Oki W. D. Judianti, Mukamto, Ika Rochmawati, Guntur Trimulyono Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Negeri Surabaya ABSTRAK
Tuban merupakan salah satu kota di Jawa Timur yang memiliki kekhasan sebagai penghasil siwalan. Pohon siwalan banyak ditemukan diwilayah pesisir kota Tuban dan banyak dimanfaatkan oleh sebagian besar masyarakatnya untuk memproduksi “toak” yang di dalam bahasa Indonesia lebih dikenal dengan sebutan tuak. Toak merupakan minuman hasil fermentasi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi bakteri asam laktat (BAL) dari sampel toak sehingga dapat diketahui BAL yang ikut berperan dalam fermentasi pembuatan tuak. Penelitian ini dilakukan dengan metode pour plate menggunakan media de Man Rogose Sharpe (MRS) yang ditambah dengan kalsium karbonat (CaCO3) sebanyak 1 %. Koloni bakteri yang membentuk clear zone kemudian dipurifikasi menggunakan metode streak plate. Hasil penelitian diperoleh 9 isolat bakteri yang 4 diantaranya diduga BAL setelah dilakukan konfirmasi dengan pewarnaan Gram, uji katalase, uji motilitas, dan pewarnaan endospora. Hasil pengamatan mikroskopis keempat isolat bakteri berbentuk batang dan merupakan bakteri Gram positif, memiliki katalase negatif, non motil, dan tidak membentuk endospora.
Kata kunci: Bakteri asam laktat, isolasi, toak
PENDAHULUAN
Tuban merupakan salah satu kota di Jawa Timur yang terkenal dengan sebutan kota toak atau tuak. Di Tuban banyak ditemui tanaman siwalan (Borassus flabellifer Linn.) yang dimanfaatkan oleh masyarakatnya dengan diambil niranya untuk dibuat minuman fermentasi yang dikenal dengan nama daerah toak. Toak merupakan minuman fermentasi yang mengandung kadar alkohol yang tinggi. Proses fermentasi tuak atau yang dikenal diluar negeri sebagai palm wine tidak lepas dari peran yeast dan bakteri. Menurut Chandrasekar et al. (2012), yeast yang berperan dalam proses fermentasi palm wine adalah Schizo
saccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisae, Debaryomyces hansenii dan Zygosaccharomyces rouxii. Bakteri yang terdapat pada palm wine
terutama adalah golongan bakteri asam laktat (BAL) diantaranya adalah Streptococcus,
Pediococcus, Leuconostoc dan Lactobacillus.
Bakteri asam laktat yang dominan biasanya adalah
Lactobacillus plantarum dan Leuconostoc mesenteroides, disamping BAL, pada palm wine
biasanya terdapat juga bakteri asam asetat seperti
Zymomonas mobillis (Chandrasekar et al., 2012).
Nira siwalan memiliki kadar air 86,1%, karbohidrat 13,54, protein 0,3%, lemak 0,02% serta abu atau mineral 0,04% (Susanto, 1994 cit Ristiarini et al., 2000). Menurut Ristiarini et al. (2000), terjadi pertumbuhan mikroflora pada nira siwalan selama fermentasi secara spontan selama 72 jam. Pada awal fermentasi sampai 48 jam fermentasi didominasi oleh khamir. Saat 24 jam dan 36 jam fermentasi berlangsung, sel-sel khamir tampak melakukan pembelahan (budding). Setelah 48 jam fermentasi berlangsung pertumbuhan khamir tidak lagi mendominasi dan muncul mikroflora lain yang jumlahnya meningkat pada saat fermentasi berlangsung selama 60 jam dan 72 jam. Bakteri yang tumbuh pada tahap awal fermentasi adalah golongan bakteri Gram positif yang jumlahnya semakin meningkat selama fermentasi berlangsung 24 jam sampai 36 jam. Setelah fermentasi berlangsung selama 48 jam tampak adanya pertumbuhan bakteri dengan bentuk sel dan reaksi Gram yang berbeda. Pada fermentasi 72 jam muncul bakteri baru yang memiliki bentuk sel lebih kecil dan memiliki reaksi Gram negatif.
Isolasi BAL dari minuman fermentasi, beberapa telah dilaporkan seperti pada penelitian yang dilakukan oleh Kadere dan Kutima (2012), yang telah berhasil mengisolasi Lactobacillus
paracaseisspparacasei, Lactobacillus plantarum,
dan Lactococusslactissplactis dari Mnazi sejenis minuman fermentasi beralkohol dari Kenya yang berbahan dasar hasil sadapan bunga kelapa. Matthias et al. (2009), juga berhasil mengisolasi
Leuconostoc palmae sp. nov. strain TMW 2.694T dari sampel palm wine.
Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri yang mampu menghasilkan asam laktat sebagai produk utama fermentasi karbohidrat dan berdasarkan karakter morfologi, fisiologi, serta
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013 – ISSN:978-979-028-573-6
metabolismenya dapat dideskripsikan sebagai bakteri berbentuk bulat atau batang, Gram positif, tidak membentuk endospora, memiliki katalase negatif, tidak memiliki sitokrom, bersifat mikroaerofilik serta acid tolerant (Axelsson, 1998). Menurut Wibowo dan Ristanto (1988), bakteri asam laktat mampu tumbuh pada habibat dengan kadar garam, gula, dan alkohol yang tinggi, suhu untuk pertumbuhannya berkisar antara 5 – 50oC dan pH antara 3,0 – 8,0 sehingga memiliki distribusi habitat yang bervariasi.
Bakteri asam laktat mampu menghasilkan senyawa-senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen dan bakteri pembusuk yang mungkin mengkontaminasi produk makanan dan minuman fermentasi (Yang, 2000). Senyawa antimikrobia yang dihasilkan oleh BAL adalah hidrogen peroksida, karbon dioksida, asam organik (asam laktat, asam asetat, dan lain-lain, diasetil, dan bakteriosin (Ouwenhand, 1998; Rouse et al., 2007; Wongsuttichote dan Nitisinprasert, 2009). Bakteriosin merupakan suatu polipeptida yang memiliki peran sangat penting dalam teknologi pangan yaitu sebagai bahan pengawet makanan alami (biopreservan) (Cuesta et
al., 2000)
Penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi BAL yang turut berperan dalam fermentasi nira siwalan/toak (palm wine) sehingga dapat diperoleh isolat BAL yang potensial yang dapat digunakan sebgai kultur starter pembuatan minuman atau makanan fermentasi. Tahapan penelitian terdiri dari pengambilan sampel, isolasi bakteri asam laktat, dan pengujian karakter bakteri asam laktat.
METODE PENELITIAN Pengambilan Sampel
Sampel toak diambil dari tempat produksi toak di Tuban, Jawa Timur. Sampel diambil menggunakan botol steril kemudian dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Surabaya.
Isolasi Bakteri Asam Laktat
Isolasi BAL dilakukan dengan cara mengambil 1 ml sampel toak, kemudian diencerkan menggunakan seri pengenceran hingga 104. Setelah pengenceran dilakukan pour plate menggunakan media MRS agar (Oxoid) yang ditambah dengan kalsium karbonat (CaCO3) sebanyak 1% kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Koloni bakteri yang membentuk clear zone kemudian dipurifikasi dengan metode streak plate. Isolat hasil purifikasi diisolasi dan disimpan dalam media MRS agar miring.
Pengujian Karakter Bakteri Asam Laktat
Isolat bakteri yang diperoleh dikarakterisasi menggunakan beberapa uji, yaitu pewarnaan Gram
dan endospora mengacu pada prosedur yang dilakukan oleh Jutono et al. (1980), uji katalase dan uji motilitas mengacu pada prosedur yang dilakukan oleh Asri dan Trimulyono (2011).
