ISOLASI BAKTERI SELULOLITIK RUMEN KERBAU SEBAGAI PROBIOTIK UNTUK MENINGKATKAN
2. BAHAN DAN METODE Tempat dan Lama Penelitian
Penelitian lapangan di laksanakan di Stasiun Penelitian, Fakultas Peternakan Kampus Bukit Jimbaran, Universitas Udayana, Denpasar. Sedangkan analisis laboratorium dilaksanakan di laboratorium Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan, dan Lab. Biosain Universitas Udayana, Denpasar. Penelitian berlangsung selama enam bulan.
Pengambilan dan Penyiapan Sampel Sumber Mikrobia
Cairan rumen kerbau diperoleh pada rumah pemotongan hewan di daerah Sangeh, Kabupaten Badung. Cairan rumen kerbau segera diambil setelah ternak dipotong. Sampel dimasukkan ke dalam termos yang sebelumnya berisi penuh air hangat (temperatur sekitar 390C) yang isinya telah dikeluarkan. Termos diisi penuh sampel, kemudian ditutup rapat hingga terbebas dari kontaminasi udara dan segera digunakan untuk penelitian.
Ampas Tahu
Ampas tahu diperoleh dari industri rumah tangga pembuatan tahu di daerah Ubung Kaja, Denpasar Barat.
Bahan/Substrat dalam Isolasi Bakteri Selulolitik Cairan Rumen Kerbau
Bahan yang digunakan sebagai sumber isolat adalah sampel cairan rumen kerbau, larutan pengencer (medium No. 14 Bryant dan Burkey, sesuai dengan Ogimoto dan Imai, 1981), medium pertumbuhan selektif cair/padat (medium No. 6 dalam Ogimoto dan Imai, 1981) dengan CMC dan atau avicel sebagai substrat, ekstrak cairan rumen kerbau (sebagai sumber nutrient medium), larutan mineral yaitu formula No. 32 Bryant and Burkey dalam Ogimoto dan Imai, 1981), reagensia uji kemampuan probiotik untuk isolat dan reagensia uji morfologi dan biokemis isolat, serta reagensia untuk analisis biologi molekuler (PCR).
Sampel yang telah disiapkan (cairan rumen kerbau) harus terbebas dari oksigen dan segera digunakan di laboratorium. Sebanyak 45 ml larutan pengencer (Medium No. 14, Bryant and Burkey dalam Ogimoto and Imai, 1981) ditempatkan pada tabung steril dan dialiri gas CO2 serta ditambahkan 5 gram sampel limbah isi rumen kerbau (sampel sumber mikroba selulolitik) sambil dialiri gas CO2. Larutan 10 -1 ini diaduk/divortek selama 5 menit. Selanjutnya sampel diencerkan menjadi 10-2, 10-3, 10-5, 10-7, 10-8
dan 10-9 sambil tetap dialiri CO2. Untuk mendapatkan hasil yang baik diinokulasikan 0,50 ml isolate dari pengenceran tabung pengencer 105kedalam medium selektif bakteri dan diinkubasi padat pada temperature 390C selama 5-7 hari.
Pembuatan ekstrak Cairan Rumen Sebagai Nutrien
Cairan rumen disentrifuse selama 10 menit pada 3.000 rpm, selanjutnya disaring dengan kain kassa dobel.
Pembuatan Medium Pertumbuhan Selektif Bakteri Selulolitik
Medium pertumbuhan selektif dibuat menggunakan formulaNo. 6 Bryant and Burkey (Ogimoto dan Imai, 1981) dengan metode Hungate, menggunakan Carboxy Methyl Cellulosa/CMC sebagai substrat. Medium selektif dibuat dengan mencampur 400 ml cairan rumen, 20 g agar, 1 ml larutan rezasurin 0,1%, 150 ml larutan mineral I, 150 ml larutan mineral II, 250 ml aquadest, dan 2 g substrat dalam tabung
Erlenmeyer 1000 ml. Selanjutnya campuran dipanaskan pada temperature 1000C selama 5 menit untuk
menghomogenkan campuran sambil dialiri gas CO2. Temperatur selanjutnya dijaga pada suhu 450C
dalam water bath. Suasana anaerob tercapai ditandai dengan hilangnya warna pink. Campuran kemudian ditambahkan 32,3 ml sodium karbonat dan 16,7 ml HCl-cistein. Sebanyak 4 ml medium dimasukkan ke dalam tiap tabung Hungate sambil terus dialiri gas CO2 dan selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 20 menit.
