MODUL TEORI PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM

(1)

i

MODUL TEORI

MEDIA dan REAGENSIA II

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK

INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM

(2)

ii

VISI dan MISI

INSTITUT KESEHATAN MEDISTRA LUBUK PAKAM

Visi

Menjadi Institut yang unggul dan profesional dalam bidang kesehatan di tingkat Nasional dan Asia tahun 2028.

Misi

1. Menyelenggarakan pendidikan dan pengajaran yang unggul, berkarakter, dan kompeten yang adaptif terhadap perkembangan ilmu pengetahuan, teknologi, seni dan globalisasi;

2. Menyelenggarakan penelitian yang inovatif, produktif dan responsif terhadap ilmu pengetahuan, teknologi dan kebutuhan masyarakat;

3. Menyelenggarakan kegiatan pengabdian kepada masyarakat berlandaskan nilai dan tanggung jawab sosial; dan

4. Menjalin kerjasama yang baik dengan stakeholder mulai dari pemerintah, dunia usaha dan masyarakat sebagai pengguna lulusan.

(3)

iii

VISI dan MISI FAKULTAS FARMASI

Visi

Menghasilkan lulusan yang unggul dan professional dalam mutu pendidikan di bidang Farmasi Klinis dan Komunitas serta Mikrobiologi Molekuler Klinis yang Mampu Bersaing di tingkat Nasional dan Asia Tahun 2022.

Misi

1) Menyelenggarakan proses belajar mengajar yang kondusif dengan sistem yang mendukung pada FF sehingga pembelajaran tersebut menghasilkan prodi yang dapat menghasilkan alumni berkarakter unggul, kompeten, dan excellent service;

2) Menyelenggarakan proses praktik laboratorium yang kondusif dan handal di berbagai fasilitas pelayanan kesehatan masyarakat;

3) Mengoptimalkan dan mengimplementasikan penelitian bidang Farmasi Klinis dan Komunitas dan Mikrobiologi Molekuler Klinis dengan menggunakan pendekatan riset dalam bidang Farmasi dan Teknologi Laboratorium Medik;

4) Mengimplementasikan program pengabdian kepada masyarakat berbasis riset untuk menyelesaikan berbagai permasalahan di bidang Farmasi dan Teknologi Laboratorium Medik; dan

5) Mengembangkan kerjasama dengan institusi pendidikan, pelayanan, organisasi, dan stakeholders baik dalam maupun luar negeri.

(4)

iv

VISI dan MISI

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK

Visi

Menjadi program studi yang unggul dan professional dalam bidang Mikrobiologi Molekuler Klinis Tahun 2022

Misi

1. Menyelenggarakan pendidikan Teknologi Laboratorium Medik yang unggul dan excelent service dalam bidang Mikrobiologi Molekuler Klinis;

2. Menyelenggarakan proses praktik laboratorium yang kondusif diberbagai fasilitas pelayanan kesehatan masyarakat;

3. Mengoptimalkan dan mengimplementasikan penelitian di bidang Mikrobiologi Molekuler Klinis dengan menggunakan pendekatan riset dalam bidang Teknologi Laboratorium Medik;

4. Mengimplementasikan program pengabdian kepada masyarakat berbasis riset untuk menyelesaikan berbagai permasalahan di bidang Mikrobiologi Molekuler Klinis; dan

5. Mengembangkan kerjasama dengan institusi pendidikan, pelayanan, organisasi, dan stakeholders baik dalam maupun luar negeri.

(5)

v

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kepada kehadirat Allah SWT, karena atas izin-Nya Modul dari Mata Kuliah media dan reagensia II ini dapat diselesaikan. Modul ini disusun untuk menambah bahan bacaan mahasiswa dalam mengikuti perkuliahan media dan reagensia II

Modul bakteriologi I ini disusun untuk memenuhi kebutuhan mahasiswa Program Studi Teknologi Laboratorium Medik Fakultas Farmasi Institut Kesehatan Medistra Lubuk Pakam dalam menempuh matakuliah media dan reagensia II Modul ini disusun dengan kualifikasi merangkum semua materi teoritis.

Penyusun mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang tidak bisa disebutkan satu per satu atas selesainya modul ini. Penyusun menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan modul ini. Oleh karena itu segala masukan dari berbagai pihak sangat diharapkan guna penyempurnaan modul ini.

Lubuk Pakam, Juli 2020

(6)

vi DAFTAR ISI

Visi Dan Misi Institut Kesehatan Medistra Lubuk Pakam ... i

Visi Dan Misi Fakultas Farmasi ... ii

Visi Dan Misi Program Studi Teknologi Laboratorium Medik ... iii

Kata Pengantar ... iv

Daftar Isi ... v

BAB 1 Konsep Dasar Media ... 1

BAB 2 Komposisi Media ... 11

BAB 3 Media Transport ... 13

BAB 4 Media Pemupuk ... 16

BAB 5 Media Differensial ... 18

BAB 6 Media Selektif ... 23

Bab 7 Media Pemeriksaan Mpn ... 25

BAB 8 Media Penyimpanan ... 29

BAB 9 Media Untuk Pemeriksaan Jamur ... 33

BAB 10 Media Biokimia Reaksi Dan Identifikasi Jenis Gula-Gula 42 BAB 11 Media Biokimia Rekasi Dan Identifikasi Jenis Tsia ... 45

BAB 12 Media Biokimia Rekasi Dan Identifikasi Jenis Vp, Mr, Dan Indol ... 50

BAB 13 Media Biokimia Rekasi Dan Identifikasi Jenis Urea ... 57

BAB 14 Media Biokimia Rekasi Dan Identifikasi Jenis Simon Citrat ……….. 60

(7)

vii

(8)

1

KONSEP DASAR MEDIA A. Pengertian Media

Media merupakan suatu campuran bahan-bahan tertentu dengan aquadest yang dapat menimbulkan mikro organisme pada derajat keasaman dan inkubasi tertentu, atau bahan yang di gunakan untuk memperkembangakan mikro organisme di laboratorium secara invitro. Sebelum di gunakan media harus dalam keadaan steril, artinya tidak di tumbuhi oleh mikroba lain yang tidak di harapkan.

Media perbenihan adalah media nutrisi yang disiapkan untuk menumbuhkan bakteri didalam skala laboratorium. Media perbenihan harus dapat menyediakan energi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri. Media harus mengandung sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfor dan faktor pertumbuhan organik (Radji, 2010). Sejumlah bakteri yang diinokulasikan pada sebuah media perbenihan disebut inokulum. Bakteri yang tumbuh dan berkembangbiak dalam media perbenihan itu disebut biakan bakteri (Radji, 2010).

Persyaratan-persyaratan agar media dapat di tumbuhi dan mikroba dapat berkembang dengan baik yaitu :

1. Dalam media harus terkandung semua unsur hara yang di perlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri.

2. Media harus mempunyai tekanan osmosa dan PH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba.

3. Media harus keadaan steril

B A B

I

(9)

2 B. Kepentingan Media

Untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroba, diperlukan suatu substrat yang disebut media. Sedang media itu sendiri sebelum dipergunakan harus dalam keadaan steril, artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan. Susunan bahan, baik berbentuk bahan alami (seperti toge, kentang, daging, telur, wortel, dan sebagainya) ataupun bahan buatan (berbentuk senyawa kimia, organik maupun anorganik) yang dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba, dinamakan media.

Agar mikroba dapat tumbuh dan berkembang dengan baik di dalam media, diperlukan persyaratan tertentu, yaitu:

1. Bahwa di dalam media harus terkandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan mikroba.

2. Bahwa media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba.

3. Bahwa media harus dalam keadaan steril, artinya belum ditanami mikroba yang dimaksud, tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan.

C. Persyaratan Media

Untuk dapat menjadi media yang baik untuk pertumbuhan mikroba yang diharapkan, media memiliki persyaratan. Persyaratan tersebut meliputi:

1. Susunan makanan

Unsur-unsur yang diperlukan dalam media meliputi air, sumber karbon, sumber nitrogen, vitamin, mineral dan gas. Bakteri peka terhadap

(10)

3

kekeringan sehingga perlu air yang cukup sehingga kondisi tetap selalu lembab. Untuk sumberkarbon dapat digunakan senyawa karbon sederhana seperti CO2, CH4 atau senyawa karbon kompleks seperti gula (misal:

glukosa, laktosa, sukrosa dan lain sebagainya). Senyawa Nitrogen dapat berasal dari senyawa nitrogen sederhana seperti NH3 atau nitrogen yang lebih kompleks seperti pepton dan asam amino. Mineral yang sering dibutuhkan dalam media adalah K, Mg, Na, Zn, P, S dan Cl. Beberapa bakteri membutuhkan vitamin K (misal : Bacteriodes melanogenicus) dan juga gas (misal:Gonococcus membutuhkan CO2), namun ada juga bakteri tertentu justru mati jika ada oksigen (bakteri anaerob).

