pada suhu 4oC. Kemudian dimasukkan 70% etanol 1
ml dan 3 M sodium asetat sebanyak 100 μl dan dilakukan sentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 15.000 g (rcf) pada suhu 4oC.
Setelah itu, supernatant dibuang perlahan
dan pellet dikeringkan dengan membalikkan tabung diatas tissue selama 15 menit dan sisa larutan dapat diserap perlahan dengan menggunakan potongan
tissue steril. Selanjutnya, dimasukkan TE buffer 20 μl dan larutan DNA ditapping sampai larut lalu dispindown dengan menggunakan sentrifugator selama 1 detik. Setelah didapatkan DNA hasil isolasi total komunitas bakteri.
C. PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk DGGE
PCR untuk DGGE menggunakan primer dengan GC clamb yaitu 341F-GC dan 518R. Kondisi
PCR yaitu initial denaturation pada suhu 94 oC
selama 5 menit, kemudian melting selama 30 detik
pada suhu 94 oC, annealing selama 30 detik pada
suhu 50 oC, entention pada suhu 72 oC diikuti oleh 10 menit final extention 72 oC dan pendinginan selama 5 menit pada suhu 4 oC(Otsuka et al, 2007). Produk PCR kemudian dicek dalam 1,5 gel agarose
D. DGGE
Proses DGGE ini bertujuan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran sama namun memiliki urutan nukleotida yang berbeda sehingga didapatkan pita DNA bakteri murni yang terpisah dari total komunitas bakteri. Pertama-tama, cetakan gel yang masing-masing terdiri dari 2 buah gel clamps, spacers (1 mm) dan glass plates (16 x 16 cm dan 16 x 14 cm) disusun setelah dibersihkan dengan etanol 70%. Gel DGGE dibuat dengan denaturing gradient
40%-60% (100 % denaturan terdiri dari 7 M
urea ditambah 40 % vol/vol formamide). Selanjutnya masing-masing sebanyak 17 ml dari setiap denaturing solution dimasukkan ke dalam
syringe pada gradient maker yang dialirkan
melalui selang ke dalam cetakan gel, kemudian roda pada gradient maker diputar perlahan untuk membuat gradient pada gel. Gel tersebut dibiarkan memadat overnight. Selanjutnya 7 liter TAE buffer 0,5x disiapkan dan dimasukkan ke dalam chamber. Lalu buffer tersebut dipanaskan
di dalam tank pada suhu 60oC selama 2 jam. Gel
di dalam cetakan dimasukkan ke dalam tank elektroforesis, lalu sampel hasil PCR dimasukkan
ke dalam sumur pada gel, masing-masing sebanyak 20 μl. Alat elektroforesis tersebut disambungkan ke power supply dan dilakukan
running selama 5 jam dan 150 Volt. Kemudian
gel diwarnai menggunakan 10 mg/mL ethidium bromide selama 20 menit dan dibilas dengan TAE buffer 1x selama 10 menit. Setelah itu, gel diamati dibawah UV transilluminator lalu difoto.
E. HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA dan Amplifikasi Gen Pengkode 16S rRNA
Isolasi DNA dari total komunitas bakteri di dalam biofilm pada perlakuan dengan menggunakan kolom sebagai model dalam proses biostimulasi, dilakukan dengan menggunakan soil Kit. Sol kit terdiri dari empat macam larutan yang merupakan empat prinsip dasar isolasi DNA. Proses lisis sel menggunakan larutan yang mengandung SDS yaitu sejenis deterjen yang berfungsi untuk merusak membran sel dengan cara menghilangkan molekul lipid. Tahap selanjutnya adalah purifikasi sebagai pemurnian untuk menghilangkan protein dan senyawa lainnya. Presipitasi dilakukan untuk mengendapkan DNA dengan teknik sentrifugasi yang dapat memisahkan kotoran akibat lisis sel dan purifikasi dengn cara memisahkan DNA dari substansi lainnya berdasarkan berat jenis molekul dengan teknik sentrifugal.
Selanjutnya adalah tahap pencucian yang menggunakan kloroform dan etanol 70% untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari dalam larutan sehingga didapatkan DNA murni berupa endapan yang tidak berwarna di dasar tabung.