Isolasi Bakteri Selulolitik
Isolasi bakteri selulolitik dilakukan dengan metode Wahyudi dan Masduqie (2004), yaitu terlebih dahulu mengkultur sumber isolate/mikroba pada medium Fluid Theoglicollate Broth padat (medium No. 6 dalam Ogimoto and Imai, 1981) menggunakan metode Hungate, dimana 1 ml larutan mikroba dalam pengencer 105-109 diinokulasikan segera ke dalam tabung yang telah berisi medium pertumbuhan cair pada temperature 39-400C dan diisi gas CO2 menggunakan pipet steril. Kemudian tabung ditutup rapat dan diaduk sampai homogeny, selanjutnya dibiarkan dalam suhu ruang sambil terus dialiri gas CO2 sampai kondisi agar memadat. Kultur selanjutnya diinkubasi pada temperature 390C selama 7 hari. Koloni bakteri yang tumbuh diamati morfologinya dan dimurnikan dengan metode streak quadrant pada medium pertumbuhan selektif pada cawan petri. Kegiatan dilakukan berulang sampai isolate bakteri yang dihasilkan merupakan kultur tunggal.
Zona bening disekeliling koloni sebagai ciri khas mikroba selulolitik tidak tampak nyata meskipun dapat dibedakan dengan kolomi jenis lain. Pada hari ke tujuh inkubasi, zona bening mulai tampak lebih jelas.
Koloni berbentuk bulat dengan diameter antara satu sampai dua milimiter, warna krem atau putih kecokelatan, dan tidak tembus pandang. Koloni lain yang tumbuh pada medium roll tube berwarna putih terang dan cokelat kemerahan dengan posisi tumbuh melintang berlawanan dengan permukaan agar.
Namun sebagian besar adalah berwarna putih dengan diameter kurang dari 1 mm dengan posisi sejajar dengan permukaan medium agar.
Isolat murni bakteri selulolitik murni yang diperoleh hasil isolasi, selanjutnya di seleksi kemampuannya sebagai agensia probiotik, yaitu uji kemamuan tumbuh pada berbagai level pH dan garam empedu.
Seleksi Kemampuan Isolat Bakteri Selulolitik Tumbuh pada Berbagai Variasi pH
Seleksi kemampuan tumbuh isolate pada berbagai variasi pH khususnya pada pH rendah dilakukan dengan cara memasukkan sebanyak 500 μl kultur isolate bakteri selulolitik murni ke dalam tabung eppendorf
berisi 900 μl medium pertumbuhan selektif cair dengan variasi pH 3.0; 4.0; 5.0; dan 6,5. Kemudian
diinkubasi dalam water bath pada suhu 390C selama 3 jam, selanjutnya disentrifuse pada 7000 rpm selama 5 menit dan supernatannya dibuang. Pellet isolate dicuci dua kali dengan 1500 μl larutan salin. Pellet selanjutnya disuspensikan dalam 1500 μl larutan salin dan sebanyak 50 μl suspensi tersebut diinokulasikan ke dalam 6,5 ml medium pertumbuhan selektif pada pH 7.0 dan diinkubasi selama 24 jam pada temperature 390C. Pertumbuhan isolate diamati dari Optical Dencity/DO dengan spektrofotometer.
Uji Kemampuan Isolat Bakteri Selulolitik Tumbuh pada Berbagai Konsentrasi garamEmpedu Uji atau seleksi kemampuan tumbuh isolate pada berbagai konsentrasi garam empedu dilakukan dengan cara memasukkan 5 ml medium pertumbuhan cair ke dalam 4 tabung reaksi, kemudian diinokulasikan dengan 50 μl kultur isolate bakteri selulolitik murni. Pada tabung reaksi pertama (sebagai kontrol) tidak ditambahkan Natrium Dioksilat/NaDC, sedangkan pada tabung reaksi kedua, ketiga, dan keempat, masing-masing ditambahkan 10 μl, 20 μl, dan 30 μl NaDC 100 mM (setara dengan 0,20 mM; 0,40 mM, dan 0,60 mM NaDC). Kemudian diinkubasi pada temperature 390C selama 24 jam. Selanjutnya diamati optical dencity/DO menggunakan spektrofotometer.
