sebelumnya.
b. Fase pertumbuhan awal (B)
Setelah melalui fase adaptasi, sel mulai mengadakan pembelahan dengan kecepatan yang masih rendah. Hal ini disebabkan sel baru selesai melakukan penyesuaian atau adaptasi.
c. Fase eksponensial (C)
Fase ini disebut juga fase log (logaritmik). Pada fase ini, terjadi pembelahan sel dengan cepat dan konstan (stabil). Pertambahan jumlahnya mengikuti kurva logaritmik. Sel membutuhkan energi lebih banyak jika dibandingkan dengan fase-fase lain. Kecepatan pertumbuhan sel sangat dipengaruhi oleh:
pH, nutrien, kelembaban udara.
d. Fase pertumbuhan diperlambat (D)
Pada fase ini, terjadi pertambahan populasi sel bakteri diperlambat. Hal ini terjadi karena:
1. Nutrien sudah berkurang (termasuk ketersediaan oksigen)
2. Adanya hasil metabolisme yang mungkin bersifat racun bagi pertumbuhan sel
Pada fase ini, terjadi pertumbuhan sel yang tidak stabil, serta sel yang tumbuh jumlahnya lebih besar dari sel yang mati (grafik masih naik).
27
e. Fase pertumbuhan stasioner maksimum (E)
Pada fase ini jumlah sel tetap (jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati). Ukuran sel lebih kecil, karena sel tetap membelah meskipun nutrisi berkurang. Zat makanan mulai berkurang dan akan habis. Sel menjadi lebih tahan terhadap keadaan ekstrim (misalnya panas, dingin, radiasi, dan bahan kimia). Pada fase ini juga terjadi penumpukan metabolit beracun.
Keadaan ini mengakibatkan pertumbuhan sel terhenti sama sekali.
f. Fase menuju kematian (F)
Pada fase ini sel bakteri mulai mengalami kematian. Hal ini disebabkan:
1. Nutrien sudah habis
2. Energi cadangan di dalam sel habis 3. Zat-zat toksik semakin banyak g. Fase kematian (G)
Pada fase ini, sel-sel akan mengalami kematian dipercepat. Hal ini disebabkan: nutrien sudah habis, energi cadangan di dalam sel sudah habis, peningkatan zat-zat toksik yang akan meracuni sel-sel bakteri
C. MEDIA PERTUMBUHAN BAKTERI
Untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan bakteri diperlukan suatu substrat yang disebut media.
Agar bakteri dapat hidup dan berkembang dengan baik di dalam media, diperlukan persyaratan media tertentu yaitu:
a. Media mengandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri.
b. Media mempunyai tekanan osmosa dan pH yang sesuai untuk bakteri
28 c. Media harus dalam keadaan steril
Media pertumbuhan bakteri, mengandung berbagai nutrisi dan faktor-faktor yang yang memungkinkan sel bakteri dapat tumbuh dengan baik. Media pertumbuhan ini dirancang untuk tidak memungkinkan mikroba lain seperti fungi untuk tumbuh di dalam media tersebut. Dengan demikian, maka dapat diperoleh sel bakteri campuran atau spesies bakteri tertentu saja yang dapat tumbuh pada media ini.
Penyiapan media alamiah, misalnya susu skim, tidak menimbulkan masalah di dalam penyiapannya sebagai media, hanya semata-mata dituang kedalam wadah- wadah yang sesuai seperti tabung reaksi atau labu dan disterilkan sebelum digunakan. Media dalam bentuk kaldu nutrien atau yang mengandung Agar disiapkan dengan cara melarutkan masing-masing bahan yang dibutuhkan atau lebih mudah lagi dengan cara menambahkan air pada suatu produk komersial berbentuk medium bubuk yang sudah mengandung semua nutrien yang dibutuhkan. Pada praktisnya semua media tersebut secara komersial dalam bentuk bubuk dan juga dalam bentuk siap pakai didalam cawan-cawan petri, tabung, atau botol.
Penyiapan media bakteriologis selain media alamiah, mengikuti langkah-langkah sebagai berikut:
1. Setiap komponen atau medium terdehidrasi yang lengkap, dilarutkan dalam air suling dengan volume yang sesuai.
2. pH (dalam derajat keasaman dan kebasaan) medium fluida ditentukan dan disesuaikan (dengan menambahkan larutan basa atau asam) dengan nilai yang
29
optimum bagi pertumbuhan bakteri yang akan di kultivasi. pH ditentukan dengan menggunakan indikator pH atau pH meter.
3. Medium tersebut dituang ke dalam wadah yang sesuai seperti tabung labu atau botol dan ditutup dengan sumbat kapas atau tutup plastik atau logam sebelum disterilisasi.
4. Medium itu disterilisasi, biasanya dengan menggunakan otoklaf, proses ini menggunakan panas di bawah tekanan uap.
30
MENGIDENTIFIKASI PERTUMBUHAN BAKTERI
A. BENTUK MEDIA
Bentuk media ditentukan oleh ada atau tidak adanya zat pemadat seperti Agar, gelatin. Berdasarkan bentuk, dikenal tiga jenis media, yaitu: media padat, media cair, media semi-padat.
Media padat (media solid); merupakan media yang berbentuk padat, yang terdiri atas nutrisi yang ditambah dengan Agar-Agar sebagai pemadat, yang dibuat padat dalam cawan (plate) atau dalam bentuk Agar miring dalam tabung. Media padat, dibuat dengan menambahkan komponen pemadat seperti Agar ke dalam medium kaldu. Contoh media padat adalah Nutrien Agar (NA). Media padat umumnya dipergunakan untuk mempelajari penampilan atau koloni bakteri.
Selain itu, media padat dipergunakan juga untuk mengasingkan kuman untuk mendapatkan koloni terpisah (untuk memperoleh biakan murni). Media cair (media broth); merupakan media yang terdiri dari nutrisi-nutrisi yang berbentuk cair. Media ini tidak ditambahkan dengan komponen pemadat seperti Agar. Oleh karena itu, dalam suhu kamar, wujud media ini selalu cair. Contoh media cair adalah kaldu nutrien (nutrient broth).
Media cair dipergunakan untuk: membiakkan mikroorganisme dalam jumlah besar, penelaan fermentasi, perlakuan berbagai macam uji. Media ini tidak cocok untuk pengasingan bakteri untuk memperoleh biakan murni, juga tidak dapat dipakai untuk mempelajari koloni bakteri.
Media setengah padat (media semi-solid); merupakan media yang dibuat dengan menambahkan komponen pemadat, misalnya Agar, yang hanya setengah BAB
VIII
31
atau kurang dari seharusnya ke dalam nutrisi. Dengan demikian, tingkat konsistensi media ini lebih rendah jika dibandingkan dengan media padat (media solid). Media setengah padat dipergunakan untuk: menguji ada tidaknya motilitas (pergerakan) sel bakteri, menguji ada tidaknya kemampuan fermentasi bakteri.
Berdasarkan sifatnya atau kegunaannya, media pertumbuhan bakteri dikelompokkan menjadi: media umum, media sederhana, media pengaya, media pemupuk, media diferensiasi, media selektif, media khusus, dan media serbaguna.
Media umum; adalah media yang dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan satu atau lebih kelompok mikroba (bakteri) secara umum.
Contoh media ini adalah agar kaldu nutrisi.
Media pengaya; adalah media dimana suatu jenis bakteri diberi kesempatan untuk tumbuh lebih cepat dari jenis bakteri yang lain yang sama-sama berada di dalam satu media. Misalnya kaldu selenit atau kaldu tertrationat untuk memisahkan Salmonella typhi dari mikroba lain yang ada dalam feces.
Media pemupuk (enrichment); merupakan media yang ditambah dengan suatu bahan, untuk mempersubur bakteri tertentu saja, dan bahan yang ditambahkan tersebut dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain.
Media pembanding (differensial); merupakan media yang dipergunakan untuk penumbuhan bakteri tertentu, serta penentuan sifat-sifatnya. Media pembanding dipergunakan untuk membedakan dua kelompok bakteri tertentu, berdasarkan sifat metabolisme kedua kelompok bakteri tersebut. Misalnya penggunaan media untuk menentukan kemampuan memfermentasi laktosa dari bakteri.
Media selektif; merupakan media yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu atau jenis bakteri tertentu, tetapi menghambat atau mematikan jenis-jenis bakteri
32
lainnya. Media ini mengandung zatzat kimia tertentu yang dapat menghambat pertumbuhan satu kelompok bakteri atau lebih, tanpa menghambat pertumbuhan organisme yang diinginkan. Misalnya media SS (SalmonellaShigella) Agar, untuk menumbuhkan Salmonella dan Shigella, tetapi media ini dapat menghambat atau mematikan bakteri lain yang tidak dikehendaki.
Media khusus; merupakan media yang ditambahkan dengan suatu bahan untuk pertumbuhan suatu bakteri tertentu. Misalnya, media yang ditambah dengan darah domba, kelinci, atau kuda; untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam melakukan hemolisa.
Media serbaguna; merupakan media yang dapat menunjang pertumbuhan sebagian besar bakteri. Misalnya kaldu nutrien (nutrient broth).
B. PELAKSANAAN PRAKTEK a. Tujuan
Mengetahui bahan yang digunakan dalam pembuatan media dasar (NA dan PDA) serta memahami proses pembuatannya.
b. Pendahuluan
Media merupakan bahan yang terdiri dari zat-zat makanan (nutrient) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Sedangkan larutan pengencer adalah larutan yang digunakan untuk memperkecil jumlah mikroorganisme yang tersuspensi.
Media dapat memanipulasi tempat tumbuhnya biakan atau menjadikan media sebagai isolat tempat tumbuhnya, dan sekaligus memanipulasi komposisi media pertumbuhannya. Media terdiri dari bahan dasar, nutrient dan ataupun bahan
33
tambahan. Media dapat dibedakan berdasarkan sifat fisis, komposisi dan berdasarkan tujuannya.
Media sebelum digunakan harus disterilisasi terlebih dahulu, sterilisasi yang digunakan adalah sterilisasi panas basah (autoklaf).
c. Alat dan Bahan 1. Alat:
1) Botol semprot 2) Petridish
3) Erlenmeyer 250 ml dan 500 ml 4) Mikro pipet
5) Gelas piala 250 ml, 500 ml dan 1000 ml 6) Pipet mili 10 ml dan 25 ml
7) Timbangan analitik 8) Hot plate
9) Spatula
10) Batang pengaduk 11) pH meter
12) Gelas ukur 10 ml, 100 ml dan 250 ml 2. Bahan:
1) Kapas
2) Tissue gulung 3) Spiritus 4) Alkohol
5) Aluminium foil
34 6) Kertas label
7) Aquades 8) Agar
9) Ekstrak daging 10) Pepton
11) Dextrosa 12) Ekstrak kentang d. Prosedur Kerja
1. Pembuatan Nutrient Agar (NA)
1) Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:
a) Ekstrak daging 3 g b) Peptone 5 g
c) Agar 15 g
d) Akuades 1000 ml
2) Akuades sebanyak 1000 ml dibagi menjadi dua, 400 ml untuk melarutkan Ekstrak daging dan peptone dan 600 ml untuk melarutkan agar.
(Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak).
3) Larutkan agar dengan mengaduk secara konstan diatas hot plate stirrer (jangan sampai overheat, karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah)
4) Larutkan peptone dan ekstrak daging, cukup dengan pengadukan.
5) Setelah keduanya larut, larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai homogen.
35
6) Ukur pH media. Jika pH tidak netral maka dapat ditambahkan HCl/NaOH.
7) Masukkan media ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan autoklaf.
8) Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis.
2. Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)
1) Timbang komponen media sesuai dengan komposisi berikut:
a) Potato/kentang 3 g b) Dextrosa 5 g c) Agar 15 g
d) Akuades s.d 1000 ml
(sebelum ditimbang, sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil) 2) Rebus kentang dalam sebagian akuades selama 1-3 jam sampai lunak,
kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya menggunakan kertas saring lalu ditampung di gelas piala.
3) Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 500 ml aquades, setelah larut dapat ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi.
4) Atur pH media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH
Media dituang ke dalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi kemudian siap untuk disterilisasi.
36
MENGIDENTIFIKASI TEKNIK SAMPLING, ISOLASI DAN INOKULASI BAKTERI
A. TEKNIK SAMPLING BAKTERI
Teknik pengambilan sampel dan preparasi sampel memiliki kekhususan tertentu terkait dengan sifat analisanya. Oleh karena itu sebaiknya sebelum dilakukan pengambilan sampel terlebih dahulu diperhitungkan kemungkinan - kemungkinan yang terjadi dengan bakteri pada sampel, seperti nasib sel setelah dilakukan pengambilan sampel, kemungkinan sel menjadi mati atau malah bertambah sehingga hal ini perlu diantisipasi. Selain itu perlu dipertimbangkan pula distribusi bakteri sehingga sampel yang diambil dapat mewakili sepenuhnya.
Kehomogenan mikroba pada air sungai mengalir dan air sungai yang menggenang tentu berbeda sama sekali.
Prinsip pengambilan sampel secara umum adalah:
1. Suatu bagian tertentu (dapat digambarkan sebagai batch) yang mengandung jenis dan jumlah bakteri tertentu.
2. Dari batch tersebut diambil sebagian kecil volumenya untuk diinterpretasikan sesuai dengan kebutuhan.
3. Sebagian kecil yang diambil ini (sampel) harus sedapat mungkin menggambarkan dari batch (populasi) tersebut baik dari segi jumlah ataupun jenis bakteri yang ada.
4. Pengambilan sampel harus memenuhi syarat secara statistic bila ditinjau dari volume yang diambil dan perulangan yang dilakukan.
BAB IX
37
5. Pada saat pengambilan sampel diharuskan supaya bakteri yang masuk kedalam wadah penampung sampel benar-benar berasal dari sumbernya, bukan berasal dari lingkungan sekitar.
6. Sampel yang mengandung bakteri tersebut dijaga supaya tetap menggambarkan kondisi yang ada sebelum memasuki tahap analisa.
Supaya tercapai tujuan diatas, maka dibutuhkan beberapa syarat tertentu yaitu:
1. Semua peralatan pengambilan sampel harus steril dan dilindungi dari kontaminasi sebelum dan sesudah pengambilan sampel dilakukan.
2. Dikerjakan dengan prosedur kerja aseptik yang baik dan dengan senyawa desinfektan yang sesuai.
3. Dipilih peralatan atau wadah sampel yang cocok dan metode pengambilan yang sesuai dengan jenis sampel.
4. Sebaiknya dilaksanakan pencegahan kontaminasi dari operator dengan memakai sarung tangan dan masker. Pengambilan sampel sebaiknya dilakukan pada tempat yang sedikit atau tidak terdapat aliran udara.
38
5. Setelah diambil, sampel langsung dianalisa. Pencegahan pertumbuhan mikroba dapat disimpan pada suhu dingin. Jika perlu dapat ditambahkan suatu zat kedalam sampel dengan tujuan melindungi mikroba dari kerusakan.
6. Pelabelan sampel harus mengandung nama sampel, waktu pengambilan, tempat pengambilan, nama operator dan keterangan lain yang mendukung.
39
MENGIDENTIFIKASI TEKNIK SAMPLING, ISOLASI DAN INOKULASI BAKTERI
B. TEKNIK ISOLASI BAKTERI a. Tujuan
1. Mengetahui metoda isolasi dan pemurnian mikroba menggunakan teknik gores.
2. Memahami dan bisa melakukan isolasi biakan menggunakan teknik gores.
b. Teori
Isolasi mikroba adalah langkah pertama menuju identifikasi mikroba.Fungsi kegiatan isolasi adalah memisahkan sebuah kultur yang memiliki banyak jenis mikroba (mixed culture) menjadi hanya satu jenis mikroba (pure culture). Metoda yang umum digunakan adalah metode gores kuadran.
Metode gores kuadran menggunakan prinsip memperkecil jumlah mikroba yang terbawa selama proses gores. Cawan petri dibagi atas empat area yang digores secara melingkar dan berakhir di tengah. Proses menggores tersebut dilakukan secara berurutan sehingga pada area terakhir diharapkan jumlah koloni mikroba yang tumbuh menjadi relatif jarang. Jumlah koloni yang sedikit akan memudahkan untuk diamati dan dipisahkan antara jenis yang berbeda, menuju proses selanjutnya.
Metoda gores sering kali dikombinasikan dengan penggunaan media selektif.
Media selektif memiliki komposisi yang memudahkan pertumbuhan kelompok mikroba tertentu sembari menghambat pertumbuhan kelompok mikroba BAB X
40
lainnya.Sering kali media selektif juga mengkondisikan pertumbuhan koloni mikroba tertentu sehingga koloni tersebut menunjukkan ciri khusus.
c. Alat dan Bahan
1. Alat yang diperlukan antara lain cawan petri, tabung reaksi, pipet ukur, bunsen, jarum ose dan spidol all surface marker.
2. Bahan yang digunakan adalah yoghurt yang mengandung kultur bakteri asam laktat, akuades steril, media De Mann Rogosa and Sharpe (MRS) Agardan plastic wrap yang telah dipotong sesuai ukuran.
d. Prosedur Kerja
1. Transfer 1 ml yoghurt ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml akuades steril secara aseptis, kemudian vorteks selama lebih kurang 5 detik dengan kecepatan tinggi.
2. Secara aseptis, ambil 1 ose dari tabung reaksi dan gores sesuai pola berikut (Gambar 9) pada cawan petri yang telah berisi media MRS. Sebelumnya, tandai permukaan bagian bawah cawan petri dengan spidol all surface.
3. Tutup sisi cawan petri menggunakan plastic wrap.
4. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 – 48 jam.
5. Lakukan pengamatan terhadap ciri koloni sesuai kriteria sebagai berikut (Gambar 10)
6. Pengamatan tambahan dapat berupa warna dan konsistensi koloni (kering, basah, berlendir, permukaan kering sementara isi berupa lendir, dll.)
7. Berikan deskripsi koloni yang anda temukan kemudian tulis pada log book.
41 Catatan:
1. Berikan jeda sekitar 10 detik setelah pembakaran jarum ose sebelum digunakan, atau tempelkan pada agar sampai berhenti mendesis.
2. Selalu balik cawan petri, baik sebelum isolasi atau setelahnya untuk menghindari kondensasi di permukaan agar yang akan merusak hasil gores.
3. Istilah ‘gores’ pada teknik gores bukan berarti membuat robekan pada agar sesuai pola. Pada teknik ini agar tidak boleh luka / robek.Goresan jarum ose hanya membuat pola pada permukaan agar.
4. Teknik gores memerlukan gerakan jari yang luwes dan gerakan siku minimal, begitu pula pergelangan tangan. Oleh karena itu berlatihlah dahulu sebelum praktek pada agar. Gerakan yang tidak luwes akan menyebabkan agar robek.
42 C. TEKNIK INOKULASI BAKTERI a. Pengenalan
Inokulasi merupakan pekerjaan memindahkan mikroba dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Dengan kata lain, inokulasi adalah suatu upaya untuk menanamkan mikroba. Jadi antara isolasi dengan inokulasi memiliki arti yang berbeda.
Sebelum melakukan kegiatan inokulasi, biasanya dilakukan terlebih dahulu kegiatan pembuatan pengenceran bertingkat. Menurut (Wasteson and Hornes, 2009) tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Sehingga memudahkan dalam proses penghitungan jumlah mikrobia. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel.
Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya.
Mikroba jarang terdapat di alam dalam keadaan murni. Kebanyakan merupakan campuran bermacam-macam spesies mikroba. Macam-macam cara isolasi dan inokulasi mikrobia adalah antara lain :
1. Cara Tebar Atau Sebar (Spread Plate Method)
Teknik spread plate merupakan teknik dengan cara menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba.
Karena konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang-kurangnya
43
ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-300 koloni). Koloni mikrobia yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung.
2. Cara Penuangan (Pour Plate Method)
Cara ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 45-50ºC dengan suspensi bahanyang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-koloni yang tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut.
3. Cara Gores (Streak Plate Method)
Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada cawan agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni.
Cara ini dasarnya ialah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut.
Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri yang memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunakan lempengan yang basah. Untuk mencegah hal itu harus digunakan lempengan agar yang benar-benar kering permukaannya.
b. Tujuan Praktikum
Tujuan dilaksanakannya paktikum pembuatan media PDA (Potato Dextrose Agar), Isolasi dan Inokulasi antara lain :
1. Mempelajari cara-cara pembuatan media pertumbuhan mikroba,
44
2. Mengenal berbagai fungsi media pertumbuhan mikroba,
3. Mengetahui dan mempelajari acam-macam teknik sterilisasi dalam kerja mikrobiologi,
4. Mengetahui dan mempelajari cara pembuatan pengenceran bertingkat dalam kerja mikrobiologi,
5. Megetahui dan mempelajari teknik isolasi dan inokulasi mikroba, dan 6. Melihat sifat pertumbuhan dan berbagai bentuk koloni mikroba.
c. Alat Dan Bahan 1. Alat
1) Autoklaf 13) Timbangan analitik
2) Pembakar bunsen 14) Kompor listrik / penangas air 3) Tabung reaksi dan rak tabung 15) Magnetic stirrer
4) Cawan petri 16) Karet gelang 5) Colony counter 17) Alumunium foil
6) Beaker glass 18) Kapas
7) Batang pengaduk 19) Gelas ukur
8) Erlenmeyer 20) Kertas pembungkus
9) Pipet berukuran / volume 21) Jarum ose 10) Filler (Ruber bulb) 22) Batang penyebar 11) Kertas pH universal 23) Botol kaca 12) Mortar atau pestle 24) Vortex 2. Bahan
1) Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Kentang 200 g, dextrose 20 g, agar-agar 15 g dan aquades 1000 ml
45 3. Prosedur Praktikum
1) Teknik Pengenceran Bertingkat
a) Sampel yang mengandung mikroorganisme dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1 ) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat aquades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1 . Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya.
b) Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen (idealnya adalah dihomogenkan menggunakan vortex).
c) Lanjutkan pemindahan hingga tabung pengenceran terakhir (cukup sampai pengenceran 10-6 ) dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama.
2) Teknik Inokulasi
Teknik ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir (pengenceran 10-4, 10-5, dan 10-6).
46
a) Cara tebar atau sebar (spread plate method)
(a) Buatlah pengenceran 10-4 sampai 10-6 dari kultur murni bakteri dengan larutan pengencer,
(b) Ambil tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri, buka dan bakar leher tabung,
(c) Pindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media PDA dalam cawan petri,
(d) Bakar spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol, biarkan dingin (jika batang spreader terbuat dari plastik, jangan lakukan pembakaran),
(e) Tebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan sampai permukaan agar mengering
(f) Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara terbalik selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya, dan
(g) Bandingkan pertumbuhan dari tiap-tiap pengenceran.
b) Cara penuangan (pour plate method)
(a) Dinginkan media PDA dalam tabung reaksi sampai suhu ± 45 - 50ºC (cirinya : terasa hangat di kulit),
(b) Buka tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri, dan bakar leher botol,
(c) Pindahkan 1 ml kultur murni bakteri ke dalam tabung reaksi yang mengandung PDA secara aseptis,