Hasil isolasi DNA yang telah dideteksi dengan elektroforesis lalu diamplifikasi pada daerah gen pengkode 16S rRNA dimana hasil yang positif menunjukkan ukuran fragmen DNA sebesar ± 200 bp. Daerah diamplifikasi dengan menggunakan primer forward yang mengandung GC Clamp. Tambahan 40 bp GC pada proses PCR digunakan untuk meningkatkan jumlah amplikon yang dapat dipisahkan pada proses DGGE (Sheffield dkk., 1989). Hasil amplifikasi kemudian divisualisasikan pada gel agarosa 1.5% yang ditampilkan pada Gambar 1.
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013 – ISSN:978-979-028-573-6
Surabaya, 19 Januari 2013
195
Gambar 2 Hasil PCR total bakteri pada kolom (M) DNA ladder 100 bp,1 (K+) control positif (1) Bakteri tabung
1, (2) bakteri tabung 2, (3) Kontrol steril, (4) Kontrol non steril (5) bakteri tabung 5, (6) bakteri tabung 6, (7) bakteri tabung 7,(8) bakteri tabung 8, (9) bakteri tabung 9, (10) bakteri tabung 10
Deteksi Komunitas pada Kolom Menggunakan teknik DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis)
Profil DGGE menunjukkan bahwa dari satu campuran hasil PCR daerah gen pengkode 16S rRNA dari total komunitas bakteri, dapat memisahkan berbagai bakteri yang berbeda urutan nukleotidanya. Profil DGGE pada kolom setelah 30 hari menunjukkan bahwa pada total komunitas pada tiap-tiap kolom perlakuan tampak berbeda (gambar 2). Profil pita DGGE selama pengayaan bakteri yang
diberikan penambahan biofertilizer berbeda dengan profil pita DGGE tanpa biofertilizer dan juga berbeda. Terlihat pada kolom ke 3 yang merupakan kolom kontrol steril tampak hanya ada 2 pita (band) yang tipis. Hal ini menunjukkan pada kolom tersebut komunitas bakterinya hanya sedikit bila dibandingkan dengan kolom perlakuan. Pada keseluruhan profil ini dapat dilihat ada pita yang lebih tebal dibandingkan dengan pita yang lain yang mengindikasikan bahwa bakteri ini dominan dalam komunitas tersebut, yaitu pada kolom 6,7,8,9,dan 10. Penambahan
500 bp 1000 bp 200 bp a b c d e 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1500 bp
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013 – ISSN:978-979-028-573-6
Gambar 3. Profil DGGE pada kolom 1-10. 1 KNO3, 2NH4NO3, 3Kontrol steril, 4 Kontrol non steril, 5 Osmocoat 6 Super IB, 7 Hi Control, 8 Sumicoat, 9 Chitosan + kitin, 10 Uric acid, a,b,c,d, dan e merupakan band dari bakteri yang dominan pada perlakuan penambahan biofertilizer.
Dari profil DGGE, terlihat bahwa komunitas bakteri pendegradasi pada tiap-tiap perlakuan menunjukkan adanya perbedaan.
Non-slow realease fertilizer yaitu KNO3, 2NH4NO3 tidak efektif untuk pertumbuhan bakteri dalam jangka waktu yang lama. Ada kemungkinan
fertilizer tersebut wash out ketika sistem hidrolik
untuk aerasi ini berjalan selama 21 hari. Pada kontrol steril yaitu kolom 3, tampak komunitas bakteri sedikit, sedangkan pada kolom 4 sebagai kontrol non steril tampak adanya komunitas bakteri akan tetapi tidak tampak adanya bakteri yang dominan. Begitu pula pada kolom pada kolom 5 tidak tampak adanya bakteri yang dominan. Pada kolom 6 dan 7 tampak adanya bakteri yang dominan akan tetapi berbeda jenis, sedangkan pada kolom 8,9 dan 10 tampak adanya bakteri dominan yang sama. Pada profil DGGE membuktikan bahwa penambahan fertilizer yang mengandung nitrogen dan fosfat ke dalam laut yang terkontaminasi minyak sangat dibutuhkan untuk menstimulasi proses biodegradasi minyak (Prince dalam Iwabuhi dkk., 2002).
Profil DGGE juga menunjukkan bahwa pada metode tanpa kultur, lebih banyak mikroba yang dapat terdeteksi. Metode kultur pada penelitian ini dapat digunakan sebagai pembanding dari jenis bakteri yang dapat mendegradasi minyak bumi. Metode tanpa kultur memiliki tingkat bias yang rendah dan tingkat kekayaan komunitas bakteri yang lebih tinggi dibandingkan dengan metode kultur. Karena pada metode kultur, mengharuskan bakteri untuk tumbuh pada medium padat yang mengarah ke isolasi pada medium lempeng untuk pertumbuhan sub populasi dari suatu komunitas. Metode tanpa kultur dapat mendeteksi spesies yang tidak terdeteksi dengan pembiakan
Alcanivorax merupakan bakteri yang
dominan di dalam lingkungan air laut yang terkontaminasi minyak ketika ditambahkan nutrisi (Harayama et. al, 2004). Menurut Kalscheuer et al.,(2007), starvation jangka panjang, setelah 99% populasi bakteri menurun, Alcanivorax
borkumensis justru memiliki jumlah populasi stabil
dan dapat bertahan yang menunjukkan bahwa
Alcanivorax borkumensis memiliki kemampuan
adaptasi yang tinggi terhadap lingkungannya.
Untuk mengindentifikasi jenis-jenis bakteri yang terlibat dalam degradasi minyak bumi dalam penelitian ini diperlukan uji lanjut yaitu pemotongan gel, purifikasi gel dan ekstraksi dna
pada gel, kemudian dilakukan sequencing sehingga didapatkan nama jenis bakteri pendegradasi minyak bumi.
Kesimpulan dari penelitian ini yaitu dengan menggunakan metode DGGE komunitas bakteri yang berperan dalam proses biostimulasi dapat dilihat secara kualitatif.
Ucapan Terimakasih
Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Dr. I Made Sudiana, Mia Kusmiati, yang telah memberikan kontribusi yang besar selama penelitian
DAFTAR PUSTAKA
Darmayati Y, Harayama S, Yamazoe A, Hatmanti A, Sulistiani, Nuchsin R, Kunarso DH. 2008.
Hydrocabonoclastic Bacteria from Jakarta Bay and Seribu Island. Marine Research in Indonesia. 33:
55-64
Harayama S, Kasai Y, Hara A. 2004. Microbal communities in oil-contaminated seawater. Curr
Opin Biotechnol 15:205-214
Iwabuhi, N., Michio, S., Makoto, U., Chiaki, I., Hiroshi, A., Mutsuyasu, N., & Shigeaki, H. 2002. Extracellular Polysaccharides of Rhodococcus
rhodochrous S-2 Stimulated the Degradation of
Aromatic Components in Crude Oi by Indigenous Marine Bacteria. Applied and Environmental
Microbiology. 68 (5): 2337-2343.
Muyzer G, Hottentrager S, Teske A, Wawer C. 1995. Denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA—a new molecular approach to analyse the genetic diversity of mixed microbial communities. Molecular microbial
ecology manual. Dordrecht, The Netherlands:
Kluwer Academic Publishers; . pp. 1–23.
Otsuka, S., I Made, S., Aiichiro, K., Kazuo, I., Shin, D., Masay, N., Hideyuki, S., & Keishi, S. 2008. Community Structure of Soil Bacteria in a Tropical Rainforest Several Years After Fire. Microbes
Environ. 23(1): 49-56.
Kalscheuer, R, Tim. S, Ursula M, Rudolf R. Peter N.G, Julia S.S, Manuel F. 2007. Analysis of Storage Lipid Accumulation in Alcanivorax
borkumensis: Evidence for Alternatif Biosynthesis
Routes in Bacteria. Journal Bacteriol. 189 (3): 918-928
Kasai, Yuki, Hideo Kishira, dan Shigeaki Harayama. 2002. “Bacteria Belonging to the Genus
Cycloclasticus Play a Primary Role in the
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013 – ISSN:978-979-028-573-6
a Marine Environment”. Applied and
Environmental Microbiology, Hal: 5625–5633.
Sheffield V C, Cox D R, Lerman L S, Myers R M. 1989. Attachment of a 40-base pair G+C-rich sequence (GC-clamp) to genomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of single-base changes. Proc
Natl Acad Sci 86:232–236.
Van Hamme JD, Singh A, Ward OP. 2003. Recent advances in petroleum microbiology. Microbiol
Mol Biol Rev 67:503-549
Yakimov MM et al. 1998. Alcanivorax
borkumensis gen. nov., sp. nov., a new,
hydrocarbon-degrading and surfactant-producing marine bacterium. J Sys Bacteriol 48:339-3
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013- ISBN: 978-979-028-573-6