Kemampuan Isolat Mendegradasi Substrat
Kemampuan isolate mendegradasi substrat ditentukan dari diameter zona bening yang terbentuk pada medium yang mengandung substrat Carboxy Methyl Cellulosa/CMC. Kegiatan reaksi dilakukan dengan cara sebagai berikut: Isolat murni pada medium roll tube dipindahkan ke dalam medium selektif cawan petri secara anaerob dengan metode overlay (Lowe, 1986). Cawan petri selanjutnya diinkubasi pada temperature 390C selama 7 hari dalam anaerobic jar yang diisi anaerobic generating kit. Setelah inkubasi, diameter zona bening yang terbentuk diamati dan diukur dengan menggunakan jangka corong.
Adanya zona bening disekeliling koloni menunjukkan bahwa mikroba tersebut mempunyai aktivitas enzim selulase ekstraseluler kuat. Besar kecilnya zona bening dan jelas tidaknya zona bening, merupakan indikator kemampuan mikroba tersebut untuk merombak selulosa, demikian juga cepat dan lambatnya timbul zona bening tersebut (Van Devoorde dan Verstraete, 1987).
Rancangan Percobaan
Rancangan yang dipergunakan dalam penelitian force feedingini adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan 3 macam perlakuan dan enam kali ulangan. Tiap ulangan (individual cage) menggunakan masing-masing satu ekor itik Bali jantan dewasa dengan berat badan homogen. Ketiga perlakuan tersebut adalah sebagai berikut:
• Ampas tahu terfermentasi dengan 0,00% kultur bakteri selulolitik unggulan sebagai kontrol (A).
• Ampas tahu terfermentasi dengan 0,30% kultur bakteri selulolitik unggulan (B),
• Ampas tahu terfermentasi dengan 0,60% kultur bakteri selulolitik unggulan (C)
Fermentasi Ampas Tahu
Fermentasi ampas tahu oleh kultur mikroba selulolitik terpilihdengan prosedur sebagai berikut. Ampas tahu yang sudah dalam bentuk tepung ditambah air sebanyak 50% (volume/berat), kemudian diaduk
secara merata, lalu dikukus selama 45 menit, dihitung sejak air mendidih. Setelah dikukus, selanjutnya didinginkan, kemudian diinokulasi dengan inokulum kultur mikroba selulolitik terpilihpada dosis 0,30% dan 0,60% dari berat pakan yang difermentasi, selanjutnya dimasukkan kedalam ember plastik yang sudah biberi lubang-lubang kecil dibagian penutupnya, selanjutnya diinkubasi dalam suhu ruang dengan ketebalan 2 cm selama 3 hari. Setelah 3 hari,pakan fermentasi dikeringkan selama 24 jam pada suhu 500C (Wahyuni et al., 2008) dan siap digunakan untuk keperluan analisis berikutnya.
Penentuan Kecernaan dengan Metode Force Feeding
Penentuan kecernaan dengan metode ini, terlebih dahulu dipersiapkan masing-masing 6 ekor itik dewasa untuk setiap pakan (sebagai ulangan) yang akan dicobakan. Semua itik dipuasakan pakan (air minum tetap diberikan) selama 16 jam dan ditempatkan dalam kandang metabolis (”individual cage”). Selanjutnya ampas tahu yang sudah dan belum mengalami fermentasi dimasukkan kedalam tembolok itik secara hati-hati dengan bantuan tangan dan slang air. Banyaknya pakan yang diberikan, terlebih dahulu ditimbang sebanyak 50 g.
Sampel pakan dan Ekskreta (feses) selanjutnya dianalisis proksimat dengan metode AOAC (l994). Kandungan protein kasar ditentukan dengan metode Kjeldahl (AOAC, 1994). Sedangkan kandungan serat kasar ditentukan dengan metode Van Soest et al. (l991).
Metabolizable energy (ME) = energi yang dikonsumsi – energi ekskreta
Gross energi dihitung dengan menggunakan adiabatic oxygen bomb calorimeter. Analisis Statistik
Data yang terkoleksi dianalisis dengan sidik ragam sesuai dengan rancangan percobaan yang digunakan. Bila hasil analisis sidik ragam menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05) diantara perlakuan maka dilanjutkan dengan analisis uji Jarak Berganda Duncan pada taraf 5% (Steel dan Torrie, 1989) untuk mengetahui perbedaan rataan peubah respons pada semua perlakuan.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN