BAKTERI PENGHIDROLISIS METHYL SIANIDA YANG
DIISOLASI DARI BERBAGAI LIMBAH INDUSTRI DAN
TANAH TERCEMAR
Nunik Sulistinah dan Rini RiffianiBidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi-LIPI Cibinong Science Center, Jl Raya Jakarta-Bogor km 46 Cibinong
E-mail : listin_ar @yahoo.com Abstrak – Dalam kegiatan penelitian ini diuji
kemampuan 8 isolat bakteri dan 5 konsorsia bakteri yang diisolasi dari berbagai limbah dalam mendegradasi methyl sianida. Satu diantara 13 isolat yang diuji , yaitu isolat bakteri ASP yang teridentifikasi sebagai Flavobacterium sp ASP mampu tumbuh dan menggunakan senyawa methyl sianida (380 mM) tersebut sebagai satu-satunya sumber karbon dan nitrogen sebagai substrat pertumbuhannya. Laju pertumbuhan spesifik (µ) dari isolat bakteri tersebut yaitu adalah 0,22 h-1. Amonium yang terdeteksi merupakan indikasi bahwa Flavobacterium sp. ASP mampu mensintesis enzim penghidrolisis methyl sianida. Dengan demikian isolat tersebut mempunyai peluang sebagai bakteri penghidrolisis methyl sianida. Hidrolisis methyl sianida (380 mM) dengan sel Flavobacterium sp ASP selama 180 menit, menghasilkan amonium sebesar ± 345 mM
Keyword: methyl sianida, hidrolisis, Flavobacterium sp ASP, enzim pendegradasi nitril
I. PENDAHULUAN
Methyl sianida/sianomethan merupakan salah satu senyawa nitril alifatik yang paling sederhana. Senyawa ini banyak digunakan di industri-industri dan laboratorium sebagai pelarut untuk senyawa-senyawa organik dan berbagai polimer. Gugus sianida (CN) yang melekat pada struktur molekul senyawa tersebut membuat senyawa ini toksik dan bahkan diantaranya bersifat karsinogenik.Sebagian besar senyawa nitril merupakan senyawa hidropobik yang toksik dan bahkan beberapa diantaranya sulit untuk didegradasi (Sorokin et al., 2007), seperti misalnya, benzonitril, mandelonitril yang tergolong dalam nitril aromatik, dilaporkan sangat toksik dan sulit didegradasi oleh mikroba.
Aktivitas industri di Indonesia dari tahun ke tahun menunjukkan peningkatan, dengan demikian potensi senyawa nitril atau sianida sebagai pencemar lingkungan juga semakin meningkat. Penggunaan senyawa toksik tersebut secara ekstensif dilaporkan dapat menimbulkan masalah-masalah lingkungan (Rezende et al., 1999). Oleh karena itu pemantauan keberadaan senyawa toksik ini perlu dilakukan. Dilaporkan degradasi senyawa nitril atau sianida menggunakan aktivitas mikroba merupakan salah satu solusi yang
efisien untuk meminimalisasi atau mendetoksifikasi senyawa tersebut dari lingkungan, karena lebih aman bagi lingkungan.
Pemanfaatan mikroba yang mampu memproduksi enzim pendegradasi/penghidrolisis nitril telah berkembang pesat dan sangat mendapat perhatian oleh karena enzim-enzim tersebut sangat potensial dikembangkan sebagai biokatalis dan dapat digunakan untuk sintesis senyawa-senyawa organik secara enansioselektif, serta sebagai agent bioremediasi lingkungan (Blakey et al., 1995; Banerjee et al., 2002; Håkansson et al., 2005; Kohyama et al., 2006; Manolov et al., 2005 ). Telah banyak laporan yang menunjukkan bahwa beberapa mikroba mampu menghidrolisis senyawa nitril menjadi senyawa asam karboksilat yang mempunyai nilai ekonomi tinggi.
Kegiatan penelitian ini bertujuan mengkaji kemampuan isolat-isolat bakteri yang diisolasi dari berbagai limbah dan tanah yang diduga tercemar dalam mendegradasi atau menghidrolisis senyawa methyl sianida. Diharapkan dari kegiatan ini diperoleh paling tidak satu isolat yang potensial sebagai mikroba penghidrolisis nitril.
II. BAHAN DAN METODE
Bahan Kimia. Senyawa methyl sianida merupakan salah satu senyawa nitril alifatik paling sederhana, diperoleh dari Merck dengan kemurnian 99%. Senyawa ini digunakan sebagai sumber karbon dan nitrogen untuk pertumbuhan isolat uji. Mikroba penghidrolisis/pendegradasi methyl sianida. 8 isolat bakteri dan 5 konsorsia bakteri yang digunakan dalam penelitian ini diisolasi dari limbah kilang minyak Sungai Gerong, Plaju-Palembang, limbah pertamina, limbah batik Cirebon, limbah industri PT. SIER (Surabaya Industrial Estate Rungkut) , tanah di area Tangkuban Perahu-Bandung dan tanah yang diduga tercemar limbah pengolahan emas di Halmahera Media tumbuh. Media yang digunakan sebagai medium tumbuh isolat adalah media mineral (Meyer & Schlegel, 1983; Pfennig, 1974).
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013- ISBN: 978-979-028-573-6
Pertumbuhan isolat terpilih. Pengujian pertumbuhan isolat terpilih dilakukan dalam Erlenmeyer (volume 1000 ml) berisi 500 ml media pertumbuhan dan kemudian disterilkan pada suhu 121 oC selama 15 menit. Sebagai sumber karbon dan nitrogen ditambahkan methyl sianida dengan konsentrasi 190-380 mM dan diinokulasi dengan 4 % (v/v) inokulan isolat terpilih yang tumbuh pada fase eksponesial. Selanjutnya kultur diinkubasi di atas mesin pengocok (shaker) pada suhu ruang (± 28 oC) selama ± 72 jam. Pengambilan sampel dilakukan setiap 3 jam, untuk pengamatan pertumbuhan, pH, dan amonium (NH4+) yang merupakan produk hidrolisis.
Biomassa dan deteksi amonium sebagai produk hidrolisis. Biomassa sel diproduksi dalam bejana erlenmeyer (3 liter) berisi 1,5 liter media tumbuh yang mengandung methyl sianida. Kultur diinkubasi pada suhu kamar (± 28 oC) dan dipanen pada waktu produksi sel optimum (±72 jam). Sel dipanen dengan sentrifuse (10.000 rpm) pada suhu 4 o C selama 15 menit. Pelet yang diperoleh dicuci dengan 50 mM bufer fosfat pH 7,2 sebanyak 2-3 kali. Pelet yang diperoleh digunakan untuk karakterisasi enzim dalam sel utuh.
Amonium sebagai produk hidrolisis senyawa methyl sianida ditentukan secara kolorimetris dengan menggunakan metode Nessler yaitu sebagai berikut : supernatan sampel (2 µL) ditambahkan ke dalamnya 198 µL 0,1N NaOH, kemudian ke dalam larutan tersebut ditambahkan pereaksi Nessler B dan A masing-masing 2 µL, dihomogenkan dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu ruang. Larutan tersebut selanjutnya diukur pada panjang gelombang 420 nm. Kosentrasi ammonium dalam sampel dihitung berdasarkan kurva standar.
Hidrolisis methyl sianida dengan sel
Flavobacterium sp ASP. Sebanyak 2% (b/v) sel
ditambahkan ke dalam 50 mM bufer fosfat KH2PO4 (pH 7,2), berisi 380 mM methyl sianida. Larutan kemudian diinkubasi di atas mesin pengocok, pada suhu ruang (± 28 oC). Dalam interval waktu tertentu (0, 5, 10, 15, 30, 60,90, 120, 150 dan 180 menit) sampel diambil dan kandungan amonium ditentukan.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Dalam kegiatan penelitian ini diuji kemampuan 8 isolat bakteri dan 5 konsorsia bakteri dalam menghidrolisis senyawa methyl sianida (Tabel 1). Pengujian tahap awal, dilakukan uji penapisan dengan menggunakan indikator INT (Iodonitrotetrazolium). Hasil pengujian, menunjukkan, bahwa 6 diantara 13 isolat uji menunjukkan reaksi positif yang ditandai dengan adanya perubahan warna kultur menjadi pink (Tabel 2). Perubahan warna menjadi pink mengindikasikan pertumbuhan isolat. Demikian
juga dengan uji aktivitas, aktivitas yang tinggi ditandai dengan terbentuknya warna kuning tua hingga kecoklatan. Uji konfirmasi dilakukan terhadap isolat bakteri yang menunjukkan reaksi positif untuk diuji kemampuan tumbuhnya pada media mineral yang mengandung methyl sianida. Hasilnya, menunjukkan bahwa 2 diantara 6 isolat yaitu isolat bakteri ASP dan konsorsia bakteri K2 mampu tumbuh dengan baik dan menggunakan senyawa uji tersebut sebagai satu-satunya sumber karbon, energi, dan nitrogen. Kemampuan tumbuh isolat bakteri ASP lebih baik dibandingkan konsorsia bakteri K2. Isolat bakteri ASP mampu tumbuh pada methyl sianida hingga konsentrasi 380 mM, sedangkan konsorsia bakteri K2 hanya mampu tumbuh pada konsentrasi yang lebih rendah yaitu 190 mM. Isolat bakteri ASP yang teridentifikasi sebagai Flavobacterium sp. ASP mempunyai pola pertumbuhan yang hampir sama apabila isolat tersebut ditumbuhkan pada methyl sianida dengan konsentrasi 190-380 mM (Gambar 2). Untuk itu isolat bakteri ASP dipilih untuk dikaji lebih lanjut kemampuannya dalam menghidrolisis methyl sianida.
Seperti terlihat dalam Gambar 2, bahwa pertumbuhan isolat diawali dengan fase lag yang relatif cukup panjang yaitu selama ± 12 jam. Pada fase ini pertumbuhan mikroba sangat lambat oleh karena masih beradaptasi dengan substrat tumbuhnya. Penurunan pH kemungkinan karena senyawa methyl sianida mulai terhidrolisis menjadi methankarboksiamida dan selanjutnya amida yang terbentuk akan diubah menjadi methana asam karboksilat dan amonium,
Tabel 1. Delapan isolat bakteri uji dan 5 konsorsia bakteri
No. Kode
isolat uji Asal
1 ASP Limbah kilang minyak Sungai Gerong
Plaju-Palembang 2 AHBZ1 Tanah tercemar merkuri di
pengolahan emas - Halmahera 3 AHBZ2 Tanah tercemar merkuri di
pengolahan emas - Halmahera 4 BHBZ Limbah padat di dekat
pengolahan emas - Halmahera 5 DHAS1 Tanah tercemar sianida di
pengolahan emas - Halmahera 6 DHAS2 Tanah tercemar sianida di
pengolahan emas - Halmahera 7 TPAS Tanah Tangkuban Perahu -
Bandung 8 TPM Tanah sumber air panas
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013- ISBN: 978-979-028-573-6
Tangkuban Perahu -Bandung 9 K1 Limbah pertamina Cilacap 10 K2 Limbah batik Cirebon
11 K3 Limbah batik Cirebon 12 K4 Limbah Petrosida - Gresik 13 K5 Limbah Industri Rungkut
(SIER)-Surabaya meskipun jumlahnya masih relatif rendah. pH berangsur-angsur mengalami kenaikan dengan meningkatnya kadar amonium.
Sampai saat ini, telah banyak laporan tentang kemampuan bakteri dalam menghidrolisis nitril, baik alifatik maupun aromatik. (Layh et al., 1997; Johnson et al., 2000; Mart´ynkova & Mylerov´a, 2003). Dilaporkan oleh Sunarko et al., 2000,
bahwa, Corynebacterium sp. D5 mempunyai kemampuan tumbuh pada senyawa nitril alifatik (asetonitril) pada konsentrasi yang relatif tinggi, ± 950 mM.
Tabel 2. Pertumbuhan dan aktivitas isolat pada senyawa methyl sianida menggunakan indikator Iodonitrotetrazolium N o Isol at uji Pertum buhan Akti vitas (NH4 ) N o Iso lat uji Pertum buhan Akti vitas (NH4 ) 1 Kon trol - - 2 ASP ++++ +++ 3 AH BZ1 + - 9 TP M - - 4 AH BZ2 ++ + 10 K1 - - 5 BH BZ - - 11 K2 +++ + 6 DH AS1 ++ + 12 K3 - - 7 DH AS2 - - 1 3 K4 - - 8 TP AS +++ + 14 K5 - -
Kemampuan tumbuh isolat terpilih ini lebih rendah dibandingkan Corynebacterium sp. D5, tetapi lebih tinggi bila dibandingkan dengan
Flavobacterium sp. NUB1 yang diisolasi dari
pabrik pupuk Urea di Petrokimia Gresik (Sulistinah, 2002). Meskipun demikian isolat bakteri ASP mempunyai peluang sebagai bakteri penghidrolisis nitril alifatik. Kemampuan mikroba mendegradasi senyawa toksik umumnya dipengaruhi oleh habitat mikroba tersebut, seperti misalnya mikroba yang diisolasi dari buangan industri pengolahan emas, industri kimia, pelapisan
logam mempunyai kemampuan tumbuh yang lebih baik pada senyawa toksik karena mikroba tersebut telah beradaptasi dengan lingkungannya.
Dalam kegiatan penelitian ini produk hidrolisis yang diidentifikasi adalah amonium. Terbentuknya amonium mengindikasikan bahwa enzim pendegradasi methyl sianida yang terlibat dalam proses hidrolisis tersebut bekerja (Sunarko & Sulistinah, 2008). Dilaporkan, bahwa metabolisme senyawa nitril oleh mikroba melalui dua tahapan reaksi yang berbeda dan melibatkan enzim yang berbeda pula. Lintasan reaksi pertama melibatkan 2 enzim, yaitu nitril hidratase dan amidase. Enzim nitril hidratase menghidrolisis nitril menjadi amida, sedangkan enzim amidase menghidrolisis amida menjadi asam karboksilat (Drauz & Waldman, 1995). Methyl sianida 380 mM Waktu (menit)) 0 20 40 60 80 100 120 140 P e rtu m buh an (OD 43 6 n m ) 0,1 1 10 100 Methyl sianida 190 mM
Gambar 1. Pertumbuhan Flavobacterium sp. ASP pada methyl sianida
Hidrolisis senyawa nitril alifatik pada umumnya mengikuti lintasan reaksi pertama. Lintasan reaksi kedua melibatkan satu macam enzim, yaitu nitrilase, yang menghidrolisis nitril langsung menjadi asam karboksilat tanpa membentuk amida (Geronimo & Antoine,1976; Drauz & Waldman, 1995;). Hidrolisis senyawa nitril aromatik umumnya mengikuti lintasan reaksi kedua. Demikian juga yang terjadi pada hidrolisis methyl sianida oleh Flavobacterium sp ASP nampaknya mengikuti lintasan reaksi pertama oleh karena methyl sianida tergolong dalam nitril alifatik.
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013- ISBN: 978-979-028-573-6
Pola pembentukan produk hidrolisis senyawa methyl sianida, yaitu ammonium (NH4+) ditampilkan dalam Gambar 3. Seperti terlihat dalam gambar , selama 180 menit, hidrolisis senyawa methyl sianida (380 mM) menghasilkan amonium sebesar ± 345 mM Waktu (menit) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Am on iu m ( m M ) 0 100 200 300 400 : NH4+
Gambar 3. Amonium yang terbentuk pada proses hidrolisis methyl
sianida
(380 mM) dengan sel Flavobacterium sp. ASP
Meskipun laju pertumbuhan isolat uji ini lebih rendah dibandingkan laju pertumbuhan
Corynebacterium sp. D5, namun nampaknya
aktivitas enzim pendegradasi yang disintesis oleh
Flavobacterium sp ASP mampu menghidrolisis
senyawa methyl sianida.
KESIMPULAN
Isolat bakteri ASP yang diisolasi dari limbah kilang minyak Plaju-Sungai Gerong Palembang, teridentifikasi sebagai Flavobacterium sp. ASP Isolat tersebut mampu tumbuh dan memanfaatkan senyawa methyl sianida sebagai satu-satunya sumber karbon, energi dan nitrogenngan laju pertumbuhan spesifik 0,22 h-1. Selama 180 menit, hidrolisis methyl sianida (380 mM) dengan sel Flavobacterium sp. ASP menghasilkan amonium sebesar 345 mM.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr. Bambang Sunarko atas saran-sarannya. Terima kasih juga disampaikan kepada sdri. Rida, Amelia Wulandari dan Suri Handayani atas keterlibatannya dalam pelaksanaan penelitian. Penelitian ini memperoleh dukungan biaya dari APBN.
DAFTAR PUSTAKA
Banerjee, A., R. Sharma, and U. C. Banerjee. 2002. The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 60:33-44.
Blakey, A.J., J. Colby, E. Williams, and C. O’Reillly. 1995. Regio stereo-specific nitrile hydrolysis by the nitrile hydratase from Rhodococcus AJ270. FEMS Microbiol. Lett. 129 : 57-62
DiGeronimo, MJ. and AD. Antoine.1976. Metabolism of Acetonitrile and Propionitrile by Nocardia rhodochrous LL100-21. Appl. Environ. Microbiol.31 (6) : 900-906.
Drauz, K. & H. Waldmann. 1995. Enzyme Catalysis Synthesis : A Comprehensive Handbook, VCH, Weinheim : 365-367 Håkansson, K., U. Welander, and B. Mattiasson.
2005. Degradation of acetonitrile through a sequence of microbial reactors. Water
Res. 39:648-654.
Johnson, DV., AA. Zabelinskaja-Mackova & H. Griengl. 2000. Oxynitrilases for asymmetric C-C bond formation. Curr. Opin. Chem. Biol 4: 103-109
Layh, N., B. Hirrlinger, A. Stolz & HJ. Knackmuss. 1997. Enrichment strategies for nitrile-hydrolyzing bacteria. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 47 : 668-674
Gambar 2. Pola pertumbuhan, pH, dan konsentrasi ammonium selama pertumbuhan Flavobacterium sp. ASP pada methyl sianida
380 mM Waktu (Jam) 0 20 40 60 80 100 P e rt u m buh an (OD 436 nm ) 0.1 1 10 : Pertumbuhan pH 2 4 6 8 10 : pH Am m o n iu m ( mM ) 0 50 100 150 200 250 : Ammonium
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013- ISBN: 978-979-028-573-6
Kohyama, I., A. Yoshimura, D. Aoshima, T. Yoshida, H. Kawamoto, and T. Nagasawa. 2006. Convenient treatment of acetonitrile-containing wastes using the tandem combination of nitrile hydratase and amidase-producing microorganisms.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:600-606.
Mart´´ynkov'a, L. & V. Mylerov´a. 2003. Synthetic applications of nitrile-converting enzymes. Curr. Org. Chem. 7 : 1279-1295 Meyer, O & Schlegel HG. 1983. Biology of
Aerobic Carbon Monoxide Oxidizing Bacteria. Annual Review Microbiology 37, 277-310
Marison, IW. 1988. Growth Kinetics. Dalam : AH Scragg (Ed). Biotechnology for Engineers. Ellis Horwood
Manolov, T., K. Håkansson, and G. Benoit. 2005. Continuous acetonitrile degradation in a packed-bed bioreactor. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 66:567-574. [PubMed].
Pfennig, N. 1974. Rhodopseudomonas globiformis sp.n., A new species of the Rhodospirillaceae. Arch. Microbiology 100, 197-206
Sorokin, D. Y., S. van Pelt, T. P. Tourova, S. Takaichi, and G. Muyzer. 2007. Acetonitrile degradation under haloalkaline conditions by Natronocella
acetinitrilica gen. nov., sp. nov. Microbiology 153:1157-1164.
Sulistinah, N., B. Sunarko, dan A. Thantowi. 2002. Metabolisme Benzonitril oleh
Flavobacterium sp. NUB1. Jurnal Biologi Indonesia ,Vol. III (3):219-226
Sunarko, B., Adityarini, USF. Tambunan, dan N. Sulistinah. 2000. Isolasi, Seleksi dan Karakterisasi Mikroba Pendegradasi Asetonitril. Berita Biologi 5(2): 177-185 Sunarko, B & N. Sulistinah.2008. Karakterisasi
Enzim Nitril Hidratase dan Amidase dari
Pseudomonas sp. BP3 dalam Biokonversi
Adiponitril menjadi Asam Adipat. Jurnal
Biologi Indonesia Vol.5(2) :173-186
Yamada H. and M. Kobayashi.1996. Nitrile Hydratase and its application to industrial production of Acrylamide. Bioschi.
Prosiding Seminar Nasional Biologi-IPA 2013- ISBN: 978-979-028-573-6