2. Temperatur

Bakteri agar dapat tumbuh optimal membutuhkan suhu tertentu.

Umumnya bakteri patogen membutuhkan suhu sekitar 37^oC sesuai dengan suhu tubuh manusia walaupun ada juga bakteri yang membutuhkan suhu tinggi seperti Camphylobacter (42^oC).

3. Tekanan osmose

Secara umum untuk pertumbuhannya, bakteri membutuhkan media isotonik. Apabila media bersifat hipotonik maka bakteri akan mengalami plasmoptysis dan apabila bersifat hipertonik, bakteri akan mengalami plasmolysis.

4. Derajat keasaman (pH)

Sebagian besar bakteri membutuhkan pH sekitar netral. Namun beberapa bakteri butuh perlakuan khusus sebagai contoh bakteri Vibrio yang membutuhkan pH alkali sekitar 8-10 untuk dapat tumbuh optimal.

(11)

4 5. Sterilitas

Sterilitas merupakan hal yang mutlak dibutuhkan untuk melakukan pemeriksaan mikrobiologi, karena bakteri yang diharapkan tumbuh adalah bakteri penyebab. Jika media yang digunakan tidak steril maka tidak dapat dibedakan apakah yang tumbuh merupakan bakteri yang dibutuhkan atau hanya sekedar bakteri kontaminan.

D. Jenis-Jenis Media

Bentuk susunan dan sifat media di tentukan oeh senyawa penyusun media, persentase campuran dn tujuan penggunaan. Bentuk media di tentukan oleh ada tidaknya penambahan zat pemadat seperti agar-agar, gelatin, dsb. Bentuk media di kenal 3 jenis yaitu : media padat, media cair dan media semi solid.

1. Macam-macam Media berdasar sifat fisiknya a. Media Padat

Media yang digunakan untuk kultur/pertumbuhan bakteri atau mempelajari koloni bakteri dalam bentuk padat, dapat diletakan di petri disk ataupun tabung. Media dapat berbentuk padat datar, padat tegak maupun padat miring.

(12)

5

Contoh media padat

b. Media cair

Media dalam wujud cair yang digunakan untuk perbenihan/memperkaya sebelum dikultur pada media padat. Media ini tidak dapat digunakan untuk mempelajari koloni. Contoh media cair:

media kaldu, alkali pepton, 7H9 dan lain-lain.

Contoh media cair

c. Media semisolid (setengah padat)

Untuk mengetahui pertumbuhan mikroba atau mengetahui motilitas bakteri.

(13)

6

Contoh media semisolid

2. Macam-Macam Media Berdasarkan Kegunaannya

Macam-macam media berdasarkan kegunaan atau tujuannya. yaitu media untuk pembiakan secara umum, media yang diperkaya, media pembiakan selektif, media pembiakan diferensiasi, serta media kombinasi selektif dan diferensiasi. Penjabaran media tersebut sebagai berikut:

a. Media Umum

Media umum merupakan media padat yang mengandung bahan-bahan semi alamiah, digunakan untuk pembiakan secara umum mengandung unsur-unsur untuk pertumbuhan mikroorganisme secara umum tanpa mengandung unsur penghambat tertentu. Dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri dan jamur.

b. Media Transport

Media transport adalah media yang digunakan untuk membawa spesimen dari suatu tempat ke tempat lain, agar mikroba yang ada di dalamnya (akan diperiksa), tetap terjaga kehidupannya sehingga memudahkan untuk mendiagnosis atau untuk keperluan lain. Macam- macam media transport di antaranya Stuart, Amies, Carry and Blair, alkali pepton dan lain-lain. Penggunaan masing-masing media adalah sebagai berikut:

1. Media Stuart merupakan media yang digunakan untuk media transport terutama kuman perut (gram negatif). Misal spesimen yang berasal dari feses.

(14)

7

2. Media Amies merupakan modifikasi dari media stuart, dapat untuk spesimen dari sekret atau luka, bagus untuk membawa spesimen dengan kecurigaan gonorrhoea

3. Media Carry and Blair merupakan media dengan konsistensi semi solid, memiliki pH 7,2± 0,2 dengan standar pembuatan media, merupakan transport umum

4. Media Alkali pepton digunakan untuk kecurigaan bakteri vibrio c. Media Diperkaya

Media diperkaya/media kaya adalah media yang ditambahkan zat-zat organik yang diperoleh dari makhluk hidup misal darah, telur dan lain- lain. Media ini dipergunakan untuk pertumbuhan bakteri yang tidak dapat tumbuh pada media sederhana misal Gonococcus, Streptococcus dan Pneumococcus.

1. Media Selektif

Media pembiakan selektif mendukung pertumbuhan mikroorganisme jenis tertentu dan menghambat pertumbuhan flora campuran lain. Selektifitas ini diperoleh dengan menambahkan bahan kimia, pewarna, atau antibiotik pada media. Contoh media ini adalah Grup A Selective Strep Agar dengan 5% darah domba.

2. Media Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) merupakan media selektif untuk bakteri Vibrio colera.

3. Media Salmonella & Shigella Agar (SSA), media ini digunakan untuk menyeleksi bakteri Salmonella dan Shigella

(15)

8 d. Media Diferensial

Sedangkan media diferensial adalah media yang mengandung unsur yang memungkinkan untuk mengidentifikasi mikroorganisme jenis tertentu dari kultur murni atau campuran. Identifikasi ini biasanya berdasarkan penampakan dari mikroorganisme, seperti warna koloni atau adanya presipitat. Contoh media ini adalah :

1. Media Mac Conkey : pada media ini dapat dibedakan bakteri yang memfermentasikan laktosa dan yang tidak memfermentasikan laktosa

2. Media Klinger Iron Agar (KIA): pada media ini dapat diketahui bakteri yang memfermentasikan laktosa dan glukosa serta pembentukan H2S

3. Triple Sugar Iron Agar (Agar TSI) yang digunakan untuk mengidentifikasi organisme intestinal gram negatif berdasarkan kemampuannya untuk memfermentasikan dektrosa, laktosa, dan sukrosa, serta menghasilkan sulfida (Rachdie. 2006).

e. Media Kombinasi

Media jenis ini dapat berupa media yang tidak diperkaya, seperti Trypticase Soy Agar, maupun media yang diperkaya, misalnya Trypticase Soy Agar dengan 5% darah domba. Media berdasarkan Komposisi :

1. Media Sintetis, yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.

(16)

9

2. Media semi sintetis, yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misalnya Potato Dextrose Agar (PDA) yang mengandung agar, dextrose, dan ekstrak kentang.

3. Media nonsintetis, yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.

4. Media berdasarkan Tujuan

a. Media untuk isolasi (media umum) Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, missal : Nutrient Broth, Blood Agar

b. Media Selektif/ penghambat Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan.

c. Media diperkaya (Enrichment) Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks, seperti darah, serum, dan kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu.

d. Media untuk peremajaan kultur

e. Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur

(17)

10

f. Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik Media ini digunakan untuk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya, Koser’s Citrate media, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon

g. Media untuk karakterisasi bakteri Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang- kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia.

h. Media Differensial Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasarkan karakter spesifik yang ditunjukkan pada media differensial, misalnya TSIA yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni, dan perubahan warna media disekeliling koloni.

(18)

11

KOMPOSISI MEDIA

A. Pengertian dan Fungsi Media Pertumbuhan

Media pertumbuhan mikroba adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroba untuk pertumbuhannya.

Mikroba memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolate mikroba menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya(Alderberg.1982).

B. Dasar – Dasar Pembuatan Media

Media berisi bahan-bahan yang berdasarkan fungsinya dapat dibagi menjadi ; 1. Bahan Dasar

a. Air (H2O) sebagai pelarut

b. Agar-agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media agar sulit didegradasi oleh mikroba pada umumnya dan mencair pada suhu 45°C

c. Gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menuraikannya dibanding agar.

d. Silica gel yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus untuk memadatkan media bagi mikroba autotrof obligat.

2. Nutrisi; Protein / peptide/asam amino. Komponen protein yang diperlukan mikroorganism adalah peptone, tergantung kebutuhannya dapat berupa

B A B II

(19)

12

meat peptone maupun no meat peptone (Casein dan soya peptone) ataupun campuran dari keduanya

3. Energi ; bahan yang dipakai adalah karbohidrat, yang paling banyak digunakan adalah glukosa .

4. Logam dan mineral ; dapat dibagi menjadi -Makro komponen ; Misal

;Na,K,C1,C2 Mg,Fe -Mikro komponen ; Misal ;Zn,Mn,Bi Logam dan mineral terkandung di dalam peptone, butter dan agar sehingga sering kali tidak tercantum di dalam resep.

5. Buffer ; untuk pertumbuhan mikro organisme tertentu dibutuhkan pH medium yang optimum. Contoh bahan butter : rostat, citrate, asetat dan asam amino spasitik.

6. Indikator : penambahan indikator merupakan cara efektif untuk mendekteksi termentesi Karbohidrat spesifik.

7. Bahan selektif ; Bahan selektif dapat berupa bahan kimia atau antibiotika yang ditambakan pada media bertujuan untuk menekan pertumbuha mikro organisme yang tidak diinginkan sehinga hanya mikro organisme yang diingikan yang tumbuh .

8. Gelling agents : Biasanya adalah agar, agar untuk media diproses sehingga dihasilkan agar yang toksisitasnya rendah, jernik,kandungan mineralnya rendah dan kemampuan dirusinya tinggi .

9. Komponen –komponen lain mungkin ditambahakn untuk tujuan tertentu.

Contohnya : Faktor pertumbuhan, untuk mikro organisme yang sulit tumbuh . Darah penuh: untuk mendektesi enzyme hemolytic.

(20)

13

MEDIA TRANSPORT

A. Definisi Media Transport

Media yang dibuat dengan tujuan melindungi mikroorganisme untuk tetap hidup apabila pemeriksaan terpaksa ditunda.Digunakan untuk pemeriksaan bakteriologi dengan cara swab, misal rectal swab, swab tenggorok, pus (luka,genitalia). Contoh media transport yaitu media Cary and Blair, media Amies, media Stuart(Purwoko,2007).

B. Macam-Macam Media Transport

1. Media Stuart Media yang ditemukan pertama kali oleh Dr. R.D Stuart dan merupakan media transport sampel untuk swab pertama kali. Media Stuart digunakan utnuk isolasi bakteri gram negative dan gram positif.

a. Komposisi media :

1. Sodium Glycerophosphate 10.0 gr 2. Calcium Chloride 0.1 gr

3. Metcaptoacetic Acid 1.0 ml 4. Distilled water 1,0 L

b. Cara pembuatan :

1. Larutkan 14.1 gr media dalam 1 liter air suling 2. Dipanaskan hingga homogeny

3. Dimasukkan ke dalam botol atau tabung bertutup

4. Disterilkan autoclave dengan suhu 121C selama 15 menit 5. Didiamkan pada suhu kamar

B A B II

I

(21)

14

2. Media Cary and Blair Merupakan media modifikasi dari media Stuart asli, tetapi khusus untuk media transport dari sampl untuk isolasi bakteri pathogen atau bakteri gram negative.

a. Komposisi media :

1. Disodium Hydrogen Phospate 1.10 gr 2. Sodium Thioglycollate 1.50gr

3. Sodium Chloride 5.00 gr 4. Calcium Chloride 0.09 gr 5. Bacteriological Agar 5.60 gr 6. Destilated Water 1.0 liter b. Cara pembuatan:

1. Ditimbang 1.5 gr sodium chloride

2. 1.1 gr disodium hydrogen, 5 gr bacteriological agar, dilarutkan aquades 990 ml

3. Didiamkan pada suhu 50C dan ditambahkan 9 ml larutan calcium chloride 1%

4. Disesuaikan pH (8,4)

5. Dimasukkan 7-10 ml ke dalam botol bertutup 6. Disterilkan autoclave 121C selama 15 menit 7. Simpan dalam suhu kamar

3. Media Amies Merupakan media modifikasi dari media Stuart, dan digunakan untuk mengisolasi bakteri gram negative.

(22)

15 a. Komposisi media :

1. Sodium Chlorid 3.00 gr 2. Pottasium Chlorid 0.20 gr 3. Calcium Chlorid 0.10 gr 4. Magnesium Chlorid 0.10 gr 5. Monopottasium Phospate 0.20 gr 6. Disodium Phospate 1.15 gr 7. Sodium Thioglycollate1.00 gr 8. Distilled Water 1.00 liter

(23)

16 BAB 4

MEDIA PEMUPUK A. Pengertian Media Pemupuk

Media Pemupuk merupakan media yang menguntungkan pertumbuhan kuman-kuman tertentu tertentu karena mengandung bahan-bahan tambahan ataupun bahan penghambat yang menekan tumbuhnya competitor Media ini juga bertujuan untuk meningkatkan jumlah mikroorganisme yang diduga terlalu sedikit dalam bahan sampel sehingga akan mudah untuk dihitung atau dianalisa lebih lanjut. Contoh media pemupuk yaitu NaCl broth, Pepton Alkalia(PA), Selenite broth, Buillon (NB)(Uriwiria,1985).

B. Jenis Media Pemupuk

a. Media NaCl Broth Media untuk pertumbuhan kuman Staphylococcus aureus, dengan pembiakan secara invitro.

Komposisi media :

(1) Beff extract 3 gr(2) Peptone 10 gr(3) Sodium Chloride 100 gr

Carapembuatan: :

(1) Ditimbang pepton a gram, NaCl b gram, beef extract c gram (2) Dimasukkan erlenmeyer

(3) Dilarutkan dengan aquades (4) Dipanaskan hingga homogen (5) Di cek pH

(6) Dituang pada tabung reaksi (7) Disterilkan autoclave

(24)

17

b. Media Pepton Alkalis Media untuk pertumbuhan bakteri Vibrio cholera, dengan pembiakan kuman secara invitro

Komposisi media :(1) Peptone 10 gr(2) Na chloride 10 gr(3) Aquades 1 liter

Cara pembuatan : (1) Ditimbang pepton sebanyak 0.24 gr dan NaCl 0.24 gr (2) Dimasukkan Erlenmeyer ditambah aquades (3) Dipanaskan hingga homogen (4) Di cek pH (5) Dituang pada tabung reaksi (6) Disterilkan autoclave.

c.Media Selenite Broth Media untuk pertumbuhan bakteri Salmonella dan Shigella, dengan pembiakan kuman secara invitro.

d. Media Buillon Media untuk pertumbuhan bakteri E.coli, dengan pembiakan kuman secara invitro.

Komposisi media :(1) Peptone 5 gr(2) Beef extract 3 gr (3) Aquades 1 lter (standart 8 gr/1000 ml)

Cara pembuatan : (1) Ditimbang media x gr (2) Ditambah aquades x ml (3) Dipanaskan hingga larut (4) Dituang dalam tabung (5) Disterilkan autoclave

(25)

18 BAB 5

MEDIA DIFFERENSIAL

A. Pengertian Media Differensial

Media diferensial adalah media yang mengandung unsur yang memungkinkan untuk mengidentifikasi mikroorganisme jenis tertentu dari kultur murni atau campuran. Identifikasi ini biasanya berdasarkan penampakan dari mikroorganisme, seperti warna koloni atau adanya presipitat. Media yang karena adanya komposisi kimiawi dapat memberikan ciri khusus pada genus kuman tertentu(Bridson1998).

B. Jenis-Jenis Media Differensial a. Mac Conkey :

Untuk membedakan kuman-kuman tidak meragi lactose.

Fungsi : Media Mac Conkey adalah media yang digunakan untu mengidentifikasi kuman yang meragi laktosa dan tidak meragi laktosa.

Kuman-kuman yang meragi laktosa akan menghasilkan asam dan merubah pH media menjadi asam dengan adanya indicator Neutral red maka media akan berwarna merah muda. Kuman-kuman yang tidak meragi laktosa tidak menghasilkan asam melainkan senyawa yang bersifat basa/alkali sehingga pH media menjadi basa dengan adanya indicator Neutral red maka media akan berwarna kuning. MC juga dipakai untuk mengisolasi kuman Gram negatif karena menghambat pertumbuhan kuman Gram positif,

Prosedur :

1. Siapkan alat dan bahan, bersihkan dan sterilkan Petri yang akan digunakan

2. Lakukan perhitungan media Mac Conkey sesuai jumlah Petri yang akan dibuat

(26)

19

3. Lakukan penimbangan media dengan neraca TBB 4. Pindahkan media dari gelas arloji ke Erlenmeyer

5. Larutkan menggunakan aquadest sesuai volume yang akan dibuat (telah diukur dengan gelas ukur)

6. Panaskan/didihkan di atas api spirtus sampai bener-bener homogen dan larut sempurna

7. Angkat Erlenmeyer dan di suam-suam

8. Dilakukan uji pH menggunakan pH media (apabila pH terlalu asam tambahkan NaOH, apabila terlalu basa tambahkan HCl)

9. Jika pH sudah sesuai, tutup Erlenmeyer dengan kapas kasa dan beri label nama (identitas).

10. Lakukan sterilisasi menggunakan autoklaf pada tekanan 2 atm atau 1,5 lb pada suhu 121 °C selama 15 menit dengan total keseluruhan 45-60 menit.

11. Media yang sudah jadi siap untuk digunakan atau disimpan. Apabila segera digunakan, tuang media dari Erlenmeyer ke Petri dengan volume 15- 20 mL. ratakan membentuk pola angka delapan secara perlahan.

12. Tunggu sampai media memadat

13. Media siap pakai dapat disimpan pada pada suhu 2 – 8 °C atau suhu kamar dan selalu di buat setiap hari.

b. E M B

Untuk membedakan golongan Enterobacte – riaceae terutama techerichia coli dengan Enterobacter aerogenes. Mac Conkey dan EMB dipakai untuk mengisolasi kuman Gram negatif karena menghambat pertumbuhan kuman Gram positif.

Fungsi : Media EMB adalah media yang digunakan untuk membedakan golongan Enterobacteriaceae terutama Eecherichia coli dengan Enterobacter aerogenes. Pada media EMB Eecherichia coli akan menunjukkan pertumbuhan dengan warna hijau metalik. EMB juga dipakai untuk mengisolasi kuman Gram negatif karena menghambat pertumbuhan kuman Gram positif.

Prosedur :

(27)

20

1. Siapkan alat dan bahan, bersihkan dan sterilkan alat terutama Petri yang akan digunakan

2. Lakukan perhitungan media EMB sesuai jumlah Petri yang akan dibuat 3. Lakukan penimbangan media dengan neraca TBB

4. Pindahkan media dari gelas arloji ke Erlenmeyer

5.Larutkan menggunakan aquadest sesuai volume yang akan dibuat (telah diukur dengan gelas ukur)

7. Angkat Erlenmeyer dan di suam-suam

9. Jika pH sudah sesuai, tutup Erlenmeyer dengan kapas kasa dan beri label nama (identitas)

10. Lakukan sterilisasi menggunakan autoklaf pada tekanan 2 atm atau 1,5 lb pada suhu 121 °C selama 15 menit dengan total keseluruhan 45-60 menit 11. Media yang sudah jadi siap untuk digunakan atau disimpan. Apabila segera digunakan, tuang media dari Erlenmeyer ke Petri dengan volume 15- 20 mL. ratakan membentuk pola angka delapan secara perlahan. 12. Tunggu sampai media memadat

13. Media siap pakai dapat disimpan pada suhu 2 – 8 °C.

c. CLED medium (Crystine Lactose Electrolyte Deficient) : - Media untuk deteksi adanya kuman dalam urin.

-perbedaan koloni pada pertumbuhan memberikan nilai diagostik.

d. KIA

untuk indentifikasi Enterobacteriaceae berdasarkan fermentasi 2 ( dua) macam gula serta produksi H2S . Perhatian : siap pakai disimpan pada suhu 2-8 °C kecuali mac Conkey dapat suhu kamar dan selalu di buat setiap hari .

e. BLOOD AGAR PLATE (BAP)

(28)

21

Media BAP adalah media differensial yang diperkaya dengan penambahan darah, terutama darah domba. Namun, bisa diganti dengan golongan darah O manusia. Karena golongan darah O tdk mengandung antigen. Media ini sering digunakan untuk perbenihan kuman/bakteri coccus atau Staphylococcus yang memang membutuhkan media kaya nutrisi agar bisa berkembang.

Fungsi : Media BAP berfungsi untuk membedakan kuman coccus atau Staphylococcus golongan hemolitik dan non hemolitik yang dilihat dari kemampuan mereka dalam melisiskan darah. Kemampuan hemolitik khususnya untuk kuman Staphylococcus dapat dibedakan menjadi hemolisis beta, hemolisis alfa, dan hemolisis gamma. Pada media BAP hemolisis ini ditandai dengan pembentukan zona bening yang berada disekeliling koloni kuman.

Prosedur :

1. Siapkan alat dan bahan, bersihkan semua alat dan sterilkan Petri yang akan digunakan

2. Lakukan perhitungan media Blood Agar Base sesuai jumlah Petri yang akan dibuat

3. Lakukan penimbangan media dengan neraca TBB 4. Pindahkan media dari gelas arloji ke Erlenmeyer

5. Larutkan menggunakan aquadest sesuai volume yang akan dibuat (telah diukur dengan gelas ukur)

6. Panaskan/didihkan di atas api spirtus sampai bener-bener homogen dan larut sempurna 7. Angkat Erlenmeyer dan di suam-suam

9. Jika pH sudah sesuai, tutup Erlenmeyer dengan kapas kasa dan beri label nama (identitas) 10. Lakukan sterilisasi menggunakan autoklaf pada tekanan 2 atm atau 1,5 lb pada suhu 121 °C selama 15 menit dengan total keseluruhan 45-60 menit

(29)

22

11. Lakukan pengambilan darah pada saat menunggu media Blood agar base turun suhunya. Darah yang diambil adalah 8%-10% dari total media yang dibuat. Media BAP yang sudah dingin dengan kisaran suhu 50°-70° C. kemudian masukkan darah segar ke dalam Erlenmeyer dengan perlahan lewat dinding Erlenmeyer. Ratakan dengan mengocok perlahan agar homogeny.

12. Tuang media dari Erlenmeyer ke Petri steril dengan volume 15-20 mL. ratakan membentuk pola angka delapan secara perlahan. 13.

Tunggu sampai media memadat 14. Media siap pakai dapat disimpan pada suhu kamar, kecuali Selenite broth disimpan pada suhu 2 – 8 °C.

(30)

23 BAB 6

MEDIA SELEKTIF A. Pengertian Media Selektif

Media selektif : media yang kompleks yang sangat selektif terhadap kuman – kuman tertentu.

B. Berikut Jenis Media Selektif.

1. MANITOL SALT AGAR (MSA)

FUNGSI : Untuk mengisolasi kuman golongan Staphylococcus yang mampu memfermentasi mannitol dan tahan terhadap kadar garam tinggi.

Golongan Staphylococcus yang dapat menunjukkan pertumbuhan yang khas adalah golongan S.aureus. indicator pada media MSA ini adalah phenol red

PROSEDUR :

1. Siapkan alat dan bahan yang diperlukan

2. Lakukan perhitungan media MSA untuk jumlah dan volume plate atau Petri yang dibutuhkan 3. Lakukan penimbangan gelas arloji kosong, media MSA, dan catat hasilnya

4. Pindahkan bahan dari gelas arloji ke Erlenmeyer

5. Larutkan dengan aquadest, panaskan hingga larut (mendidih) di atas api spirtus

6. Suam-suam dengan air kran

(31)

24

7. pH media dengan melihat ketentuan di etiket bahan. (apabila pH terlalu asam tambahkan NaOH, apabila terlalu basa tambahkan HCl)

8. Tutup erlenmeyer dengan kapas kasa, bungkus cawan petri kosong dengan koran, sterilkan di autoclave selama 15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1,5 atm atau 2 atm. Catatan : cawan Petri juga bisa disterilkan sebelum praktikum dilakukan

9. Tuang media dari Erlenmeyer ke cawan Petri dengan teknik aseptic tentunya

10. Ratakan perlahan dengan memutar petri searah angka delapan 11. Biarkan memadat

12. Media siap dipakai disimpan pada suhu 2 - 8°C 2. Salmonella Shigella Agar (SSA)

FUNGSI : Media selektif untuk isolasi kuman golongan Salmonella dan Shigella

PROSEDUR

: 1. Siapkan alat dan bahan yang diperlukan

2. Sterilkan sehari sebelum praktikum untuk Petri, gelas arloji, Erlenmeyer, gelas ukur yang kaca, spatula (semua alat gelas). Catatan:

media SSA tidak boleh di autoklaf sehingga alat-alat yang digunakan harus disterilkan terlebih dahulu

3. Lakukan perhitungan media SSA untuk jumlah dan volume plate atau Petri yang dibutuhkan 4. Lakukan penimbangan gelas arloji kosong steril, media SSA, dan catat hasilnya. Ingat teknik aseptik

5. Pindahkan bahan dari gelas arloji ke Erlenmeyer steril dengan teknik aseptic

8. pH media dengan melihat ketentuan di etiket bahan. (apabila pH terlalu asam tambahkan NaOH, apabila terlalu basa tambahkan HCl)

9. Tuang media dari Erlenmeyer ke cawan Petri steril dengan teknik aseptic tentunya dengan melewatkan mulut Erlenmeyer ke api Ingat tanpa ada autoklaf sehingga langsung di tuang

10. Ratakan perlahan dengan memutar petri searah angka delapan.

Biarkan memadat

11. Media siap dipakai disimpan pada suhu 2-8 °C 3. Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS)

FUNGSI : Media selektif untuk isolasi kuman golongan Vibrio cholera PROSEDUR :

(32)

25

2. Sterilkan sehari sebelum praktikum untuk Petri, gelas arloji, Erlenmeyer, gelas ukur yang kaca, spatula (semua alat gelas). Catatan:

media TCBS tidak boleh di autoklaf sehingga alat-alat yang digunakan harus disterilkan terlebih dahulu

3. Lakukan perhitungan media TCBS untuk jumlah dan volume plate atau Petri yang dibutuhkan 4. Lakukan penimbangan gelas arloji kosong steril, media TCBS, dan catat hasilnya. Ingat teknik aseptik

5. Pindahkan bahan dari gelas arloji ke Erlenmeyer steril dengan teknik aseptic

7. Suam-suam dengan air kran 8. pH media dengan melihat ketentuan di etiket bahan. (apabila pH terlalu asam tambahkan NaOH, apabila terlalu basa tambahkan HCl)

9. Tuang media dari Erlenmeyer ke cawan Petri steril dengan teknik aseptic tentunya dengan melewatkan mulut Erlenmeyer ke api Ingat tanpa ada autoklaf sehingga langsung di tuang

12. Media siap dipakai disimpan pada suhu 2-8 °C

INGAT : MEDIA TCBS tidak boleh disimpan lebih dari 5 hari

(33)

26 BAB 7

MEDIA PEMERIKSAAN MPN

A. Pengertian MPN(Most Probable Number)

MPN adalah suatu metode untuk menaksir suatu populasi mikrobial dilahan, perairan dan produk agrikultur. Metoda ini digunakan untuk menaksir populasi mikrobial berdasarkan pada ukuran kualitatif spesifik dari jasad renik yang sedang terhitung. Menetapkan adanya bakteri Coliform dalam contoh air dan memperoleh indeks berdasarkan tabel MPN untuk menyatakan perkiraan jumlah Coliform dalam sampel.

Menurut Peleczar et all.1985, ada dua macam ragam tanaman yang sering digunakan yaitu ragam I untuk spesimen yang sudah diolah atau angka kumannya diperkirakan rendah, digunakan ragam 5x10, 1x1, 1x0,1 ml.

Ragam II untuk spesimen yang belum diolah atau angka kumannya diperkirakan tinggi (misalnya air sumur, air sungai, air mata air dan sebagainya)., digunakan ragam 5x10, 5x1, 5x0,1 ml, mungkin dapat dilanjutkan dengan 5x0,01 ml.

B. Metode Mpn Terbagi Atas Tiga Tahap 1. Uji Penduga (Presumptive test)

Merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri Coliform berdasarkan terbentuknya asam dan gas disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri golongan coli.

2. Uji Penegasan (Corfirmed test)

(34)

27

Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan. Dari tabung yang positif terbentuk asam dan gas terutama pada masa inkubasi 24 - 48 jam, suspensi ditanamkan pada media Eosin MethylenBiru Agar (EMBA) Secara Aseptik dengan menggunakan jarum inokulasi.

3. Uji Pelengkap (Completed test)

Pengujian selanjutnya dilanjutkan dengan uji kelengkapan untuk menentukan bakteri Escherichia coli. Dari koloni yang berwarna pada uji ketetapan diinokulasikan ke dalam medium kaldu laktosa dan medium agar miring Nutrien Agar (NA), dengan jarum inokulasi secara aseptik.

C. Macam-macam MPN

1. LACTOSE BROTH 1 (LB1)

Fungsi : Untuk mendeteksi coliform dalam air, makanan dan produk susu; sebagai kaldu pemerkaya untuk Salmonella dan mempelajari fermentasi lactose oleh bakteri pada umumnya.

PROSEDUR : 1. Siapkan alat dan bahan yang diperlukan

2. Lakukan perhitungan media LB untuk jumlah dan ml tabung yang akan dibuat

3. Lakukan penimbangan gelas arloji kosong, lalu media LB, dan catat hasilnya

4. Pindahkan atau media yang sudah ditimbang dari gelas arloji ke Beaker glass

5. Larutkan dengan aquadest, panaskan diatas api spirtus hingga larut

7. Lakukan pH media dengan melihat ketentuan di etiket bahan.

(apabila pH terlalu asam tambahkan NaOH, apabila terlalu basa tambahkan HCl)

(35)

28

8. Tuang media ke tabung reaksi yang telah diberi tabung durham.

INGAT tabung durham tidak boleh terbalik dimana mulut tabung menghadap ke dasar tabung.

9. Lakukan teknik mengocok dengan di tahan pada ujung jempol menutup mulut tabung, tujuannya agar tidak ada ruang udara dalam tabung durham yang bisa mengacaukan identifikasi kuman nantinya.

10. Tutup tabung dengan kapas kasa, tutup dengan koran, sterilkan di autoclave 15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1,5 atau 2 atm

11. Setelah steril miringkan tabung yang berisi media dengan langkah pertama hilangkan embun dengan memutar mutar media baru dimiringkan ingat hanya ada lereng saja

12. Media yang sudah jadi siap untuk digunakan atau disimpan.

Media LB1 siap pakai dapat disimpan pada suhu suhu 2 – 8 °C.

(36)

29 BAB 8

MEDIA PENYIMPANAN

A. Pengertian Media Penyimpanan

Penyimpanan reagensia adalah suatu tindakan menyimpan bahan reagensia sesuai dengan sifat reagen masing-masing, kedalam suatu tempat yang memenuhi kriteria yang tidak merusak bahan reagensia tersebut

1. Petugas memeriksa reagen yang diterima

2. Memeriksa keadaaan kemasan reagen ( masih tersegel/tidak terbuka,tidak rusak/robek)

3.Memeriksa tanggal kadarluarsa

4.Memeriksa keadaan fisik reagen secara visual ( tidak terjadi perubahan warna,adanya endapan,jamur,tau kontaminasi bahan lain) 5.Perhatikan suhu penyimpanan reagen yang akan di simpan Selanjutnya.

.Penyimpanan reagensia harus sesuai dengan suhu penyimpanan yang ada pada kit reagensia tersebut. Penyimpanan reagensia dapat di simpan pada suhu ruangan 15 – 30 derajat atau suhu dingin2 – 8 0 (lemari pendingin).

a) Penyimpanan Reagensia pada suhu ruangan

1. Reagensia disimpan pada tempat yang bersih dan kering yang sudah di sediakan.

2. Penyimpanan reagensia di dalam ruangan harus

(37)

30

memperhatikan suhu ruangan tersebut harus sesuai

3. Jangan menyimpan reagensia di dekat sumber panas, seperti di dekat jendala kaca, lampu, sterilisator dll.

4. Jangan menyimpan reagensia pada tempat yang lembab atau dekat dengan air, seperti di bawah pendingin ruangan, dekat kran air, atau bahan – bahan yang mengandung air.

5. Penyimpanan reagensia tidak boleh di tumpuk dengan bahan lain yang dapat mengkontaminasi atau mencemari reagensia.

Tata cara Penyimpanan Reagensia pada lemari pendingin

1.Reagen di simpan pada rak bagian dalam lemari pendingin pastikan suhu sudah sesuai dengan mengecek pengukuran suhu lemari pendingin.

2.Tidak diperbolehkan menyimpan reagensia pada rak daun pintu lemari pendingin karena suhu akan tidak stabil sewaktu membuka lemari pendingin.

3.Tidak diperbolehkan terlalu sering membuka tutup pintu lemari pendingin karena akan mempengaruhi temperature lemari pendingin

4. Jika reagen diperlukan dalam keadaan dingin agar menyiapkan bok pendingin (cool box) untuk penyimpanan reagensia sementara agar tidak sering membuka tutup pintu lemari pendingin

B. Jenis Media Penyimpanan a. Nutrient agar ;

Merupakan media nutrient agar yang tempatnya di tabung. Hanya terdapat lereng tanpa dasar. Media serba guna yang digunakan untuk subculture, pemeliharaan kuman maupun untuk mengecek kemurnian kuItur yang didapat dari plate

Fungsi Untuk subculture, pemeliharaan kuman maupun untuk mengecek kemurnian kultur.

PROSEDUR :

(38)

31

2. Lakukan perhitungan reagen media NA untuk jumlah dan ml tabung yang akan dibuat

3. Lakukan penimbangan gelas arloji kosong, lalu media, dan catat hasilnya

4. Pindahkan atau media yang sudah ditimbang dari gelas arloji ke Beaker glass

5. Larutkan dengan aquadest, panaskan diatas api spirtus hingga larut 6. Suam-suam dengan air kran

7. Lakukan pH media dengan melihat ketentuan di etiket bahan. (apabila pH terlalu asam tambahkan NaOH, apabila terlalu basa tambahkan HCl) 8. Tuang media ke tabung reaksi

9. Tutup tabung dengan kapas kasa, tutup dengan koran, sterilkan di autoclave 15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1,5 atau 2 atm 10. Setelah steril miringkan tabung yang berisi media dengan langkah pertama hilangkan embun dengan memutar mutar media baru dimiringkan ingat hanya ada lereng saja

11. Media yang sudah jadi siap untuk digunakan atau disimpan. Media NAS siap pakai dapat disimpan pada suhu suhu 2 – 8 °C.

b. Semisolid agar : media untuk penyimpanan kuman media siap pakai disimpan pada suhu 2-8 °C.

Fungsi : media semisolid berfungsi sebagai media kultur atau penyimpanan kuman. Media ini juga digunakan untuk mendeteksi adanya pergerakan kuman

PROSEDUR :

2. Lakukan perhitungan masing-masing bahan untuk jumlah dan ml tabung yang dibutuhkan

3. Lakukan penimbangan Gelas Arloji Kosong, masing-masing bahan/reagen medianya, dan catat hasilnya

4. Pindahkan masing-masing bahan dari gelas arloji ke Beaker glass 5. Larutkan dengan aquadest, panaskan di atas api spirtus hingga larut 6. Suam-suam dengan air kran

(39)

32

7. pH media dengan melihat ketentuan di etiket bahan. (apabila pH terlalu asam tambahkan NaOH, apabila terlalu basa tambahkan HCl) 8. Tuang media ke tabung reaksi

9. Tutup tabung dengan kapas kasa, tutup dengan koran, sterilkan di autoclave 15 menit dengan suhu 121oC, tekanan 1,5 atau 2 atm

10. Setelah steril letakkan pada rak tabung dengan posisi tabung tegak.

Tunggu sampai padat

11. Media yang sudah jadi siap untuk digunakan atau disimpan. Media semisolid siap pakai dapat disimpan pada suhu suhu 2 – 8 °C.

(40)

33 BAB 9

MEDIA UNTUK PEMERIKSAAN JAMUR A. Media Pertumbuhan Jamur

Medium berfungsi untuk mengisolasi, menumbuhkan, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisologi, dan menghitung jumlah mikroba. Proses pembuatan medium harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada medium. Media SDA (Sabouraud Dextrose Agar) merupakan media yang digunakan untuk mengisolasi jamur. Konsistensi media SDA berbentuk padat (Solid) dan tersusun dari bahan sintesis. Fungsi dari media SDA yaitu, isolasi mikroorganisme menjadi kultur murni, untuk budidaya jamur patogen, komensal dan ragi, digunakan dalam evaluasi mikologi makanan, serta secara klinis membantu dalam diagnosis ragi dan jamur penyebab infeksi.

Komposisi media SDA yaitu Mycological peptone 10 g, Glucose 40 g, dan Agar 15 g. Mycological peptone berfungsi menyediakan nitrogen dan sumber vitamin yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroorganisme dalam media SDA, glukosa sebagai sumber energi dan agar berfungsi sebagai bahan pemadat. Kebanyakan jamur terdapat di alam dan tumbuh dengan cepat pada sumber nitrogen dan karbohidrat yang sederhana. Secara tradisional, agar Sabouraud, yang mengandung glukosa dan pepton modifikasi (pH 7,0), telah dipakai karena tidak cepat mendorong pertumbuhan bakteri.

B. Syarat Media Pertumbuhan Jamur

Suatu media dapat menumbuhkan mikroorganisme dengan baik diperlukan persyaratan antara lain (Shilmy, 2017):

1. Media harus mempunyai tekanan osmose Sel mikroba dengan media harus memiliki tekanan osmose yang sama, oleh karena itu untuk pertumbuhannya jamur membutuhkan media yang isotonis.

(41)

34

2. Derajat keasaman (pH) yang sesuai Jamur tumbuh baik dalam kondisi asam yang tidak menguntungkan bagi bakteri. Umumnya fungi menyenangi pH di bawah 7,0. Jenis-jenis khamir tertentu bahkan tumbuh pada pH yang cukup rendah, yaitu pH 4,5-5,5.

3. Temperatur Jamur tumbuh paling baik pada sekitar suhu kamar yang normal. Pada umumnya, lingkungan yang hangat dan lembab mempercepat pertumbuhan jamur karena untuk pertumbuhannya dibutuhkan kelembaban yang tinggi. Umumnya, jamur patogen memerlukan temperatur optimum 30-370C sesuai dengan temperatur tubuh.

4. Media harus steril Pemeriksaan mikrobiologis tidak mungkin dilakukan apabila media yang digunakan tidak steril, karena mikroorganisme yang diidentifikasi atau diisolasi tidak akan dapat dibedakan dengan pasti apakah mikroorganisme tersebut berasal dari material yang diperiksa ataukah hanya kontaminan. Untuk mendapatkan suatu media yang steril maka setiap tindakan (pengambilan media, penuangan media dan lain-lain) dikerjakan secara aseptik dan alat-alat yang digunakan harus steril.

5. Media tidak mengandung zat-zat penghambat Beberapa jamur memproduksi komponen penghambat bagi mikrobia lain, contohnya Penicillium chrysogenum dengan produksi penisilinnya, Aspergillus clavatus, klavasin. Beberapa komponen kimia bersifat mikrostatik, menghambat pertumbuhan jamur (misalnya asam sorbat, propionat, asetat) atau bersifat fungisida yang mematikan jamur. 6. Media mengandung nutrisi untuk pertumbuhan mikroorganisme Nutrisi yang mudah digunakan oleh mikrooganisme meliputi karbon, nitrogen, unsur non logam seperti sulfur dan fosfor, unsur logam seperti Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, dan Fe, vitamin, air, dan energi.

C. Pertumbuhan Jamur

Setiap mikroorganisme mempunyai kurva pertumbuhan, begitu pula fungi. Kurva tersebut diperoleh dari menghitung massa sel pada kapang

(42)

35

atau kekeruhan media pada khamir dalam waktu tertentu. Kurva pertumbuhan mempunyai beberapa fase (Gandjar, 2006) antara lain : 1. Fase lag, yaitu fase penyesuaian sel-sel dengan lingkungan, pembentukan enzim-enzim untuk mengurai substrat;

2. Fase akselerasi, yaitu fase mulainya sel-sel membelah dan fase lag menjadi fase aktif;

3. Fase eksponensial, merupakan fase perbanyakan jumlah sel yang sangat banyak, aktivitas sel sangat meningkat, dan fase ini merupakan fase yang penting dalam kehidupan fungi.

4. Fase deselerasi, yaitu waktu sel-sel mulai kurang aktif membelah, kita dapat memanen biomassa sel atau senyawa-senyawa yang tidak lagi diperlukan oleh sel-sel;

5. Fase stasioner, yaitu fase jumlah sel yang bertambah dan jumlah sel yang mati relatif seimbang. Kurva pada fase ini merupakan garis lurus yang horizontal. Banyak senyawa metabolit sekunder dapat dipanen pada fase stasioner;

6. Fase kematian dipercepat, jumlah sel-sel yang mati atau tidak aktif sama sekali lebih banyak daripada sel-sel yang masih hidup. Umumnya pertumbuhan fungi dipengaruhi oleh (Gandjar, 2006): 1. Substrat Substrat merupakan sumber nutrien utama bagi fungi. Nutrien-nutrien baru dapat dimanfaatkan sesudah fungi mengekskresi enzim-enzim ekstraselular yang dapat mengurai senyawa-senyawa kompleks dari substrat tersebut menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana. Misalnya, apabila substratnya nasi, atau singkong, atau kentang, maka fungi tersebut harus mampu mengekskresikan enzim α-amilase untuk mengubah amilum menjadi glukosa. Senyawa glukosa tersebut yang kemudian diserap oleh fungi.

Apabila substratnya daging, maka fungi tersebut harus mengeluarkan enzim yang proteolitik untuk dapat menyerap senyawa asam-asam amino hasil uraian protein. Contoh yang lain lagi, misalnya substratnya berkadar lemak tinggi, maka fungi tersebut harus mampu menghasilkan lipase agar

(43)

36

senyawa asam lemak hasil uraian dapat diserap ke dalam tubuhnya. Fungi yang tidak dapat menghasilkan enzim sesuai komposisi substrat dengan sendirinya tidak dapat memanfaatkan nutrien-nutrien dalam substrat tersebut.

2. Kelembapan Faktor ini sangat penting untuk pertumbuhan fungi.

Umumnya fungi tingkat rendah seperti Rhizopus atau Mucor memerlukan lingkungan dengan kelembapan nisbi 90%, sedangkan kapang Aspergillus, Penicillium, Fusarium, dan banyak hyphomycetes lainnya dapat hidup pada kelembapan nisbi yang lebih rendah, yaitu 80%. Fungi yang tergolong xerofilik tahan hidup pada kelembapan 70%, misalnya Wallemia sebi, A.glaucus, banyak strain A.tamarii dan A.flavus.