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Bakteri Asam Laktat
Pada penelitian ini, sampel toak pada saat perlakuan dibuat seri pengenceran kemudian di-pour plate menggunakan media MRS agar yang telah ditambah CaCO3 sebanyak 1%. Hasil pour
plate pengujian sampel toak diperoleh data
mengenai jumlah bakteri dalam toak yang diteliti, yaitu sebanyak 5 x 103 CFU/ml. Deteksi awal koloni BAL adalah dengan melihat clear zone yang terbentuk disekitar koloni. Isolasi awal bakteri pada sampel toak memperoleh 9 isolat bakteri yang diduga sebagai BAL. Kesembilan isolat yang diisolasi memiliki bentuk batang. Isolat bakteri yang berhasil diisolasi seperti ditunjukkan pada Tabel 1 di bawah ini.
Tabel 1. Isolat Bakteri Hasil Isolasi dari Sampel Toak NO ISOLAT BENTUK 1. I.1 Batang 2. I.2 Batang 3. I.3 Batang 4. I.4 Batang 5. I.5 Batang 6. I.6 Batang 7. I.7 Batang 8. I.8 Batang 9. I.9 Batang
Kesembilan isolat yang diperoleh kemudian diuji konfirmasi dengan pewarnaan Gram, uji katalase, uji motilitas, dan pewarnaan endospora. Pewarnaan Gram dan uji Gram dilakukan untuk mengetahui isolat bakteri yang diperoleh termasuk golongan bakteri Gram positif atau Gram negatif. Menurut Jutono et al. (1980), setelah diwarnai dengan pewarnaan Gram, bakteri Gram positif akan berwarna ungu sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah pada saat diamati menggunakan mikroskop. setelah pewarnaan Gram. Untuk lebih memperkuat hasil pewarnaan Gram maka dilakukan uji Gram yaitu dengan menggunakan KOH 3%, bakteri Gram positif ketika ditetesi dengan larutan KOH tidak akan membentuk lendir. Menurut Purwohadisantoso et al. (2009), bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang lebih resisten terhadap KOH sehingga tidak pecah dan DNA bakteri tetap berada di dalam sel. Sebaliknya, dinding sel bakteri Gram negatif lebih sensitif dan tidak tahan terhadap KOH sehingga dinding sel bakteri akan pecah dan DNA dikeluarkan dan terlihat seperti lendir pada saat uji Gram. Hasil pewarnaan Gram dan uji Gram seperti terlihat pada Tabel 2, sedangkan penampakan sel bakteri pada
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013 – ISSN:978-979-028-573-6
saat pewarnaan Gram seperti diperlihatkan pada Gambar 1.
Tabel 2. Hasil Pewarnaan Gram dan Uji Gram ISOLA T PEWARNA AN GRAM UJI GRAM HASIL I.1 Merah Berlendir Negatif
I.2 Ungu Tidak
berlendir Positif
I.3 Ungu Tidak
berlendir Positif
I.4 Merah Berlendir Negatif
I.5 Ungu Tidak
berlendir Positif
I.6 Merah Berlendir Negatif
I.7 Merah Berlendir Negatif
I.8 Ungu Tidak
berlendir Positif I.9 Merah Berlendir Negatif
Gambar 1. Pewarnaan Gram Isolat I.5 dan I.8 (perbesaran 1000x).
Berdasarkan hasil pewarnaan Gram dan uji Gram terlihat bahwa dari 9 isolat bakteri yang berhasil diisolasi dan diduga sebagai BAL, hanya isolat I.2, I.3, I.5, dan I.8 yang memperlihatkan karakter Gram positif sesuai dengan karakter golongan bakteri asam laktat (Axelsson, 1998), sehingga keempat isolat tersebut diuji lebih lanjut dengan uji katalase. Uji katalase dilakukan untuk mengetahui bakteri yang dapat menghasilkan enzim katalase. Uji ini dilakukan dengan cara meneteskan larutan hidrogen peroksida (H2O2) 3% pada biakan bakteri yang telah diletakkan di atas kaca benda. Jika bakteri memproduksi enzim katalase maka akan muncul gelembung gas yang berasal dari penguraian hidrogen peroksida oleh enzim katalase menjadi H2O dan gas O2. Bakteri asam laktat termasuk bakteri katalase negatif sehingga uji katalase pada isolat BAL tidak akan memperlihatkan terbentuknya gas (Axelsson, 1998). Hasil uji katalase keempat isolat bakteri tersebut seperti yang diperlihatkan pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil Uji Katalase ISOLAT KATALASE
I.2 Negatif I.3 Negatif
I.5 Negatif I.8 Negatif
Keempat isolat yang diduga BAL selanjutnya di uji konfirmasi dengan uji motilitas dan pewarnaan endospora. Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang nonmotil dan tidak membentuk endospora (Axelsson, 1998). Hasil uji motilitas dan pewarnaan endospora seperti diperlihatkan pada Tabel 4.
Tabel 4. Hasil Uji Motilitas dan Pewarnaan Endospora
ISOLAT MOTILITAS ENDOSPORA
I.2 Negatif Negatif
I.3 Negatif Negatif
I.5 Negatif Negatif
I.8 Negatif Negatif
Hasil uji konfirmasi BAL menunjukkan bahwa keempat isolat yaitu I.2, I.3, I.5, dan I.8 merupakan BAL jika dilihat dari karakternya yang merupakan bakteri Gram positif, katalase negatif, nonmotil, dan tidak membentuk endospora. Menurut Santoso (2008), bakteri asam laktat adalah bakteri yang memproduksi asam laktat dari proses fermentasi karbohidrat, Gram positif, memiliki katalase negatif, non motil, dan tidak membentuk endospora. Keseluruhan karakter hasil penelitian dari keempat isolat BAL seperti diperlihatkan pada Tabel 5.
Tabel 5. Karakter Isolat BAL Hasil Isolasi Sampel Toak ISO LAT BEN TUK GR AM KATA LASE MOTIL ITAS ENDOS PORA I.2 Bata ng + - - - I.3 Bata ng + - - - I.5 Bata ng + - - - I.8 Bata ng + - - -
Bakteri asam laktat memiliki bentuk batang, Gram positif, katalase negatif, dan tidak menghasilkan gas tergolong ke dalam bakteri asam laktat anggota genus Lactobacillus yang homofermentatif (Suryani et al., 2010; Savadogo et
al., 2006). Dalam penelitian ini belum dilakukan uji
pembentukan gas dari fermentasi karbohidrat, namun demikian jika dilihat dari beberapa karakter terutama bentuk BAL yang berhasil diisolasi diduga isolat yang diperoleh termasuk anggota genus Lactobacillus.
Menurut Ristiarini et al. (2000), pada tahap awal fermentasi nira siwalan bakteri yang tumbuh adalah bakteri Gram positif yang jumlahnya semakin meningkat selama fermentasi
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013 – ISSN:978-979-028-573-6
berlangsung 24 jam sampai 36 jam. Bakteri asam laktat merupakan bakteri Gram positif yang dapat ditemukan pada palm wine (Kadere dan Kutima, 2012; Matthias et al., 2009), BAL seperti
Lactobacillus, Leuconostoc, dan Streptococcus
merupakan bakteri yang biasa ditemukan pada palm
wine (Chandrasekar et al., 2012). Rittiplang et al.
(2007), berhasil mengisolasi BAL dari kultur starter untuk pembuatan minuman fermentasi (traditional
rice wine) Loog-Pang yang diidentifikasi sebagai Pediococcus spp., Lactobacillus spp. dan Lactococcus spp.
Kesimpulan
Isolasi bakteri asam laktat menggunakan sampel toak dari Tuban Jawa Timur telah berhasil memperoleh 4 isolat BAL yang memiliki karakter berbentuk batang, Gram positif, Katalase negatif, nonmotil, dan tidak membentuk endospora. Hasil isolasi ini menujukkan bahwa BAL turut berperan dalam fermentasi pembuatan toak.
DAFTAR PUSTAKA
Asri, M. T. & G. Trimulyono. 2011. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Dasar. Jurusan Biologi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Negeri Surabaya.
Axelsson, L. 1998. Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. In S. Salminen & A.V. Wright, eds. Lactic
Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects. Second Edition.
Marcel Dekker, Inc. New York.
Chandrasekhar K., S. Sreevani, P. Seshapani, & J. Pramodhakumari. 2012. Original Article: A Review on palm wine.
International Journal of Research in Biological Sciences Universal Research Publications 2 (1): 33-38. ISSN 2249–
9687. http://www.urpjournals.com. Jutono, J. Soedarsono, S. Hartadi, S. Kabirun S., D.
Suhadi, & Soesanto. 1980. Pedoman
Praktikum Mikrobiologi Umum Untuk Perguruan Tinggi. Departemen
Mikrobiologi. Fakultas Pertanian. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Kadere T. T. & P. M. Kutima. 2012. Isolation and
Identification of Lactic Acid Bacteria in Coconut Toddy (Mnazi). Journal of
Asian Scientific Research, Vol. 2, No.
12, pp. 807-819.
Matthias A. E., S. Freiding & R. F. Vogel. 2009.
Leuconostoc palmae sp. nov., a novel
lactic acid bacterium isolated from palm wine. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (59): 943–947.
Ouwehand A.C. 1998. Antimicrobial Components from Lactic Acid Bacteria. In S.
Salminen & A.V. Wright, eds. Lactic
Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects. Second Edition.
Marcel Dekker, Inc. New York.
Purwohadisantoso K., E. Zubaidah, & E. Saparianti. 2009. Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Sayur Kubis yang Memiliki Kemampuan Penghambatan Bakteri Patogen (Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Escherichia coli, dan Salmonella thypimurium). Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 10 No. 1
(April 2009) 19 – 27.
Ristiarini S., I. Kuswardani, M. I. L. Adikaryo & M. Wahyuni. 2001. Pola Suksesi Mikroflora Alami pada Fermentasi Nira Siwalan dan Pemanfaatannya dalam Minuman Fermentasi. Biota Vol. VI (1): 1-8, Februari 2001. ISSN 0853-8670. Rittiplang J., P. Laopaiboon, K. Vichitpan & P.
Danvirutai. 2007. Lactic acid bacteria from indigeneous Loog-Pang samples of Northeastern Thailand and their lactic acid production ability Thai Journal of
Biotechnology, July 2007, p. 44-48.
Rouse, S., F. Sun, A. Vaughan & D.V. Sinderen. 2007. High-Throughput Isolation of Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria, with Potential Application in the Brewing Industry. Journal of The
Institute of Brewing. 113 (3): 256–262.
Santoso E. 2008. Bakteri Asam Laktat (BAL) pada Cumi-cumi Kering Asin dan Aktivitas Penghambatannya Terhadap Bakteri Patogen dan Bakteri Pembusuk.
Agroteksos Vol. 18 No. 1-3, Desember 2008.
Savadogo A., Ouattara C.A.T., Bassole I.H.N., Traore S.A. 2006. Review: Bacteriocins and lactic acid bacteria.
African Journal of Biotechnology. 5
(9): 678-683.
Suryani Y., Astuti, B. Oktavia & S. Umniyati. 2010. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Limbah Kotoran Ayam Sebagai Agensi Probiotik dan Enzim Kolesterol Reduktase. Prosiding Seminar
Nasional Biologi 3 Juli 2010. Biologi dan Pengembangan Profesi Pendidik Biologi. ISBN : 978-602-97298-0-1
Wibowo, D & Ristanto. 1988. Petunjuk Khusus
Deteksi Mikrobia Pangan. Proyek
Pengembangan Pusat Fasilitas Bersama Antar Universitas. PAU Pangan dan Gizi. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Wongsuttichote, K., & S. Nitisinprasert. 2009. Identification of Antimicrobial Substance Producing Lactic Acid Bacteria Isolate KUB-KJ174 and Its
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013 – ISSN:978-979-028-573-6
Application as a Biopreservative Substance for Bakery Products.
Kasetsart journal: Natural science.
43(4): 796 – 807.
Yang, Z. 2000. Antimicrobial Compounds and
Extracellular Polysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria: Structures and Properties. Academic Dissertation.
Department of Food Technology, Faculty of Agriculture and Forestry of the University of Helsinki.
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013 – ISSN:978-979-028-573-6
Surabaya, 19 Januari 2013