3. Suhu Berdasarkan kisaran suhu lingkungan yang baik untuk pertumbuhan, fungi dapat dikelompokkan sebagai fungi psikorofil, mesofil, dan termofil. Fungi psikorofil adalah fungi yang dengan kemampuan untuk tumbuh pada atau dibawah 0 0C dan suhu maksimum 200C. Hanya sebagian kecil spesies fungi yang psikofril. Fungi mesofil adalah fungi yang tumbuh pada suhu 10- 350C, suhu optimal 20-350C.

Fungi dapat tumbuh baik pada suhu ruangan (22- 250C). Sebagian besar fungi adalah mesofilik. Fungi termofil adalah fungi yang hidup pada suhu minimum 200C, suhu optimum 400C dan suhu maksimum 50- 600C.

Contohnya A.fumigatus yang hidup pada suhu 12-550C. Mengetahui kisaran suhu pertumbuhan suatu fungi adalah sangat penting, terutama bila isolat-isolat tertentu akan digunakan di industri. Misalnya, fungi yang termofil atau termotoleran (C.tropicalis, Paecilomyces variotii, dan Mucor miehei),dapat memberikan produk yang optimal meskipun terjadi peningkatan suhu karena metabolisme funginya, sehingga industri tidak memerlukan penambahan alat pendingin.

4. Derajat keasaman lingkungan pH substrat sangat penting untuk pertumbuhan fungi, karena enzim- enzim tertentu hanya akan mengurai suatu substrat sesuai dengan aktivitasnya pada pH tertentu. Umumnya fungi menyenangi pH di bawah 7.0. Jenis-jenis khamir tertentu bahkan

(44)

37

tumbuh pada pH yang cukup rendah, yaitu pH 4.5-5.5. Mengetahui sifat tersebut adalah sangat penting untuk industri agar fungi yang ditumbuhkan menghasilkan produk yang optimal, misalnya pada produksi asam sitrat, produksi kefir, produksi enzim protease-asam, produksi antibiotik, dan juga untuk mencegah pembusukan bahan pangan.

5. Bahan Kimia Bahan kimia sering digunakan untuk mencegah pertumbuhan fungi. Senyawa formalin disemprotkan pada tekstil yang akan disimpan untuk waktu tertentu sebelum dijual. Hal ini terutama untuk mencegah pertumbuhan kapang yang bersifat selulolitik, seperti Chaetomium globosum, A.niger, dan Cladosporium cladosporoides yang dapat merapuhkan tekstil, atau meninggalkan noda-noda hitam akibat sporulasi yang terjadi, sehingga menurunkan kualitas bahan tersebut.

Selama pertumbuhan, fungi menghasilkan senyawa-senyawa yang tidak dibutuhkan dan dikeluarkan ke lingkungan. Senyawa-senyawa tersebut merupakan suatu pengaman pada dirinya terhadap serangan oleh mikroorganisme lain termasuk terhadap sesama mikroorganisme. Manusia memanfaatkan senyawa-senyawa tersebut, yang kita kenal sebagai antibiotik, untuk mencegah berbagai penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme.

D. Cara Menghitung Pertumbuhan Bakteri

Pertumbuhan mikroorganisme dapat diukur berdasarkan konsentrasi sel (jumlah sel per satuan isi kultur) ataupun destilasi sel (berat kering dari sel-sel persatuan isi kultur). Dua parameter ini tidak selalu sama karena berat kering sel rata-rata bervariasi pada tahap berlainan dalam pertumbuhan kultur, kedua para meter tersebut juga tidak bermakna sama dalam penelitian mengenai biokimia mikroorganisme atau gizi mikroorganisme. Densitas sel adalah kuantitas yang lebih bermakna, sedangkan dalam penelitian mengenai inaktivitas mikroorganisme, kosentrasi sel adalah kuantitas yang bermakna (Pratiwi, 2008).  Pertumbuhan mikroorganisme dapat diukur dengan dua cara, yaitu secara

(45)

38

langsung dan tidak langsung. Pengukuran pertumbuhan mikroorganisme secara langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara,yaitu

1. Metode Total Count

Pada metode ini sampel ditaruh di suatu ruang hitung (seperti hemasitometer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung dengan bantuan mikroskop (Hadioetomo, 1993). Jika setetes kultur dimasukkan kedalam wadah (misalnya hemasitometer) yang diketahui volumenya, maka jumlah sel yang dapat dihitung. Akan tetapi cara tersebut memiliki keterbatasan, yaitu tidak dapat membedakan sel hidup atau mati dan tidak dapat digunakan pada jumlah sel yang sangat sedikit (kurang dari 102 sel/ml) (Purwoko, 2007). Kelemahan lainnya ialah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri karena kekebalan hemositometer tidak memungkinkan digunakannya lensa objektif celup minyak. Hal ini dibatasi dengan cara mencernai sel sehingga menjadi lebih mudah dilihat. Kelemahan lain lagi ialah kadang-kadang cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan sel-sel individu. Cara mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sehinggga tersebut dengan menambahkan bahan anti gumpalan

seperti dinatrium

etilanadiamina tetra asetat dan tween-80 sebanyak 0,1%. Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan (Hadioetomo, 1993).

2.Metode Turbidimetrik

Bila kita harus memeriksa kosentrasi sel jumlah besar biakan, maka metode cawan bukanlah pilihan yang baik karena tidak hanya memakan waktu tetapi juga memerlukan media dan pecah-belah dalam jumlah besar. Untuk kasus demikian tersedia metode yang lebih cepat dan praktis, yaitu pengukuran kekeruhan biakan dengan fotokilometer (Hadioetomo, 1993). Secara rutin jumlah sel bakteri dapat dihitung dengan cara menghitung kekeruhan (turbiditas) kultur. Semakin keruh suatu kultur, semakin banyak jumlah sel. Prinsip dasar metode turbidimeter adalah jika cahaya mengenai sel, maka sebagian cahaya diserap dan

(46)

39

sebagian cahaya diteruskan. Jumlah cahaya yang diserap propisional (sebanding lurus dengan jumlah sel bakteri). Ataupun jumlah cahaya yang diteruskan berbanding terbalik dengan jumlah sel bakteri. Semakin banyak jumlah sel, semakin sedikit cahaya yang diteruskan. Metode ini memiliki kelemahan tidak dapat membedakan antara sel mati dan sel hidup.

Metode Berat Kering Cara yang paling cepat mengukur jumlah sel adalah metode berat kering. Metode tersebut relatif mudah dilakukan, yaitu kultur disaringan atau disentrifugasi, kemudian bagian yang disaring atau yang mengendap hasil sentrifugasi dikeringkan. Pada metode ini juga tidak dapat membedakan sel yang hidup dan mati. Akan tetapi keterbatasan itu tidak mengurangi manfaat metode tersebut dalam hal mengukur efesiensi fermentasi, karena pertumbuhan diukur dengan satuan berat, sehingga dapat diperhitungkan dengan parameter konsumsi substrat dan produksi

senyawa yang diinginkan (Purwoko, 2007).

4. Metode Elektronic Counter

Pada pengukuran ini, suspensi mikroorganisme dialirkan melalui lubang kecil (orifice) dengan bantuan aliran listrik. Elektroda yang ditempatkan pada dua sisi orifice mengukur tekanan listrik (ditandi dengan naiknya tekanan) pada saat bakteri melalui orifice. Pada saat inilah sel terhitung. Keuntungan metode ini adalah hasil bisa diperoleh dengan lebih cepat dan lebih akurat, serta dapat menghitung sel dengan ukuran besar.

Kerugiannya metode ini tidak bisa digunakan untuk menghitung bakteri karena adanya gangguan derbit, filamen, dan sebagainya, serta tidak dapat membedakan antara sel hidup dan sel mati (Pratiwi, 2008).

5. Metode Plating Techique

Metode ini merupakan metode perhitungan jumlah sel tampak (visible) dan di dasarkan pada asumsi bahwa bakteri hidup akan tumbuh, membelah dan memproduksi satu koloni tunggal. Satuan perhitungan yang dipakai adalah CFU (colony forming unit) dengan cara membuat seri pengenceran sampel dan menumbuhkan sampel pada media padat.

(47)

40

Pengukuran dilakukan pada plat dengan jumlah koloni berkisar 25-250 atau 30-300. Keuntungan metode ini adalah sederhana, mudah dan sensitif karena menggunakan colony counter sebagai alat hitung dapat digunakan untuk menghitung mikroorganisme pada sampel makanan, air ataupun tanah. Kerugiannya adalah harus digunakan media yang sesuai dan perhitungannya yang kurang akurat karena satu koloni tidak selalu berasal

dari satu individu sel (Pratiwi, 2008).

6. Metode filtrasi membran

Pada metode ini sampel dialirkan pada suatu sistem filter membran dengan bantuan vaccum. Bakteri yang terperangkap selanjutnya ditumbuhkan pada media yang sesuai dan jumlah koloni dihitung.

Keuntungan metode ini adalah dapat menghitung sel hidup dan sistem perhitungannya langsung, sedangkan kerugiannya adalah tidak ekonomis

(Pratiwi, 2008).

Metode pengukuran pertumbuhan mikroorganisme secara tidak langsung dapatdilakukan dengan beberapa metode sebagai berikut :

1.Metode Viable Count

Kultur diencerkan sampai batas yang di inginkan. Kultur encer ditumbuhkan kembali pada media, sehingga di harapkan setiap sel tumbuh menjadi 1 koloni beberapa saat berikutnya, biasanya 4-12 jam. Akan tetapi cara ini memiliki keterbatasan, yaitu jumlah sel terhitung biasanya lebih dari sebenarnya (kemungkinan besar 1 koloni dapat berasal dari 2 sel) dan tidak dapat di aplikasikan pada bakteri yang tumbuh lambat. Pada metode tersebut yang perlu diperhatikan adalah jumlah sel bakteri harus mendekati kelipatan 10 pada setiap pengencerannya. Jika tidak pengenceran di anggap gagal. Misalnya cawan yang dapat dihitung jumlah selnya adalah yang mempunyai jumlah sel sekitar 2-4 untuk sampel pengenceran (10-x ), 20-40 untuk sampel pengenceran (10(x+1)) dan 200-400 untuk sampel

(48)

41

pengenceran (10-(x+2)).

2. Metode Aktivitas

Metabolik Metode ini di dasarkan pada asumsi bahwa produk metabolit tertentu, misalnya asam atau CO2, menunjukkan jumlah mikroorganisme yang terdapat di dalam media. Misalnya pengukuran produksi asam untuk menentukan jumlah vitamin yang di hasilkan mikroorganisme.

3. Metode Berat Sel Kering

Metode ini umum digunakan untuk mengukur pertumbuhan fungi berfilamen. Miselium fungi dipisahkan dari media dan dihitung sebagai berat kotor. Miselium selanjutnya dicuci dan dikeringkan dengan alat pengering (desikator) dan ditimbang beberapa kali hingga mencapai berat yang konstan yang dihitung sebagai berat sel kering.

D.Prosedur Media Pertumbuhan a. Sabouraud Dextrose Agar (SDA)

FUNGSI : NAP merupakan media nutrient agar yang ada di dalam plate/Petridisk. media ini merupakan media umum atau universal yang digunakan untuk mengisolasi berbagai jenis kuman/mikroba heterotrof seperti contoh dalam perhitungan Total mikrorganisme kosmopolit. Jadi semua bakteri/mikroba bisa tumbuh dengan baik disini.

PROSEDUR :

2. Buatlah larutan kloramfenikol dengan cara melarutkan pada pZ steril.

Caranya ambil pZ steril 10 mL masukkan ke dalam tabung reaksi.

Masukkan 250 mg dosis kloramfenikol dan larutkan sampai homogen.

Ingat teknik Aseptik

3. Lakukan perhitungan media SDA untuk jumlah dan volume plate atau Petri yang dibutuhkan

4. Lakukan penimbangan gelas arloji kosong, bahan, dan catat hasilnya

(49)

42

5. Pindahkan bahan dari gelas arloji ke Erlenmeyer

8. Ph media dengan melihat ketentuan di etiket bahan. (apabila Ph terlalu asam tambahkan NaOH, apabila terlalu basa tambahkan HCl)

9. Tutup erlenmeyer dengan kapas kasa, bungkus cawan petri kosong dengan koran, sterilkan di autoclave selama 15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1,5 atm atau 2 atm. Catatan : cawan Petri juga bisa disterilkan sebelum praktikum dilakukan

10. Campurkan larutan kloramfenikol yang telah dibuat ke dalam Erlenmeyer yang berisi media SDA secara aseptic dengan ketentuan media SDA sudah tidak terlalu panas.

11. Tuang media dari Erlenmeyer ke cawan Petri dengan teknik aseptic tentunya

14. Media siap dipakai disimpan pada suhu 2 – 8°C

BAB 10

MEDIA BIOKIMIA REKASI dan IDENTIFIKASI JENIS GULA GULA

A. Identifikasi Jenis Gula Gula

Media Gula-gula Media gula-gula merupakan media biokimia reaksi untuk identifikasi kuman/bakteri khususnya untuk Deteksi fermentasi oleh kuman. Media gulagula dalam praktikum

(50)

43

kali ini terdapat lima macam yang mewakili pengujian diantaranya Glukosa, Sukrosa, Laktosa, Maltosa dan Mannosa. Media gulagula ini dimasukkan ke dalam tabung yang dilengkapi dengan tabung durham.

Tabung durham digunakan untuk mengetahui adanya gas.

Tidak ada perbedaan bahan atau reagen dalam pembuatan media gula-gula ini. Sehingga, untuk membedakan adalah dengan memberikan warna pada tutup kasa media gula-gula. Glukosa akan ditandai dengan tutup merah, Sukrosa ditandai dengan tutup biru, Laktosa ditandai dengan tutup kuning, Maltosa ditandai dengan tutup hijau dan Mannosa ditandai dengan tutup putih. Media gula- gula yang ditumbuhi kuman dan dikatakan positif akan membentuk asam dan gas. Asam ini yang menyebabkan penurunan pH sehingga media akan berubah warna menjadi kuning dan keruh.

Perubahan warna media ini tidak lepas dari peran indicator dalam media yaitu Brom Tymol Blue (BTB).

B. Prosedur Media dengan Gula-gula

Alat : - Gelas ukur - Gelas arloji - Beaker glass - Tabung reaksi kecil atau tabung gula-gula - Tabung durham - Neraca Triple Beam Balance - Rak tabung reaksi - Kasa Asbes - Pipet tetes - Pengaduk kaca/ spatula - Bunsen / kaki tiga - pH meter/kertas pH - Korek api - Wadah spirtus

Bahan/Reagen : - water pepton - Glukosa, Sukrosa, Laktosa, Maltosa, dan Mannosa - Indikator BTB 0,4% - Larutan NaOH 0,1 N - Aquadest - Larutan HCL 0,1 N - Kapas dan kasa

Prosedur

1. Siapkan alat dan bahan, bersihkan semua alat yang akan digunakan

2. Lakukan perhitungan untuk media water pepton dan gula-gula sesuai jumlah tabung yang akan dibuat

3. Lakukan penimbangan media water pepton menggunakan gelas arloji sebagai wadah untuk setiap bahan dengan neraca TBB

(51)

44

4. Pindahkan media dari gelas arloji ke beaker glass

5. Larutkan menggunakan aquadest sebanyak ml yang dibuat (telah diukur dengan gelas ukur)

7. Lakukan penimbangan media gula-gula dengan neraca TBB sambil menunggu media water pepton mendidih

8. Angkat beaker glass dan di suam-suam

9. Dilakukan uji pH menggunakan pH media, ketentuan pH bisa dilihat pada etiket bahan atau reagen (apabila pH terlalu asam tambahkan NaOH, apabila terlalu basa tambahkan HCl)

10. Jika pH sudah sesuai pisahkan media water pepton ke masing- masing beaker glass dengan volume yang sudah ditentukan dan dihitung di awal

11. Masukkan masing-masing media gula-gula (glukosa, sukrosa, laktosa, maltose dan mannose) pada beaker glass yang telah dibagi dan berisi water pepton

12. Aduk sampai larut sempurna dan tambahkan indicator BTB dengan perbandingan 1:1 yakni 1 perhitungan gula-gula di awal dan 1 perbandingan BTB (Kalau gram gula-gula masing-masing ketemu 0,3 maka BTB yang ditambahkan ya 0,3 ml)

13. Ukur pH kembali media gula-gula jangan sampai pH rendah atau mendekati asam. pH harus basa dengan kriteria warna biru kehijauan atau hijau kebiruan 14. Tuang campuran/larutan media gula-gula kesetiap tabung reaksi yang di dalamnya sudah diberi tabung durham dengan volume yang sama. INGAT tabung durham tidak boleh terbalik dimana mulut tabung menghadap ke dasar tabung.

15. Lakukan teknik mengocok dengan di tahan pada ujung jempol menutup mulut tabung, tujuannya agar tidak ada ruang udara dalam tabung durham yang bisa mengacaukan identifikasi kuman nantinya.

16. Setelah itu tutup dengan kapas kasa yang telah diberi warna sesuai warna gula-gula yang telah ditentukan dan beri label nama (identitas)

17. Lakukan sterilisasi menggunakan autoklaf pada tekanan 2 atm atau 1,5 lb pada suhu 121 °C selama 15 menit dengan total keseluruhan 45-60 menit

(52)

45

18. Media gula-gula yang sudah jadi siap untuk digunakan atau disimpan. Media gula-gula siap pakai dapat disimpan pada suhu 2 – 8 °C. NB: Pelarut media gula- gula bukanlah akuades tetapi water pepton